Kriz Yönetim Planı Oluşturmak

Hipóxia significa deficiência de oxigênio, referindo-se assim a qualquer estado em que existe uma redução do oxigênio disponível. É uma causa extremamente importante e comum de lesão e morte celular, além de ser um dos mais fundamentais de todos os estímulos ambientes (FERREIRA et al., 2006). Assim, como o crescimento tumoral exige oxigênio, nutrientes e função metabólica adequada para se desenvolver, torna-se necessário promover a angiogênese para inibir a apoptose das células tumorais desencadeada pela hipóxia.

As células respondem a estímulos extra e intracelulares para manter a homeostase, e a hipóxia é um dos mais fundamentais de todos os estímulos ambientais (FERREIRA et al., 2006).

A progressão de uma célula normal para a malignidade envolve a capacidade de esta estimular a angiogênese. Inicialmente, o desenvolvimento de um tumor é suprido por vasos sanguíneos próximos. Entretanto, em certo momento de crescimento tumoral estes vasos sanguíneos não são mais suficientes e novos vasos sangüíneos são necessários para continuar o crescimento. A capacidade do tumor de induzir a formação de novos vasos sanguíneos foi denominado “angiogenic switch” e pode ocorrer em diferentes fases da progressão do tumor, sendo dependente do tipo de tumor e do meio ambiente (BERGERS; BENJAMIN, 2003).

As células tumorais exigem uma vascularização para o fornecimento de nutrientes e oxigênio, mas o oxigênio não é capaz de difundir além de cerca de 150 mM através dos tecidos. Com o crescimento do tumor, a demanda de oxigênio excede o

suprimento do mesmo oriundo da vascularização os seus vasos, assim as células ficam sob condições de hipóxia (HORSMAN, 1998). Regiões hipóxicas se desenvolvem dentro de tumores sólidos devido a formações aberrantes de vasos sangüíneos e também em decorrência da expansão tumoral.

O fator 1 induzível por hipóxia (HIF-1) é um fator de transcrição envolvido na adaptação celular à hipóxia. Tem um importante papel em processos fisiológicos e patológicos. O HIF facilita o fornecimento de oxigênio e adaptação à privação de oxigênio através da regulação da expressão de genes que estão envolvidos em muitos processos celulares, incluindo a absorção de glicose e do metabolismo, a angiogênese, a eritropoiese, proliferação celular e apoptose (SEMENZA, 2000; SEMENZA, 2001; RANKIN; GIACCIA, 2008; UEHARA, et al., 2009) (Figura 2).

O HIF-1 é um fator de transcrição nuclear que funciona na forma de heterodímero, pertencente à família de fatores de trascrição basic-helix-loop-helix-PAS (bHLH-PAS), sendo composto pelas subunidades HIF-1α e HIF-1β (conhecida como translocador nuclear receptor aril hidrocarbono, ARNT) (WANG et al., 1995). A subunidade HIF-1α contém quatro domínios distintos, incluindo um domínio bHLH para a ligação do DNA e dimerização, um domínio de dimerização PAS e especificidade do gene alvo, um domínio de degradação oxigênio-dependente (ODD), necessário para a degradação pela via da ubiquitina-proteassoma e dois domínios de transativação localizado na região C-terminal da proteína (PUGH et al., 1997; HUANG et al., 1998; RANKIN; GIACCIA, 2008). Semelhante, a subunidade β (ARNT) contém bHLH, PAS e domínios de transativação. No entanto, falta o domínio ODD, e por isso é constitutivamente expressa em todos os tecidos em condições aeróbias (HUANG et al., 1998; RANKIN; GIACCIA, 2008) (Figura 3).

Figura 2. Processos Fisiológicos (círculo interno) e patológicos (círculo externo) nos quais o HIF-1 tem função como regulador central. FONTE: Semenza, 2000.

Existem 3 formas de HIF-α humana (HIF-1α, HIF-2α, e HIF-3α), cada uma das quais é codificada por um locus genético distinto. HIF-1α e HIF-2α têm sido mais bem caracterizadas, possuindo estruturas de domínio semelhante que são reguladas pelo oxigênio, apesar de cada isoforma terem papéis distintos e separados. O papel do HIF- 3α ainda não está totalmente compreendido, entretanto uma forma truncada de HIF-3α conhecida como inibitório Per/Arnt/Sim (PAS) domínio protéico (IPAS) tem sido encontrado como um inibidor do HIF através de dimerização com HIF-β (KAELIN et al., 2008; COOK; FIGG, 2010) (Figura 3).

