İTTİHATÇILIK ve FEDAİ ZABİTAN A İTTİHATÇILIK

Com a finalidade de obter um dos flavonoides observados nos escapos de P

geniculatus, realizou-se o fracionamento por Sephadex® LH-20 como descrito no

item 3.3.4. As frações que resultaram da cromatografia por permeação em gel foram analisadas por CCDC (figura 7) com a metodologia descrita no item 3.3.6, onde foi possível observar quais frações apresentavam manchas mais aparentes, assim como uma boa quantidade de massa que permitisse estudos posteriores.

O perfil por CCDC evidenciou, após revelação em cuba contendo iodo, que a fração J89 apresentou manchas pronunciadas e uma boa quantidade em massa (45,6 mg) para prosseguir com a purificação das substâncias.

Figura 7 - Perfil por CCDC (item 3.3.6) das frações obtidas do fracionamento por

Sephadex® LH-20.

Condições cromatográficas: As frações foram solubilizadas, uma alíquota foi aplicada em placa de sílica e a eluição ocorreu com o solvente CHCl3:MeOH:H2O (43:37:20 v/v/v), utilizando-se como

reveladores câmara de UV (254 nm - Chromatovue®) e Iodo.

Esta fração foi solubilizada em metanol (atingindo a concentração de 1,0 mg mL-1_{), uma alíquota passou por clean-up (item 3.3.2) utilizando cartucho SPE-C}

18 e

posteriormente registrou-se fingerprint dessa fração como descrito em 3.3.3 (Figura 8).

Figura 8 - Cromatograma CLAE-DAD da fração J89 proveniente do fracionamento descrito

em 3.3.4 de P. geniculatus.

Condições cromatográficas: Coluna Hydro (25 cm x 4,6 mm x 4 µm). Fluxo de 1 ml.min-1. Método

gradiente de 5% a 100% de MeOH, 60 min. 270 nm.

O cromatograma evidencia um pico pronunciado com TR = 12,3 min. Por esse

pico apresentar-se distante dos demais, essa mesma condição cromatográfica foi utilizada para a purificação da substância. Para isso, 45,6 mg da fração foram solubilizados em 4,6 ml de MeOH:H2O 1:1 (v/v) (alcançando uma concentração de

10,0 mg mL-1_{) e analisadas por CLAE-DAD semipreparativo segundo a metodologia}

descrita no item 3.3.7.

A substância S1 foi seca em evaporador rotativo fornecendo uma massa de 2,1 mg. Para a elucidação estrutural, a amostra foi solubilizada em DMSO-d6 e

analisada segundo técnicas espectroscópicas de RMN mono e bidimensionais (item 3.3.8).

A análise dos deslocamentos químicos no espectro de RMN 1_{H (Figuras 9-10)}

apresentou sinais de hidrogênios aromáticos (δ 6-8 ppm) de modo que verifica-se um sinal de um hidrogênio com acoplamento orto δ 6,78 (d, J = 8,4 Hz, H-5), um sinal de um hidrogênio com acoplamento meta em δ 7,32 (d, J = 2,0 Hz, H-2) e um sinal de um hidrogênio com acoplamento orto-meta em δ 7,27 (dd, J = 8,4 e 2,0 Hz, H-6). Esses sinais evidenciaram a presença de um anel aromático trissubstituído.

1

0.0 10.0 20.0 30.0 40.0 50.0 60.0

Retention Time [ min] 0 500000 1000000 In te ns ity [ µV ]

As informações dos espectros bidimensionais de mapa de contorno gHSQC (1_J

C-H) e gHMBC (2JC-H e 3JC-H) juntamente com os dados do espectro de RMN 1H

mostraram-se importantes para a determinação estrutural. Os sinais em δ 6,78 e em δ 7,32 apresentaram correlação com os carbonos δ 122,0, δ 144,9, δ 150,1 também correlação com a carbonila em δ 167,4. O hidrogênio com sinal em δ 7,27 apresentou correlação com os carbonos δ 116,6, δ 150,1 e δ 167,4. As correlações obtidas estão expressas na tabela 5.

