Kuran’ın Sünnet ile Tefsiri

A realização de mutagénese dirigida em resíduos específicos da subunidade AioA da arsenito oxidase de Rhizobium NT-26 teve como objetivo a obtenção de diversos mutantes de forma a inferir o efeito das mutações em resíduos alvo, localizados perto do cofator de molibdénio (Moco) e do centro de [3Fe-4S] desta subunidade.

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No presente estudo foram elaborados vários mutantes, nomeadamente D169A/N e E453A/Q. Este procedimento foi realizado inicialmente no laboratório da Professora Joanne Santini, sob a sua orientação, e posteriormente no laboratório de Cristalografia de Proteínas, sob orientação da Professora Teresa Santos-Silva.

O plasmídeo recombinante obtido através da clonagem dos genes aioA e aioB (aioBA), no vetor de expressão pPROEX-HTb (Invitrogen), foi utilizado como molde para mutar os resíduos de interesse: Asp169 e Glu453, pelo método de PCR (do inglês Polymerase Chain Reaction) utilizando o kit de mutagénese dirigida QuikChange® II XL (Aligent).

Para tal, inicialmente foram desenhadas duas sequências complementares de oligonucleótidos que continham as mutações desejadas, para cada um dos mutantes em estudo, encontrando-se as sequências apresentadas na Tabela 3.4.

Tabela 3.4. Sequências de oligonucleótidos utilizadas para a reação de amplificação dos vários mutantes

em estudo. Os codões que codificam aminoácidos para as diferentes mutações encontram-se destacados em cada uma das sequências de oligonucleótidos.

Mutante em estudo Sequência de oligonucleótidos (5’-3’)

AioA D169A _{GCACCGCCATGGGCAAAGGCCGATACG (Reverse)} CGTATCGGCCTTTGCCCATGGCGGTGC (Forward) AioA E453A GGCGGACACCAGGCAGGCTATGTGCG (Forward) _{CGCACATAGCCTGCCTGGTGTCCGCC (Reverse)} AioA D169N CGTATCGGCCTTTAACCATGGCGGTGCAGG (Forward) _{CCTGCACCGCCATGGTTAAAGGCCGATACG (Reverse)} AioA E453Q GGCGGACACCAGCAAGGCTATGTGCGCC (Forward) _{GGCGCACATAGCCTTGCTGGTGTCCGCC (Reverse)}

3.7.1. Reação de amplificação com recurso ao kit QuikChange® II XL

A reação de amplificação, para cada um dos mutantes, foi realizada para um volume final de 25 μL, tendo sido pipetados 19 μL de água Milli-Q, previamente autoclavada, 2,5 μL de

Reaction Buffer 10x (fornecido no kit), 1,5 μL de reagente QuikSolution (fornecido no kit), 0,5 μL

de dNTP mix (fornecido no kit), 10 ng de DNA molde de cadeia dupla, 125 ng de cada um dos

primers (forward e reverse) e por último adicionou-se 0,5 μL de DNA polimerase PfuUltra HF

(2,5 U/µL). De seguida, o programa de amplificação foi realizado num termociclador (Mastercycler personal, Eppendorf), encontrando-se os parâmetros utilizados apresentados na Tabela 3.5.

Tabela 3.5. Parâmetros utilizados na reação de amplificação para o kit QuikChange® II XL.

Segmento Número de ciclos Temperatura (°C) Tempo

1 1 95 1 minuto 2 19 95 50 segundos 60 50 segundos 68 5 minutos e 30 segundos 3 1 68 7 minutos

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Terminada a reação de amplificação, adicionou-se a cada produto de reação 1 μL da enzima DpnI (fornecida no kit), desencadeando, assim, a digestão da cadeia de DNA utilizada como molde. De seguida, as misturas de reação foram brevemente centrifugadas (short spin) numa microcentrifuga (MiniSpin® Plus, Eppendorf) e incubadas a 37 °C (BD-56,Binder) durante 2 horas.

3.7.2. Transformação de células competentes XL10-Gold

A transformação de células competentes XL10-Gold, fornecidas no kit QuikChange® _{II XL}

(Aligent) foi realizada em ambiente estéril. Inicialmente, para cada um dos mutantes em estudo, foram pipetados 45 μL de células competentes XL10-Gold para um falcon estéril, de seguida adicionou-se 2 μL de β-Mercaptoetanol (fornecido no kit) e incubou-se durante 10 minutos em gelo.

Posteriormente, adicionou-se 2 μL do produto da reação de amplificação e incubou-se novamente em gelo durante 30 minutos, seguindo-se a incubação da mistura de reação a 42 °C durante 30 segundos. De seguida, adicionou-se 500 μL de meio de cultura LB e incubou-se durante 1 hora a 37 °C com agitação a 180 rpm (Innova 4230, New Brunswick Scientific).

O produto obtido aquando da transformação foi plaqueado em placas de LB-agar com 100 μg/mL de ampicilina (AMP). As placas foram posteriormente incubadas a uma temperatura de 37 °C durante a noite.

3.7.3. Otimização de condições no procedimento de mutagénese dirigida

Tendo-se verificado em diversas tentativas a ausência do aparecimento de colónias transformantes para os mutantes D169A/N e E453A/Q, foram encomendadas novas sequências de oligonucleótidos, apresentadas de seguida na Tabela 3.6.

