5.1. EXPERIMENTO I: Estudo da estabilização com diferentes concentrações de metilformamida e glicerol sobre a viabilidade do sêmen pré e pós congelação
No período pós-estabilização as avaliações realizadas pelo sistema computadorizado (HTMA-IVOS-10) nos parâmetros de motilidade total e motilidade progressiva (Tabela 1 e Figura 1)14, observou-se diferença significante somente para motilidade progressiva entre o grupo Contr. (13.5%) versus o grupo MF2% (25,7%). Para os demais parâmetros avaliados, não houve diferença estatística entre os grupos estudados (Tabela 2 e Figura 2)15. Para as avaliações de integridade de membranas plasmática e acrossomal e potencial de membrana mitocondrial os resultados também não diferiram estatisticamente (Tabela 3 e Figura 3)16.
Para as avaliações realizadas com o sêmen descongelado, o parâmetro de motilidade total não apresentou diferença entre os grupos, quando utilizados os mesmos crioprotetores nas diferentes concentrações. Entretanto comparando-se os grupos em que foram utilizados diferentes crioprotetores (MF versus GL) e o grupo Contr., aos demais tratamentos, houve diferença significativa (p<0,05). O parâmetro de motilidade progressiva com o grupo Contr. se apresentou significativamente inferior (p<0,05) aos grupos da MF (0.9b, 13,4ª, 18ª e 18,3a, respectivamente para Contr., 2, 3 e 4,5% de MF), porém, não houve diferença entre os grupos utilizando GL e MF (p>0,05); (Tabela 4 e Figura 4)17.
Para os parâmetros de VAP, VSL, VCL, STR o grupo Contr. se apresentou inferior aos outros grupos estudados (p<0,05). Para a avaliação de LIN, o controle foi inferior aos demais tratamentos, com exceção do grupo MF
14 Vide p. 26 e 27, desta dissertação. 15 Vide p. 28 e 29, desta dissertação. 16 Vide p. 30 e 31, desta dissertação. 17 Vide p. 32 e 33, desta dissertação.
4,5% que se apresentou semelhante a todos os grupos. Para o parâmetro RAPID, não houve diferença entre os grupos onde foram utilizados os mesmos crioprotetores. Entretanto, comparando-se estes grupos (MF versus GL) houve diferença significativa de p<0,05 (1,5c, 22,5ab, 29,4ab, 32,6ª, 12,2bc, 16,6abc e
13,7bc, respectivamente para Contr., 2, 3 e 4,5% de MF e 2, 3 e 4,5% de GL);
(Tabela 5 e Figura 5)18.
Na avaliação da integridade da membrana plasmática e acrossomal, e potencial mitocondrial, não houve diferença significativa entre os grupos estudados (p>0,05); (Tabela 6 e Figura 6)19
18 Vide p. 36 e 37, desta dissertação. 19 Vide p. 38, desta dissertação.
Tabela 1 – Médias e desvios padrão referentes aos parâmetros, motilidade total (MT) e motilidade progressiva (MP), avaliados pelo sistema computadorizado (HTMA-IVOS-10) na comparação dos diferentes tratamentos estudados, pós-estabilização. TRATAMENTO PARÂMETROS (%) MT MP CONTROLE 53,9 + 21,4a 13,5 + 7b MF 2% 72,5 + 9,9a 25,7 + 10a MF 3% 68,1 + 15,6a 22,8 + 8,9ab MF 4,5% 65,1 + 16,9a 19,3 + 8,5ab GL 2% 61,7 + 20,0a 17,9 + 8,2ab GL 3% 60,9 + 17,1a 16,7 + 6,2ab GL 4,5% 57,8 + 14,6a 15,7 + 6,9ab
MF 2% (metilformamida a 2%), MF 3% (metilformamida a 3%), MF 4,5% (metilformamida a 4,5%), GL 2% (glicerol a 2%), GL 3% (glicerol a 3%), GL 4,5% (glicerol a 4,5%).
Médias seguidas de mesma letra, dentro da mesma coluna, na comparação dos tratamentos para cada variável, não diferem estatisticamente. Valor de p<0,01.
