Müze Bilinc

Das 440 crianças originalmente incluídas no estudo (ver seção 5.2), 32

apresentaram o perfil de RFLP heterozigoto para o alelo βS

(protocolo descrito na seção

5.5.1.1) e tiveram o DNA sequenciado para confirmar o genótipo Sβ-tal e identificar a

mutação causadora de talassemia beta. Além disso, as 27 crianças com resultados de testes na triagem neonatal sugestivos de Sβ-tal também tiveram o DNA sequenciado para confirmação do genótipo e identificação da mutação causadora de talassemia beta.

Dois fragmentos contíguos do gene HBB foram sequenciados para identificação das mutações causadoras de talassemia beta heterozigótica associada à Hb S (Figura 10). Para cada amostra, o fragmento 1 (771 pb) foi sequenciado inicialmente e, caso a mutação não fosse identificada, o fragmento 2 (572 pb) era sequenciado. Dessa forma, 100% dos casos tiveram a mutação causadora de talassemia beta identificada. Notar que, até o momento, não há descrição na literatura especializada de mutações patológicas que resultem em beta talassemia nas bases situadas entre os fragmentos 1 e 2, em IVS-II (íntron 2).

Figura 10 - Ilustração do gene da globina beta (HBB), mostrando as regiões sequenciadas para identificação das mutações causadoras de talassemia beta heterozigótica associada à Hb S

5.5.1.15.1 Amplificação do fragmento 1

A amplificação do fragmento 1 do HBB foi feita utilizando 250 ng de DNA genômico como molde numa reação com volume final de 50 L contendo tampão para PCR 1X, 2 mM de MgCl2, 200 M de cada dNTP, 10 pmoles de cada oligonucleotídeo

TTTCTTGCCATGAGCCTTC -3’) e 5 U de Platinum®Taq DNA Polymerase. A reação de amplificação foi feita em termociclador (Veriti, Applied Biosystems; Foster City, CA, USA) com uma fase inicial a 96oC por 4 minutos, seguida de 40 ciclos a 96oC por 30 segundos, 62oC por 30 segundos e 72oC por 60 segundos, mais uma fase de extensão final de 5 minutos a 72oC.

5.5.1.15.2 Amplificação do fragmento 2

A amplificação do fragmento 2 do gene HBB foi feita utilizando 250 ng de DNA genômico como molde numa reação com volume final de 50 L contendo tampão para PCR 1X, 1,5 mM de MgCl2, 200 M de cada dNTP, 10 pmoles de cada

oligonucleotídeo sintético (direto: 5’- TCATGCCTCTTTGCACCATTC -3’; reverso:

5’- GGGAATGTGGGAGGTCAGTG TTTCTTGCCATGAGCCTTC -3’) e 5 U de

Platinum®Taq DNA Polymerase. A reação de amplificação foi feita em termociclador (Veriti, Applied Biosystems; Foster City, CA, USA) com uma fase inicial a 96oC por 4 minutos, seguida de 40 ciclos a 96oC por 30 segundos, 58oC por 30 segundos e 72oC por 60 segundos, mais uma fase de extensão final de 5 minutos a 72oC.

5.5.1.15.3 Purificação do produto do PCR e quantificação do produto purificado

A purificação do produto de PCR foi realizada utilizando kit comercial (kit

NucleoSpin Gel and PCR Clean-up, MACHEREY-NAGEL) de acordo com instruções

do fabricante.

Para a purificação, 45 μL do produto do PCR foram misturados a 90 μL do tampão NTI. A mistura resultante foi adicionada à coluna “NucleoSpin Gel and PCR

Clean-up” contida em tubo coletor de 2 mL. Centrifugou-se a 11.000 x g por 30

segundos e, em seguida, o líquido do tubo coletor foi descartado. Foram adicionados 700 μL do tampão NT3 à coluna. Centrifugou-se a 11.000 x g por 30 segundos e, em seguida, o líquido do tubo coletor foi descartado. O passo anteriormente descrito foi repetido para melhor purificação do DNA. Posteriormente, centrifugou-se a 11.000 x g por 1 minuto para remoção completa do tampão NT3 da coluna. O tubo coletor foi

descartado e a coluna foi incubada a 70°C durante 5 minutos. A coluna foi colocada dentro de um tubo cônico de 1,5 mL e adicionaram-se 30 μL de tampão NE. A coluna foi incubada a temperatura ambiente por 1 minuto e, posteriormente, centrifugada a 11.000 x g por 1 minuto. A coluna foi descartada e o produto da purificação quantificado.