Figura 3. Representação esquemática da família do gene HIF. FONTE: (RANKIN; GIACCIA, 2008).

O gene hif-a humano que codifica a proteína HIF-1α possui 2.478 pares de base e a proteína consiste de 836 aminoácidos, com uma massa molecular que varia de 104 a 116 kDa (RICHARD et al., 1999). O hif-a encontra-se no cromossomo 14 e consiste de 15 exons interrompidos por 14 introns. O exon 2 codifica o domínio bHLH, essencial para dimerização e ligação da proteína com DNA, enquanto a região que vai dos exons 3 ao 8 codifica o domínio PAS. A região carboxi-terminal, que compreende os domínios responsáveis pela ativação e estabilidade da proteína, é codificada nos exons 9 a 15 (SEMENZA, 2006). O gene arnt humano localiza-se na região q21 do cromossomo 1 e possui 22 exons. O gene processado que codifica para o ARNT possui 2.367 pares de base e a proteína consiste de 789 aminoácidos com uma massa molecualr de 94 kDa (FERREIRA et al., 2007).

O mecanismo de transativação pelo HIF-1 envolve a ligação do complexo HIF- 1α/ARNT aos motivos HREs (elementos responsivos à hipóxia), localizados nos promotores e enhancers dos genes alvos. Para a ativação dos genes alvos vários coativadores são recrutados se ligando ao complexo do HIF-1, tais como o complexo CBP (CREB binding protein)/p300. Em adição ao CBP/p300, HIF-1 interage com o coativador SRC-1 (coativador 1 do receptor de esteróide) e com o Tie-2 (fator intermediário 2 da transcrição) (GIACCIA et al., 2003; FERREIRA et al., 2007). Essa interação aumenta o potencial transcricional do HIF-1 de uma maneira dependente de

oxigênio e produz um efeito sinérgico com CBP. Esse efeito é fortemente potencializado pela proteína regulatória do estado redox Ref-1 (fator redox 1), uma proteína que tem atividade redutora de cisteína (CARRERO et al., 2000). Ref-1 interage fisicamente com ambos os domínios TAD-C e TAD-N, levando a uma transativação mais potente. Adicionalmente, a ligação do HIF-1 aos HREs não é suficiente para indução de muitos genes pela hipóxia. Tem-se verificado cooperações sinérgicas entre HIF-1α e outros fatores de transcrição, tais como Smad-3, fator 4 nuclear de hepatócito (HNF4), ATF1/CREB1, proteína 1 ativadora (AP1) e Ets-1 (BRACKEN et al., 2003).

Embora a atividade de muitos fatores de transcrição seja afetada pela oxigenação dos tecidos, portanto, influenciando a regulação gênica, tem se tornado mais evidente que HIF-1 é o fator de transcrição dominante que regula a expressão gênica em resposta aos níveis de oxigênio (PUGH et al., 1997).

A habilidade e a atividade do HIF-1α são reguladas por várias modificações pós- traducionais, tais como hidroxilação, acetilação, nitrosilação e fosforilação (SEMENZA, 2003; FEREIRA et al., 2007). O óxido nítrico promove a estabilização do HIF-1α, ligação ao DNA e a sua transativação sob condições de normóxia, o que favorece o acúmulo HIF-1α; já sob condições de hipóxia o óxido nítrico inibe ou impede o acúmulo de HIF-1α (FEREIRA et al., 2007).

Em relação à fosforilação, muitos genes/oncogenes supressores de tumor influenciam ou são constituintes de cascatas de fosforilação e assim interferem os níveis de expressão do HIF-1α independente do oxigênio. Essas cascatas podem ser iniciadas após fatores de crescimento se ligarem aos receptores de tirosina quinase, que por sua vez ativam os alvos posteriores da via. Existem duas vias principais de fosforilação envolvidas na ativação do HIF-1, vias da proteína quinase ativada e da fosfatidilinositol- 3-quinase (FERREIRA et al., 2007).