MF 2% (metilformamida a 2%), MF 3% (metilformamida a 3%), MF 4,5% (metilformamida a 4,5%), GL 2% (glicerol a 2%), GL 3% (glicerol a 3%), GL 4,5% (glicerol a 4,5%).
Figura 1 – Médias e desvios padrão referentes aos parâmetros, motilidade total (MT) e motilidade progressiva (MP), avaliados pelo sistema computadorizado (HTMA-IVOS-10) na comparação dos diferentes tratamentos estudados, pós- estabilização.
velocidade espermática real (VCL), linearidade (LIN), índice retilíneo (STR), percentual de espermatozóides rápidos (RAPID),
avaliados pelo sistema computadorizado (HTMA-IVOS-10), na comparação dos diferentes tratamentos estudados pós-estabilização.
TRATAMENTO PARÂMETROS
VAP VSL VCL STR LIN RAPID
CONTROLE 99,5 + 16,7 69,4 + 11,4 190 + 28,4 70,4 + 2,1 37,6 + 1,8 38,7 + 20,6 MF 2% 109 + 12,6 79 + 11,4 201 + 20,8 72,7 + 3,5 40,9 + 3,2 58,5 + 13,7 MF 3% 104 + 14,9 75,1 + 9,9 194 + 28,2 72,5 + 3,5 40,3 + 2,5 54,2 + 19,2 MF 4,5% 101 + 15,8 72,2 + 11,2 189 + 30,2 72,1 + 3,7 39,7 + 3,1 50,1 + 20,7 GL 2% 106 + 18,1 74,6 + 11,4 199 + 33,7 70,7 + 3,1 39,8 + 4,0 48,3 + 20,2 GL 3% 102 + 13,5 71,3 + 7,8 191 + 26,1 70,1 + 3,7 38,8 + 2,0 46,5 + 17,7 GL 4,5% 100 + 12,7 70,5 + 8,3 190 + 24,2 70,6 + 3,3 38,6 + 2,1 43,6 + 16,3
MF 2% (metilformamida a 2%), MF 3% (metilformamida a 3%), MF 4,5% (metilformamida a 4,5%), GL 2% (glicerol a 2 %), GL 3% (glicerol a 3%), GL 4,5% (glicerol a 4,5%).
MF 2% (metilformamida a 2%), MF 3% (metilformamida a 3%), MF 4,5% (metilformamida a 4,5%), GL 2% (glicerol a 2%), GL 3% (glicerol a 3%), GL 4,5% (glicerol a 4,5%).
Figura 2 – Médias e desvios padrão referentes aos parâmetros velocidade espermática ao longo de uma trajetória média (VAP), velocidade espermática considerando-se uma trajetória retilínea com origem no primeiro ponto analisado e final no último (VSL), velocidade espermática real (VCL), linearidade (LIN), índice retilíneo (STR), percentual de espermatozóides rápidos (RAPID), avaliados pelo sistema computadorizado (HTMA-IVOS-10), na comparação dos diferentes tratamentos estudados pós-estabilização.
Tabela 2 - Médias e desvios padrão referentes aos parâmetros integridade de membrana plasmática (IMP), integridade de membrana acrossomal (IAC) e potencial de membrana mitocondrial (PMM), avaliado através do microscópio de epifluorescência, na comparação dos diferentes tratamentos estudados, pós-estabilização. TRATAMENTO PARÂMETROS (%) IMP IAC PMM CONTROLE 45,1 + 4,9 79,9 + 6,8 44,8 + 6,4 MF 2% 52,1 + 7,5 82,1 + 5,3 41,3 + 10,4 MF 3% 54,3 + 9,7 82,8 + 7,6 42,8 + 12,9 MF 4,5% 53,9 + 9,8 84,1 + 7,7 42,6 + 12,1 GL 2% 49,4 + 8,2 82,6 + 5,8 42,7 + 10,6 GL 3% 51,1 + 7,9 82,5 + 5,9 40,9 + 13,4 GL 4,5% 49,8 + 9,1 83,9 + 7,7 44,2 + 11,4 MF 2% (metilformamida a 2%), MF 3% (metilformamida a 3%), MF 4,5% (metilformamida a 4,5%), GL 2% (glicerol a 2%), GL 3% (glicerol a 3%), GL 4,5% (glicerol a 4,5%).