Para quantificação do produto purificado, 4 L do produto adicionado de 0,5 L do tampão de corrida xileno cianol 5X foram aplicados em gel de agarose 1% contendo brometo de etídio (10µg/mL). A eletroforese foi feita a 90 volts, durante 60 minutos em cuba contendo tampão TAE 1X. O gel foi visualizado no sistema de foto documentação sob luz ultravioleta para análise dos fragmentos amplificados. A quantificação foi obtida através da comparação visual da quantidade de DNA no fragmento purificado com a quantidade de DNA dos fragmentos do padrão de peso molecular (Low DNA Mass Ladder, Invitrogen, Carlsbad, CA, USA).

5.5.1.15.4 Reação de sequenciamento

As amostras foram sequenciadas utilizando o método de Sanger. Cerca de 20 ng de produto de PCR purificado para cada 100 pb do fragmento a ser sequenciado (exemplo: ~154 ng para o fragmento 1 de 771 pb), 1 μL do oligonucleotídeo sintético (10 pmoles), 3 μL do tampão de diluição (5X Sequencing Buffer; Applied Biosystems; Foster City, CA, USA), 2 μl de BigDye v3.1 (Applied Biosystems; Foster City, CA, USA) e água para completar um volume final de 20 μL. As reações de sequenciamento foram feitas em termociclador (Veriti, Applied Biosystems ou T100 Thermal Cycler, Bio-Rad)com uma fase inicial a 96oC por 1 minuto, seguida de 35 ciclos a 96oC por 15 segundos, 50oC por 15 segundos e 60oC por 4 minutos. Após o término da reação, as amostras foram mantidas a 4oC.

5.5.1.15.5 Precipitação da reação de sequenciamento

Para precipitação, 90 μL de uma mistura contendo 60 μL de etanol 100%, 3 μL de NaAc 3M e 27 μL de água tipo I foram adicionados ao produto da reação de sequenciamento. A mistura foi incubada a temperatura ambiente por 15 minutos,

homogeneizando-a por inversão a cada 3 minutos. Centrifugou-se a 2.000 x g por 30 minutos e, em seguida, o sobrenadante foi descartado por inversão da placa. Em seguida, 150 μL de etanol 70% mantido a -20°C foram adicionados. Posteriormente, a placa foi homogeneizada por inversão 10 vezes e centrifugada a 2.000 x g por 10 minutos. O sobrenadante foi descartado por inversão e a placa foi centrifugada invertida a 50 x g durante 1 minuto. Foram adicionados 10 μL de formamida (Applied Biosystems; Foster City, CA, USA) em cada poço e a placa homogeneizada vigorosamente por 5 minutos. Posteriormente, a placa foi submetida a temperatura de 95ºC por 5 minutos e, em seguida, colocada no gelo até o início da eletroforese capilar.

5.5.1.15.6 Eletroforese capilar

A eletroforese capilar foi realizada em aparelho ABI3130 (Applied Biosystems; Foster City, CA, USA), utilizando-se polímero POP7 (Applied Biosystems; Foster City, CA, USA) e capilar de 36 ou 48 centímetros (Applied Biosystems; Foster City, CA, USA).

5.5.1.15.7 Análise dos dados

Os dados foram analisados comparando-se a sequencia resultante da reação com a sequência do HBB depositada no GenBank (NG_000007), utilizando o programa Codon Code Aligner (CodonCode Corporation, USA). As mutações foram identificadas consultando as mutações listadas por Thein 2013 (170) e as mutações descritas no Globin Gene Server (http://globin.bx.psu.edu/hemoglobinvar).