Com relação à hidroxilação, o HIF-1α, sob condições de normóxia, é constitutivamente expresso e subsequentemente hidroxilado por uma HIF prolil- hidroxilase (HPH), levando-o a uma rápida degradação mediada pelo proteassoma. Essa degradação envolve a ação de um complexo ubiquitina-ligase contendo o fator Von Hippel Lindau, uma proteína supressora de tumor (pVHL) que faz parte de um complexo de proteínas, constituído pela elonguina B e C e culina 2 (SMITH; ROBBINS; RATCLIFFE et al., 2008). A pVHL reconhece os resíduos de prolina hidroxilados (Pro402 and Pro564) presentes no domínio ODD do HIF-1α. A prolil- hdroxilase é uma dioxigenase que usa O2 e 2-oxoglutarato como substratos. Essa

enzima transfere um átomo de O2 para os resíduos de prolina e o segundo átomo de O2

reage com o 2-oxoglutarato gerando o succinato. Ela também requer ferro como cofator, o qual se liga ao O2 quando mantido no estado ferroso pelo ácido ascórbico. Sua

atividade é suprimida pelo decréscimo na tensão de O2. Quando HPH é inibida, a via de

degradação do HIF-1α é bloqueada, levando assim ao acúmulo dessa proteína e sua migração para o núcleo, onde ela ativa genes responsivos à hipóxia (BRUICK; MCKNIGHT, 2001).

Em condições de hipóxia, o mínimo de hidroxilação ocorre, há o recrutamento do coativador p300/CPB, em seguida, HIF-1α transloca-se para o núcleo, formando o heterodímero com o ARNT, onde se ligam ao motivo HRE dos genes alvos. Sob condição de hipóxia, HIF-1α não é degradada e assim seus genes alvos são expressos e uma resposta fisiológica à concentração de oxigênio é ativada (COOK; FIGG, 2010). Chilov et al. (1999) mostraram que o acúmulo de HIF-1α no núcleo em células submetidas à hipóxia é uma característica intrínsica desse fator de transcrição, já que ele é independente da presença do ARNT.

No mecanismo da acetilação, foi verificado que o resíduo do aminoácido lisina 532 (K532), localizado no domínio ODD do HIF-1α é acetilado por uma acetiltransferase chamada arrest-defective-1 (ARD1). A acetilação da K532 favorece a interação do HIF-1α com o pVHL e assim desestabiliza o HIF-1α. Uma mutação na K532, substituindo-a por um resíduo de arginina resulta em uma estabilidade aumentada do HIF-1α (TANIMOTO et al., 2000). A atividade das acetiltransferases não é alterada pelos níveis de oxigênio, mas os níveis do mRNA do ARD1 (e conseqüentemente da proteína) diminuem sob condições de hipóxia, levando a um menor nível de acetilação do HIF-1α do que sob normóxia (JEONG et al., 2002).

O HIF regula a expressão de mais de 100 genes que regulam aspectos chave da tumorigênese, incluindo a angiogênese, o metabolismo, proliferação, invasão e metástase (HICKEY; SIMON, 2006; RANKIN; GIACCIA, 2008) (Figura 3).

Sob condições severas de hipóxia, a geração de ATP a partir da fosforilação oxidativa é substituída pela geração menos eficiente de ATP através da glicólise anaeróbica. Dessa forma, o fornecimento de ATP para a síntese de proteínas pode cair até 7% em relação às células expostas a condições de normóxia. Para compensar o decréscimo de ATP normalmente fornecido pela fosforilação oxidativa, HIF-1 ativa genes-chaves envolvidos no mecanismo da glicólise e no transporte da glicose, tais

como o GLUT-1 e 3, fosfofrutoquinase L (PFK), fosfoglicerato quinase 1 (PGK1) e lactato desidrogenase-A (LDH) (SEMENZA, 2003).

Muitos fatores pró-angiogênicos como o VEGF, fator de crescimento tumoral β2 (TGF-β2), receptor do VEGF, bFGF e PDGF são induzidos por HIF-1 para promover a angiogênese. Outros genes ativados pelo HIF-1 incluem fatores que regulam a proliferação e sobrevivência celular, apoptose, motilidade e estrutura do citoesqueleto, metabolismo da matriz extracelular, tônus vascular, adipogênese, desenvolvimento de células B e resistência a drogas (SEMENZA, 2003; SEMENZA, 2006; RANKIN; GIACCIA, 2008) (Figura 4).