MF 2% (metilformamida a 2%), MF 3% (metilformamida a 3%), MF 4,5% (metilformamida a 4,5%), GL 2% (glicerol a 2 %), GL 3% (glicerol a 3%), GL 4,5% (glicerol a 4,5%).
Figura 3 – Médias e desvios padrão referentes aos parâmetros integridade de membrana plasmática (IMP), integridade de membrana acrossomal (IAC) e potencial de membrana mitocondrial (PMM), avaliado através do microscópio de epifluorescência, na comparação dos diferentes tratamentos estudados, pós-estabilização.
Tabela 3 - Médias e desvios padrão do sêmen, referentes aos parâmetros motilidade total (MT) e motilidade progressiva (MP), avaliados pelo sistema computadorizado (HTMA-IVOS-10) na comparação dos diferentes tratamentos estudados, pós-descongelação. TRATAMENTO PARÂMETROS (%) MT MP CONTROLE 3,7 + 2,9d 0,9 + 0,7b MF 2% 33,4 + 18,2abc 13,4 + 10,3a MF 3% 44,2 + 13,9ab 18 + 8,6a MF 4,5% 50,9 + 18,4a 18,3 + 8,9a GL 2% 20,6 + 16,1cd 8 + 9,7ab GL 3% 26,3 + 17,1bc 10,7 + 8ab GL 4,5% 23,4 + 15,8bcd 8,3 + 7,7ab
MF 2% (metilformamida a 2%), MF 3% (metilformamida a 3%), MF 4,5% (metilformamida a 4,5%), GL 2% (glicerol a 2%), GL 3% (glicerol a 3%), GL 4,5% (glicerol a 4,5%).
Médias seguidas de mesma letra, dentro da mesma coluna, na comparação dos tratamentos para cada variável, não diferem estatisticamente. Valor de p<0,05.
MF 2% (metilformamida a 2%), MF 3% (metilformamida a 3%), MF 4,5% (metilformamida a 4,5%), GL 2% (glicerol a 2 %), GL 3% (glicerol a 3%), GL 4,5% (glicerol a 4,5%).
Figura 4 – Médias e desvios padrão do sêmen, referentes aos parâmetros motilidade total (MT) e motilidade progressiva (MP), avaliados pelo sistema computadorizado (HTMA-IVOS-10) na comparação dos diferentes tratamentos estudados, pós-descongelação.
Tabela 4 – Médias e desvios padrão do sêmen referentes aos parâmetros velocidade espermática ao longo de uma trajetória média (VAP), velocidade espermática considerando-se uma trajetória retilínea com origem no primeiro ponto analisado e final no último (VSL), velocidade espermática real (VCL), linearidade (LIN), índice retilíneo (STR), percentual de espermatozóides rápidos (RAPID), avaliados pelo sistema computadorizado (HTMA-IVOS-10), na comparação dos diferentes tratamentos estudados, pós-descongelação.
TRATAMENTO PARÂMETROS (%)
VAP VSL VCL STR LIN RAPID
CONTROLE 47,6b 37,1b 92,2b 54,7b 3b 1,5c MF 2% 84,5ª 67,4ª 153,5ª 79,8ª 46,7ª 22,5ab MF 3% 86,2ª 68,6ª 59,4ª 79,9ª 45,4ª 29,4ab MF4,5% 84,5ª 66,4ª 162,6ª 78,6ª 43,3ª 32,6ª GL 2% 78,6ª 62,4ª 146,8ª 78,8ª 45,4ª 12,2bc GL 3% 83,3ª 66,7ª 153,9ª 80,3ª 47,1ª 16,6abc GL4,5% 79,9ª 62ª 149,8ª 78,8 ª 45,1ª 3,7bc MF 2% (metilformamida a 2%), MF 3% (metilformamida a 3%), MF 4,5% (metilformamida a 4,5%), GL 2% (glicerol a 2%), GL 3% (glicerol a 3%), GL 4,5% (glicerol a 4,5%).
