Perante determinadas circunstâncias, muitas substâncias moleculares, incluindo proteínas, podem solidificar originando cristais. Ao passar ao estado cristalino a partir da solução, as moléculas individuais da substância adotam uma ou algumas orientações idênticas. O cristal resultante corresponde a uma matriz tridimensional ordenada de moléculas, unidas por interações não covalentes, nomeadamente pontes de hidrogénio, entre os átomos que se encontram à superfície da molécula. Nessa matriz é possível identificara célula unitária, que se define como a menor unidade do cristal que se repete infinitamente no espaço tridimensional, originando um cristal ordenado. Esta célula é caracterizada por 3 vetores, definidos por a, b e
c, e por 3 ângulos definidos por α, β e γ (Figura 1.13
)
(Gale, 2006; Romão, 1996).Figura 1.13. Representação esquemática de um cristal. Por operações de simetria, a unidade assimétrica
gera a célula unitária que, por sua vez, através de operações de translação, gera a rede cristalina, que se repete de forma ordenada no espaço tridimensional (Adaptado de Gale, 2006).
A célula unitária é, por sua vez, constituída por uma ou mais unidades assimétricas, que representam a menor parte da estrutura cristalina, a partir da qual se pode obter a célula unitária, através da aplicação de operações de simetria. Por último, define-se o conceito de rede cristalina, cuja base é uma célula unitária que se repete em todos os pontos dessa rede (Gale, 2006).
O grupo espacial a que um cristal pertence corresponde ao conjunto de operações de simetria cristalográfica que originam a célula unitária a partir da unidade assimétrica. A caracterização do grupo espacial do cristal é feita de acordo com três parâmetros: geometria da célula unitária, número de pontos da rede cristalina na célula unitária e pelas operações de simetria que, ao serem aplicadas a uma unidade assimétrica, geram a célula unitária (Gale 2006; Romão 1996).
Consoante os valores das constantes da célula, o cristal pode pertencer a um de sete sistemas cristalinos existentes: cúbico, trigonal, tetragonal, hexagonal, ortorrômbico, monoclínico e triclínico (consultar Anexo 2, Figura 7.2).
Unidade
assimétrica Célula unitária Cristal
Simetria cristalográfica
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No que diz respeito ao número de pontos da rede cristalina, a célula unitária pode ser do tipo: Primitivo (P) quando apenas um ponto da rede está presente na célula unitária, centrado numa única face (C) ou centrado no corpo (I) quando existem dois pontos da rede cristalina pertencentes à célula unitária ou centrado nas seis faces (F) quando 4 pontos da rede cristalina estão presentes na célula unitária (Gale, 2006).
A combinação da geometria da célula unitária, isto é do sistema cristalino, e do número de pontos da rede cristalina na célula unitária origina a chamada rede Bravais, existindo 14 redes
Bravais (consultar Anexo 2, Figura 7.3).
Por último, no que diz respeito à caracterização do grupo espacial, torna-se necessário referir as operações de simetria cristalográfica que, aplicadas à unidade assimétrica, originam a célula unitária, encontrando-se descritas nas tabelas internacionais para cristalografia. Estas operações podem ser do tipo rotacional ou de eixo de parafuso, sendo que nestas últimas para além de rotação, ocorre também translação da unidade assimétrica de forma a originar a célula unitária (Blow, 2002; Gale 2006).
No que diz respeito a moléculas aquirais, ou seja, moléculas cuja imagem no espelho pode ser sobreposta à imagem original, verificam-se também operações de simetria como o plano de espelho ou o centro de inversão. Neste caso, a combinação da geometria da célula unitária com o número de pontos da rede cristalina na célula unitária e as operações de simetria origina um conjunto total de 230 grupos espaciais. No entanto, dado que moléculas biológicas, como as proteínas, são inerentemente quirais, isto é, a sua imagem do espelho não pode ser sobreposta à imagem original, estas não apresentam as duas referidas operações de simetria, reduzindo para 65 o número de grupos espaciais a que os cristais de proteína podem pertencer (Blow, 2002; Gale 2006).
Como referido anteriormente, o sucesso da determinação de estruturas tridimensionais pela técnica de cristalografia de raios-X depende do desenvolvimento e obtenção de bons cristais e consequentemente da sua organização interna (Blow, 2002).
Deste modo, é essencial encontrar determinadas condições que permitam uma organização regular das proteínas, formando cristais, metodologia designada por screening.