Figura 4. Genes ativados na presença do HIF. FONTE: (RANKIN; GIACCIA, 2008).

O HIF-1 se liga aos genes alvos em sítios contendo o centro de reconhecimento 5'-RCGTG-3' (SEMENZA, 2006). A presença dos sítios de ligação do HIF-1 (HBS) é necessária, mas não suficiente para a expressão dos genes em resposta à hipóxia, indicando que o HIF-1 deve interagir com outros fatores de transcrição ligados a sítios adjacentes (FERREIRA et al., 2007).

Embora o HIF-1 tenha sido inicialmente descrito como o fator de transcrição regulado pela hipóxia, existe crescentes evidências de que o HIF-1 é também responsivo a uma variedade de estímulos não hipóxicos. Entre esses estímulos podemos citar a insulina, PDGF, fator de crescimento tumoral β3 (TGF-β3), fator 1 de crescimento de

insulina, trombina, peptideos vasoativos tais como angiotensina II, citocinas pró- inflamatórias, carbacol que ativa os receptores de acetilcolina muscarínicos. Além disso, o HIF-1 também é ativado por metais tais como, cobalto, cromo, níquel e arsênio, como também por estresse mecânico. No entanto, os mecanismos pelos quais esses estímulos não hipóxicos induzem o HIF-1 não são completamente conhecidos, embora algumas evidências apontam para o papel dos EROs (espécies reativas de oxigênio) como mensageiros, regulando a atividade do HIF-1 (FERREIRA et al., 2007).

Giaccia et al. (2003) resumiram o conhecimento discutido no Encontro de Keystone sobre a biologia da hipóxia. Foi observado que as respostas induzidas pela hipóxia são fortemente reguladas no desenvolvimento embrionário normal e podem ser desreguladas em diferentes estados das doenças. A identificação das proteínas reguladas pelo oxigênio como os fatores transcricionais da família HIF representa um paradigma para a percepção do oxigênio a nível molecular. Todavia, considera-se que esta família seja um dos exemplos envolvidos na regulação da expressão protéica em resposta a hipóxia. Uma variedade de organelas intracelulares também pode estar relacionada com a percepção do oxigênio como, por exemplo, os canais iônicos, mitocôndrias e retículos endoplasmáticos. Finalmente, os pesquisadores concluíram que o conhecimento de como as células percebem e respondem a hipóxia é fundamental para entender o papel da hipóxia em doenças, bem como para aprimorar os diagnósticos e tratamentos.

Yamakawa et al. (2003) investigaram os eventos moleculares envolvidos na regulação da resposta angiogênica pelo fator transcricional HIF-1α durante a hipóxia. E observaram que baixo nível de expressão dos fatores angiogênicos foi observado nas células endoteliais em normóxia. Em contraposição, em condição de hipóxia a expressão dos fatores envolvidos na angiogênese estava aumentada. Através dos resultados, pode-se sugerir que o HIF-1α medeia a resposta angiogênica à hipóxia, pela regulação de múltiplos fatores angiogênicos, especialmente do VEGF e do sistema da angiopoetinas.

Fang et al. (2001), com o objetivo de identificar as moléculas e os mecanismos envolvidos com a troca do fenótipo angiogênico durante a progressão tumoral, desenvolveram um modelo de condrosarcoma in vivo. O papel do VEGF e do bFGF e do fator transcricional HIF-1α foi examinado nas fases de crescimento avascular e vascular do tumor. Os autores observaram aumento significante dos níveis de expressão protéica do VEGF em nódulos avasculares do tumor, quando comparado aos nódulos vasculares. Quando os nódulos avasculares se vascularizaram, houve redução da

expressão do VEGF. Contrariamente, a concentração de bFGF não foi aumentada nos nódulos avasculares, mas foi duas vezes maior nos nódulos vasculares. Como a expressão do VEGF foi regulada transcripcionalmente pelo HIF-1α, análises da imunohistoquímica dos nódulos do condrosarcoma revelaram que a translocação nuclear do HIF-1α foi detectada exclusivamente em nódulos do tumor avascular. Estes resultados indicaram que o aumento da expressão do VEGF foi mediada pelo fator de transcrição HIF-1α, o que não ocorreu para o bFGF na troca do fenótipo angiogênico durante o desenvolvimento tumoral.