Figura 9 - Espectro de RMN 1_{H da substância isolada S1 (DMSO-d}

6, 600 MHz).

Figura 10 - Espectro de RMN 1_{H (expansão na região de 6,5 a 7,4) da substância isolada} S1 (DMSO-d6, 600 MHz).

Experimentos de CLAE-DAD (item 3.3.3) de injeção da substância S1 com o padrão do ácido 3,4-diidroxibenzoico, conhecido como ácido protocatecuico, confirmaram a presença do pico com tempo de retenção de TR = 10,3 min e a

estrutura proposta (Figuras 11-13).

Figura 11 - Comparação entre os cromatograma da substância S1 e do padrão do ácido

3,4-diidroxibenzoico.

Condições cromatográficas: Coluna Hydro (25 cm x 4,6 mm x 4 µm). Vazão de 1 ml.min-1. Método

gradiente de 5% a 100% de MeOH, 30 min. 270 nm.

O espectro de absorção no UV da substância também se apresentou idêntico ao do padrão (Figura 12), com bandas de absorção em 260 nm e em 293 nm.

Figura 12 - Comparação entre os espectros de absorção no UV da substância S1 e do

padrão do ácido 3,4-diidroxibenzoico.

0.0 5.0 10.0 15.0 20.0 25.0 30.0 Retention Time [ min]

0 200000 400000 600000 800000 1000000 1200000 In te n si ty [ µ A U ] Amostra Padrão 200 250 300 350 400 Wavelength [ nm] 0 20 40 60 80 100 In te n si ty [ % ] 200 250 300 350 400 Wavelength [ nm] 0 20 40 60 80 100 In te n si ty [ % ] S1 Padrão

O ácido 3,4-diidroxibenzoico também conhecido como ácido protocatecuico, é um derivado do ácido benzoico encontrado em frutas, nozes e vegetais (SOARES, 2002). Esse ácido fenólico é utilizado como precursor na síntese de moléculas mais complexas, como a cianidina-3-O-β-D-glicosídeo e a vanilina (KAMPA et al., 2004).

Figura 13 - Estrutura da substância S1, o ácido protocatecuico.

Tabela 5 - Dados de RMN 1_H, 13_{C da substância S1.}

Posição 1H (J em Hz) 13C 1 - 121,7 2 7,32 (d, J = 2,0) 116,6 3 - 144,9 4 - 150,1 5 6,78 (d, J = 8,4) 115,2 6 7,27 (dd, J = 8,4 e 2,0) 122,0 7 - 167,4

O ácido protocatecuico pode ser classificado como um derivado do acido benzoico com um enorme potencial biológico que ocorre normalmente em mais de 500 espécies de plantas. Esses compostos fenólicos são metabólitos secundários derivados da fenilanilina e sintetizados a partir da via biológica do chiquimato. Esse ácido apresenta relato de atividades biológicas, dentre as quais podemos destacar como exemplo a presença de atividade antirradicalar, antitumoral, antiinflamatória, antifúngica, quimiopreventiva, além da utilização do mesmo para a prevenção de doenças cardiovasculares (REIS et al., 2010; KAKKAR; BAIS, 2014).

4.2 Identificação da substância S2

Como já exemplificado, também foi realizado um fracionamento por CLMP seguindo a metodologia descrita no item 3.3.5. Esse procedimento resultou em 11 frações analisadas por CCDC (Figura 14) de acordo com o item 3.3.6.

Figura 14 - Perfil por CCDC (item 3.3.6) das frações obtidas do fracionamento por CLMP.

Condições cromatográficas: As frações foram solubilizadas, uma alíquota foi aplicada em placa de sílica e a eluição ocorreu com o solvente CHCl3:MeOH:H2O (43:37:20 v/v/v), utilizando-se como

reveladores câmara de UV (254 nm - Chromatovue®) e NP-PEG.