Para tal, é necessário variar um grande número de condições experimentais, nomeadamente pH, tipo e concentração de agente precipitante e temperatura. A escolha das experiências mais adequadas deve considerar vários fatores, entre os quais o protocolo de purificação, comportamento da proteína e o seu ponto isoelétrico (Carvalho et al., 2009).
A estratégia utilizada para induzir a cristalização de macromoléculas baseia-se em atingir lentamente um estado de solubilidade mínima de modo a alcançar um determinado grau de sobressaturação que facilite o ordenamento das moléculas numa rede cristalina.
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Nos métodos mais comuns de crescimento de cristais de proteína, a proteína purificada é dissolvida num tampão aquoso que contém um agente precipitante (sendo o sulfato de amónio e o polietilenoglicol (PEG) os mais comuns), a uma determinada concentração, imediatamente abaixo da concentração necessária para precipitar a proteína. Quando a água é eliminada por um processo de evaporação controlado, verifica-se um aumento das concentrações de proteína e agente precipitante, resultando na precipitação da proteína. A precipitação lenta produz cristais de maiores dimensões, ao invés de um processo de precipitação mais rápido cujo resultado pode ser a formação de cristais mais pequenos ou a formação de um precipitado amorfo (Gale, 2006).
Teoricamente, a precipitação deve ocorrer quando a combinação entre as concentrações de proteína e precipitante excede os valores limiares de solubilidade (Figura 1.14). A formação de cristais ocorre em dois estágios: a nucleação, em que se verifica um processo de precipitação lento de forma a favorecer a formação inicial de agregados proteicos, e o crescimento de cristais, sendo este último verificado aquando da entrada na região metaestável (Carvalho et
al., 2009; Romão 1996).
Figura 1.14. Diagrama de fases para o processo de cristalização de proteínas. O parâmetro ajustável
pode incluir: concentração de agente precipitante, pH e temperatura, entre outros. No diagrama são apresentadas duas regiões distintas: a região não saturada e a região sobressaturada, que inclui a zonas de nucleação, na qual ocorre formação de núcleos de cristalização, a zona metaestável, onde ocorre crescimento de cristais e a zona de precipitação (Adaptado de Gale, 2006).
Existem vários métodos que podem ser utilizados nos ensaios de cristalização, entre os quais a Difusão por Capilar, cristalização em Batch ou Microdiálise, mas o método mais comum é o de Difusão de Vapor.
O método de Difusão de Vapor tem como princípio básico estabelecer um equilíbrio, num recipiente fechado, entre uma gota de solução de proteína e solução precipitante, e um reservatório que contém solução precipitante, cuja concentração é ótima para a produção de cristais. Como a concentração de precipitante é superior no reservatório e como se trata de um sistema fechado, a tendência para igualar a concentração de precipitante na gota e no reservatório provoca a difusão de vapor com transferência de água da solução de proteína para o reservatório.
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Assim, a concentração de proteína, presente na gota, aumenta até atingir um valor de concentração ótimo para a formação de cristais. O mesmo sucede com a concentração de precipitante.
Quando o equilíbrio é atingido, pode formar-se um precipitado amorfo ou microcristalino, ou em condições mais favoráveis material cristalino. Geralmente, após a realização de um conjunto de ensaios de cristalização é necessário otimizar determinados parâmetros como pH, temperatura, concentração de agente precipitante, uso de aditivos ou seeding, com objetivo de otimizar as condições preliminares, até que se obtenham cristais de boa qualidade e de dimensões que permitam a sua manipulação e difração (≥ 0,05mm) (Gale 2006; Romão, 1996). Este método inclui a técnica de gota suspensa, onde a gota é colocada numa lamela situada sobre o reservatório, e o método de gota assente, em que a gota é colocada numa microponte localizada no reservatório, como se encontra ilustrado na Figura 1.15.
Figura 1.15. Técnicas de cristalização por difusão de vapor: técnica de gota suspensa (representada à
esquerda) normalmente utilizada para os ensaios de cristalização realizados manualmente e técnica de gota assente (representada à direita) geralmente utilizada em ensaios realizados no dispensador automático de gotas (robot) (Adaptado de Gale, 2006).
Após a obtenção de cristais o passo que se segue é a experiência de difração, que consiste em incidir um feixe de raios-X no cristal.