Tabela 3.6. Novas sequências de oligonucleótidos utilizadas para a realização de mutagénese dirigida e

obtenção dos mutantes D169A, E543A, D169N e E453Q. Os codões que codificam aminoácidos para as diferentes mutações encontram-se destacados em cada uma das sequências de oligonucleótidos.

Mutante em estudo Sequência de oligonucleótidos (5’-3’)

AioA D169A _{CGCCTGCACCGCCATGGGCAAAGGCCGATACGATG (Reverse)} CATCGTATCGGCCTTTGCCCATGGCGGTGCAGGCG (Forward) AioA E453A GCCTTGGCGGACACCAGGCAGGCTATGTGCGC (Forward) _{GCGCACATAGCCTGCCTGGTGTCCGCCAAGGC (Reverse)} AioA D169N CATCGTATCGGCCTTTAACCATGGCGGTGCAGGCG (Forward)

CGCCTGCACCGCCATGGTTAAAGGCCGATACGATG (Reverse) AioA E453Q GCCTTGGCGGACACCAGCAAGGCTATGTGCGC (Forward)

GCGCACATAGCCTTGCTGGTGTCCGCCAAGGC (Reverse)

Utilizando as novas sequências de oligonucleótidos realizou-se novamente a reação de amplificação e transformação de células competentes, de acordo com o procedimento referido anteriormente. No entanto, terminado este procedimento não se verificou o aparecimento de colónias transformantes para nenhum dos mutantes em estudo.

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Posto isto, na tentativa de obter os mutantes D169A/N e E453A/Q, recorreu-se à utilização do kit de mutagénese dirigida NZYMutagenesis Kit (NZYTech), utilizando novamente as sequências de oligonucleótidos apresentadas na Tabela 3.6. Este procedimento foi realizado no laboratório de Cristalografia de Proteínas do UCIBIO-REQUIMTE (FCT, UNL).

3.7.4. Reação de amplificação com recurso ao kit NZYMutagenesis

A reação de amplificação, para cada um dos mutantes, foi preparada para um volume final de 50 μL, tendo sido pipetados 40 μL de água Milli-Q, previamente autoclavada, 5 μL de

Reaction Buffer 10x (fornecido no kit), 1 μL de dNTP mix (fornecido no kit), 60 ng de DNA

molde de cadeia dupla, 125 ng de cada um dos primers (forward e reverse) e por último adicionou-se 1 μL de DNA polimerase NZYProof (2,5 U/µL).

O programa de amplificação foi realizado num termociclador (My Cycler, Biorad), utilizando os parâmetros apresentados na Tabela 3.7.

Tabela 3.7. Parâmetros utilizados na reação de amplificação com o kit NZYMutagenesis.

Segmento Número de ciclos Temperatura (°C) Tempo

1 1 95 2 minutos 2 18 95 1 minuto 60 1 minuto 68 11 minutos 3 1 68 15 minutos

A eficiência de amplificação foi verificada por eletroforese em gel de agarose 1% (p/v), utilizando NZYLadder III (NZYTech) como marcador de pesos moleculares. A cada 10 μL de produto de reação de amplificação foram adicionados 2 μL de loadding buffer Orange G (NZYTech). Aplicou-se uma corrente constante de 100 V durante cerca de 60 minutos e os resultados foram visualizados no aparelho GelDoc (Biorad).

De igual modo ao realizado para o kit QuikChange® II XL, terminada a reação de amplificação, adicionou-se a cada produto de reação 5 μL da enzima DpnI. De seguida, as misturas de reação foram brevemente centrifugadas (MiniSpin® Plus, Eppendorf) e incubadas a 37 °C (Orbital Shaker-Incubator ES-20, Grant-Bio) durante 2 horas.

3.7.5. _{Transformação de células competentes DH5α}

A transformação de células competentes da estirpe DH5α de E. coli foi realizada em ambiente estéril. Inicialmente, para cada um dos mutantes, foram pipetados 100 μL de células competentes DH5α para um eppendorf estéril, de seguida adicionou-se 20 μL do produto da reação de amplificação tratado com DpnI e incubou-se em gelo durante 30 minutos, seguindo- se a incubação da mistura de reação a 42 °C durante 40 segundos.

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De seguida, adicionou-se 900 μL de meio de cultura LB e incubou-se durante 1 hora a 37 °C com agitação a 180 rpm (Orbital Shaker-Incubator ES-20, Grant-Bio). Terminado o período de incubação, as amostras foram centrifugadas a 5000 rpm durante 1 minuto, removendo posteriormente 950 μL de sobrenadante.

As células foram gentilmente ressuspendidas no volume restante e o produto obtido aquando da transformação foi plaqueado em placas de LB-agar com 100 μg/mL de ampicilina (AMP). As placas foram posteriormente incubadas a 37 °C durante a noite.

Tendo-se verificado, no dia seguinte, o aparecimento de colónias transformantes para os vários mutantes em estudo, procedeu-se ao isolamento de DNA plasmídico, a partir de uma única colónia, com recurso ao kit NZYMiniprep (NZY Tech). A quantificação dos plasmídeos recombinantes foi efetuada através do Nanodrop (Thermo Scientifc Nanodrop 2000c) e a sequenciação foi realizada pela empresa STABVida. Os resultados provenientes da sequenciação foram analisados com recurso ao programa Clustal Omega (Sievers et al., 2011).

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