O perfil por CCDC evidenciou que a fração 4 (92,6 mg) eluída sob condição de 55% de MeOH apresentava manchas pronunciadas, de modo que essa foi escolhido para purificação por cromatografia líquida de alta eficiência. Para isso, esta fração foi solubilizada em metanol (atingindo a concentração de 1,0 mg mL-1_),

uma alíquota passou por clean-up (item 3.3.2) utilizando cartucho SPE-C18 e

Figura 15 - Cromatograma CLAE-DAD da fração 4 proveniente do fracionamento descrito

em 3.3.5 de P. geniculatus.

Condições cromatográficas: Coluna Hydro (25 cm x 4,6 mm x 4 µm). Fluxo de 1 mL min-1_{. Método}

gradiente de 5% a 100% de MeOH, 60 min. 270 nm.

O cromatograma evidencia a presença de picos muito próximos, de modo que para prosseguir com estudos de identificação das substâncias presentes nessa fração precisou-se aperfeiçoar o método cromatográfico. Para isso, 92,6 mg da fração foram solubilizados em aproximadamente 9,2 ml de MeOH:H2O 1:1 (v/v) e

injetados em equipamento de CLAE-DAD analítico (item 3.3.3) utilizando-se de uma eluição isocrática com 15% de ACN. O cromatograma obtido está representado na figura 16.

Figura 16 - Cromatograma CLAE-DAD semipreparativo da fração 4 realizado de acordo

com o item 3.3.7.

Condições cromatográficas: Coluna Hydro semipreparativa (25 cm x 10 mm x 4 µm). Fluxo de 4 ml.min-1_{. Método isocrático 15% de ACN, 30 min. 270 nm.}

Pode-se verificar a partir da figura acima uma boa separação cromatográfica, de modo que foi possível realizar a purificação do pico 2 e posterior identificação do mesmo através da comparação com padrões presentes no banco de dados do laboratório. A análise do espectro de UV do pico 2 (Figura 17) mostrou uma absorção característica de um flavonoide, com a banda I (sistema cinamoil) em 346 nm e a banda 2 (sistema benzoil) em 277 nm. Essas absorções mostram-se semelhantes à de um padrão de um flavonoide derivado da quercetina isolado nos escapos de T. fluviatilis (AMORIM et al., 2014).

Figura 17 - Comparação entre o espectro de UV do pico 2 da fração 4 (CLMP) e do padrão

presente no laboratório isolado de T. fluviatilis.

Também se observou que esse pico apresentou um tempo de retenção (TR =

18,8 min) muito próximo ao observado para o padrão. Para a confirmação de que a substância presente no pico 2 (codificada como S2) é o flavonoide já isolado em T.

fluviatilis, realizou-se a purificação do mesmo por CLAE-DAD semipreparativo (item

3.3.7) e posteriormente a injeção sequencial do mesmo com a solução padrão, utilizando-se de duas condições cromatográficas diferentes para conferir seletividade à análise (Figura 18).

Figura 18 - Comparação do flavonoide 6-hidroxi-7-metoxiquercetina-3-O-β-D-

glucopiranosideo com a substância S2 isolada nos escapos de P. geniculatus.

Condições cromatográficas: Coluna Hydro (25 cm x 4,6 mm x 4 µm). Vazão de 1 ml.min-1_{. Método}

gradiente de 5% a 100% de MeOH, 30 min. 270 nm.

Como se verificou o mesmo tempo de retenção para as substâncias, pode-se atestar a presença do flavonoide 6-hidroxi-7-metoxiquercetina-3-O-β-D- glucopiranosideo (Figura 19) nos escapos de P. geniculatus.

Figura 19 - Estrutura da substância S2, o flavonoide 6-hidroxi-7-metoxiquercetina-3-O-β-D-

glucopiranosideo.

4.3 Identificação da substância S3

Com o pico 3 (TR = 27 min) da figura 16 também realizou-se um procedimento

de purificação por CLAE-DAD semipreparativo segundo a metodologia descrita no item 3.3.7.

Coletou-se o pico e realizou-se a concentração do mesmo em evaporador rotativo, obtendo uma massa de 5,2 mg. Para a elucidação estrutural dessa substância a mesma foi solubilizada em DMSO-d6 e analisada segundo técnicas

espectroscópicas de RMN mono e bidimensionais (item 3.3.8).