Médias seguidas de mesma letra, dentro da mesma coluna, na comparação dos tratamentos para cada variável, não diferem estatisticamente. Valor de p<0,05.
MF 2% (metilformamida a 2%), MF 3% (metilformamida a 3%), MF 4,5% (metilformamida a 4,5%), GL 2% (glicerol a 2 %), GL 3% (glicerol a 3%), GL 4,5% (glicerol a 4,5%).
Figura 5 – Médias e desvios padrão do sêmen referentes aos parâmetros velocidade espermática ao longo de uma trajetória média (VAP), velocidade espermática considerando-se uma trajetória retilínea com origem no primeiro ponto analisado e final no último (VSL), velocidade espermática real (VCL), linearidade (LIN), índice retilíneo (STR), percentual de espermatozóides rápidos (RAPID), avaliados pelo sistema computadorizado (HTMA-IVOS-10), na comparação dos diferentes tratamentos estudados, pós-descongelação.
Tabela 5 – Médias e desvios padrão do sêmen, referentes aos parâmetros integridade de membrana plasmática (IMP), integridade acrossomal (IAC) e potencial mitocondrial (PMM), avaliado pelo microscópio de epifluorescência na comparação dos diferentes tratamentos estudados, pós congelação.
TRATAMENTO PARÂMETROS (%) IMP IAC PMM CONTROLE 38,1+ 6 76,3 +8,6 14,3 + 3,1 MF 2% 42,5 + 6,8 79,8 +9,5 18,7 + 5,9 MF 3% 42,8 + 7,6 81,7 + 7,1 15,9 + 6 MF 4,5% 43,1 + 7,2 79,5 + 8,6 18 + 6,2 GL 2% 42,7+8,5 83 + 8 18,6 + 3,9 GL 3% 44,3+ 5,4 84,8 + 5,9 16,3 + 2,5 GL 4,5% 46,2 +7 81,7 + 7,7 14,6 + 3
MF 2% (metilformamida a 2%). MF 3% (metilformamida a 3%), MF 4,5% (metilformamida a 4,5%), GL 2% (glicerol a 2%), GL 3% (glicerol a 3%), GL 4,5% (glicerol a 4,5%).
MF 2% (metilformamida a 2%); MF 3% (metilformamida a 3%), MF 4,5% (metilformamida a 4,5%), GL 2% (glicerol a 2%), GL 3% (glicerol a 3%), GL 4,5% (glicerol a 4,5%).
Figura 6 - Médias e desvios padrão do sêmen, referentes aos parâmetros integridade de membrana plasmática (IMP), integridade acrossomal (IAC) e potencial mitocondrial (PMM), avaliado pelo microscópio de epifluorescência na comparação dos diferentes tratamentos estudados, pós congelação.
5.2. EXPERIMENTO II: Avaliação do efeito contraceptivo dos crioprotetores glicerol e metilformamida
Como demonstrado na Tabela 7 e Figura 7, a fertilidade não foi prejudicada no período pós-estabilização, com a exposição dos espermatozóides aos crioprotetores adicionados, pois não houve diferença significativa (p>0,05) entre os grupos estudados: Contr., MF3% e GL3%. O mesmo ocorreu entre os garanhões utilizados no teste de fertilidade.
Tabela 6 - Percentual de fertilidade por garanhão e total, após o período de estabilização (5°C / 1 hora) utilizando os grupos Contr., MF 3% (metilformamida 3%) e GL 3% (glicerol 3%).
ANIMAL CONTROLE MF 3% GL 3%
Garanhão1(n=24) 50 (4/8) 50 (4/8) 62,5 (5/8) Garanhão2(n=24) 62,5 (5/8) 37,5(3/8) 37,5 (3/8) Total (n=48) 56,25 (9/16) 43,75 (7/16) 50 (8/16)
Figura 7 – Percentual de fertilidade por garanhão e total, após o período de estabilização (5°C / 1 hora) utilizando os grupos Contr., MF 3% (metilformamida 3%) e GL 3% (glicerol 3%).