Aranha (2008) ponderando o potencial angiogênico das células pulpares humanas em hipóxia observou ausência da ativação do fator transcricional HIF-1α nas células-tronco e de fibroblastos de polpas de dentes permanentes humanos em condição de normóxia. Por outro lado, houve aumento da expressão do HIF-1α e do VEGF em ambas linhagens celulares, quando as células foram colocadas em condição de hipóxia. Demonstrando assim, que a hipóxia foi suficiente para induzir o potencial angiogênico de células pulpares humanas.

Em amostras clínicas, elevada expressão de HIF-1 correlaciona com uma pobre evolução do paciente com câncer de cabeça e pescoço, carcinoma de nasofaringe, colorretal, pâncreas, mama, cervical, osteosarcoma, ovário, endométrio, bexiga, glioblastoma, e carcinomas gástricos (OSADA et al., 2007; WINTHER et al., 2006).

Ameri et al. (2010) realizaram um estudo com o objetivo de avaliar a associação entre a hipóxia e as células tumorais circulantes, com a hipótese de que a hipóxia poderia desempenhar um papel na seleção de células com fenótipos mais agressivos. E observaram que as células tumorais circulantes mostraram uma resposta a hipóxia alterada e um fenótipo agressivo mais forte in vivo e in vitro.

Tilakaratne et al. (2008) estudaram a expressão do HIF-1α em casos de fibrose submucosa oral, com a hipótese de que a hipóxia poderia desempenhar um papel na transformação e progressão desta condição potencialmente maligna. E observaram correlação estatisticamente significante com o grau de displasia das fibroses submucosas orais, podendo indicar a possível participação da hipóxia na transformação maligna desta lesão.

Sasabe et al. (2005) analisando os mecanismos de sobrevivência de linhagens de células de carcinoma epidermóide oral em condições de hipóxia, descreveram que a superexpressão do HIF-1α inibia a apoptose das células neoplásicas. Além disso, moléculas antiapoptóticas (Bcl2 e Bcl-X) e pró-apoptóticas (Bax e Bak) estariam em

níveis aumentados e diminuídos respectivamente pela superexpressão desse marcador de hipóxia. Os autores ressaltam, ainda, que o HIF-1α estaria associado, em virtude desse mecanismo, a um pior prognóstico, a uma menor taxa de sobrevida e a resistência a quimioterapia.

Kyzas et al. (2005) investigando a correlação do VEGF e o HIF-1α com os parâmetros clínico-patológicos e prognóstico em 81 casos de carcinoma epidermóide de cabeça e pescoço, constataram uma associação significativa entre a expressão do VEGF e do HIF-1α nos tumores localizados no lábio inferior e na laringe. Entretanto, a expressão do HIF-1α não foi significativamente correlacionada com a taxa de sobrevida, enquanto a expressão do VEGF caracterizou-se com um pior prognóstico. Os autores suportam que a angiogênese tumoral poderia estar relacionada, mas não estritamente dependente do ambiente hipóxico tumoral.

Uehara et al. (2009), demonstraram, em 57 casos de carcinoma epidermóide oral, que a intensa imunoexpressão do HIF-1α estava associado com a metástase linfonodal, quando comparado a pacientes sem metástase, contribuindo, assim com o pior prognóstico.

Devido ao fato do HIF regular genes que permitam a sobrevivência das células em um ambiente hipóxico, incluindo aqueles envolvidos na glicólise, na angiogênese e na expressão de fatores de crescimento, tem sido observada sua importância na biologia e na regulação do crescimento do tumor (COOK et al., 2010). O papel central do HIF na ativação de genes relacionados a angiogênese tem se tornado um alvo promissor para o tratamento de tumores.

3. PROPOSIÇÃO

Este trabalho se propõe a analisar a expressão imuno-histoquímica qualitativa e quantitativa das proteínas GLUT-1 e HIF-1α, respectivamente, em lesões vasculares orais. Além disto, procurou estabelecer uma análise comparativa desta expressão em ambas as lesões objetivando verificar se estes marcadores podem ser utilizados como ferramentas no diagnóstico diferencial e se o HIF-1α participa da patogênese de tais lesões.