A análise dos deslocamentos químicos no espectro de RMN 1H (Figuras 20- 23) evidenciou sinais na região de hidrogênios aromáticos (δ 6-8 ppm) de modo que os sinais em δ 6,88 (d, J = 8,52 Hz) foram atribuídos ao H-5’, δ 7,52 (dd, J = 2,46 Hz e 8,46 Hz) ao H-6’ e δ 7,69 (d, J = 2,16 Hz) ao H-2’, indicando que o anel B do flavonoide apresenta-se hidroxilados nas posições 3’ e 4’. A presença de um simpleto em δ 6,91 referente ao H-8 determinou que o anel A do flavonoide apresenta-se penta-substituído. O sinal em δ 12,21 ppm indica a presença de uma hidroxila na posição 5 quelada com a carbonila da posição 4.

As informações dos espectros bidimensionais de gHSQC (1_J

H-C) e gHMBC

(2_J

H-C e 3JH-C) juntamente com os dados do espectro de RMN 1H forneceram

informações a respeito da presença de um açúcar na substância. O sinal em δ 5,01 (d, J = 7,44) corresponde ao carbono anomérico de um açúcar na configuração β, enquanto que a correlação a 3_{J com o carbono com δ 151,86 (C-7) confirmou que o}

entre δ 3,20-3,47 referem-se aos hidrogênios axiais dos carbonos do açúcar. Esse flavonoide apresenta-se como um flavonol pela presença de uma hidroxila na posição 3, o que é confirmado devido ao deslocamento químico da carbonila da posição 4 (menos blindado) (δ 176,57). Os demais deslocamentos químicos e correlações presentes estão descritos na tabela 6.

Figura 20 - Espectro de RMN 1_{H da substância isolada da fração 4 (DMSO-d}

6, 600 MHz).

Figura 21 - Espectro de RMN 1_{H (expansão na região de 4,4 a 5,8) da substância isolada da} fração 4 (DMSO-d6, 600 MHz).

Figura 22 - Espectro de RMN 1_{H (expansão na região de 6,4 a 8,6) da substância isolada da} fração 4 (DMSO-d6, 600 MHz).

Figura 23 - Espectro de RMN 1H (expansão na região de 9,0 a 12,6) da substância isolada

da fração 4 (DMSO-d6, 600 MHz).

Os demais sinais presentes foram comparados com dados da literatura (AQUINO et al., 2002; SANTOS et al., 2004; DE BEER et al., 2011) e permitiram identificar a substância S3 como um flavonoide derivado da quercetina (Figura 24).

Figura 24 - Estrutura da substância S3, o flavonoide 6-hidroxiquercetina-7-O-β-D-

glucopiranosideo.

Tabela 6 - Dados de RMN 1_H, 13_{C da substância S3.}

Posição 1_{H (J em Hz)} 13_C 2 - 148,0 3 - 136,0 4 - 176,5 5 - 148,6 6 - 130,1 7 - 151,9 8 6,91 (s) 116,2 9 - 148,8 10 - 105,4 1` - 122,3 2` 7,69 (d, J = 2,1) 115,9 3` - 145,7 4` - 148,2 5` 6,88 (d, J = 8,5) 116,0 6` 7,52 (dd, J = 2,4 e 8,4) 120,7 1`` 5,01 (d, J = 8,2) 102,8 2`` 3,58 (dd, J = 8,5; 7,5) 74,6 3`` 3,54 (d, J = 8,5) 77,3 4`` 3,44 (d, J = 8,5) 71,1 5`` 3,60 m 78,4 6`` 3,50 (dd, J = 12,0; 3,0) 3,74 (dd, J = 12,0; 3,0) 62,3

A partir dos resultados obtidos, verifica-se que a utilização da cromatografia líquida de alta eficiência para o isolamento e de espectroscopia de RMN para a

identificação permitram a obtenção de um ácido fenólico e de dois flavonoides derivados da quercetina nos escapos de P. geniculatus. As presenças dessas substâncias bem como os perfis cromatográficos obtidos corroboram com os estudos presentes na literatura.