Etkileşimli (interaktif) karar verme yöntemleri

4.2.1 Privação de sono

Os animais foram submetidos à privação de sono pelo método das plataformas múltiplas modificado (SUCHECKI & TUFIK, 2000) durante 96 horas. Nesta técnica, os animais são colocados em um tanque (123x44x44 cm) com água, contendo plataformas circulares de 7 cm de diâmetro. As plataformas são disponibilizadas em número excedente para que os animais possam se movimentar livremente e a superfície de cada plataforma permanece acima do nível da água em aproximadamente 1,5 cm. Esse método abole completamente o sono REM e também reduz o sono NREM (sono de ondas lentas) em aproximadamente 40% (MACHADO et al., 2004).

No método adotado, o animal adormece sobre a plataforma e a cada momento de atonia muscular (evento característico do sono REM), encosta o focinho na água e, como conseqüência, acorda. Jouvet e colaboradores (1964) desenvolveram tal técnica para privação de sono REM em gatos e posteriormente, Cohen & Dement (1965) adaptaram-na para ratos.

Dois dias antes do início do experimento, os animais foram habituados ao método da privação de sono por 1 hora/dia, a fim de minimizar quedas desnecessárias dos animais na água, diminuindo assim o estresse ao método. A habituação foi realizada sempre no mesmo horário, aproximadamente às 14h00.

É importante ressaltar que os animais mantidos juntos no tanque de privação já conviviam na gaiola-moradia desde a separação materna. A manutenção de um grupo social estável durante todo o experimento diminui o estresse da técnica (SUCHECKI & TUFIK, 2000).

Todos os animais tiveram livre acesso à comida e à água durante todo o período de privação de sono e habituação ao tanque de privação.

4.2.2 Medição de Temperatura

A temperatura colônica dos ratos foi mensurada por um termômetro digital de haste flexível. No momento da medição, a base da cauda é levantada e a haste já lubrificada com óleo vegetal é inserida em aproximadamente 5 cm no reto do animal e mantido até que a temperatura atinja estabilidade, o que ocorre geralmente em 10 segundos. Os animais foram habituados previamente ao protocolo de medição de temperatura por cinco dias, uma vez por dia, sempre no mesmo horário, aproximadamente às 13h00 (horário também adotado para as medições durante o experimento). Tal procedimento foi realizado para minimizar as possíveis alterações na temperatura decorrente do manuseio do animal durante a medição.

4.2.3 Administração do Anticorpo Anti- IL-1

Para o bloqueio da IL-1 endógena circulante, os ratos foram submetidos à administração intraperitoneal (i.p.) de 2 µg/Kg de anticorpo anti-IL-1 (R&D Systems, AF 501 NA) durante 4 dias consecutivos, correspondentes aos momentos: basal (0 hora), 24, 48 e 72 horas de privação de sono, sempre no mesmo horário adotado (por volta das 14horas).

O conteúdo de uma ampola (100µg) foi preparado em 10 mL de PBS (phosphate buffered saline), resultando em uma solução estoque de concentração igual a 10 µg/mL. Em cada dia de administração, 1 mL da solução estoque era diluído em 4 mL do veículo PBS, a fim de se obter a concentração final de anticorpo a ser administrada (2 µg/Kg). O volume de solução administrada em cada animal seguia a proporção de 0,1 mL de solução para cada 100 g de massa corpórea.

A dose de anticorpo adotada (2 µg/Kg) foi baseada na curva de neutralização da atividade biológica da IL-1 , disponível no manual do produto.

4.2.4 Administração de Lipopolissacarídeo (LPS)

A administração de lipopolissacarídeo (LPS) (componente extraído da parede da bactéria Escherichia coli; O111:B4 - Sigma, L 2630) foi realizada para indução da febre a partir da produção de citocinas pró-inflamatórias, como a IL-1 , nos ratos. Os animais receberam administração aguda de 100 µg/Kg de LPS pela via intraperitoneal (i.p.). Tal dose baseia-se em dados da literatura que relatam aumento da temperatura (febre) em ratos e aumento de mediadores inflamatórios, tal como IL-1, após injeção de 100 µg/Kg de LPS por esta via (CARTMELL et al. 1998; CARTMELL et al. 2001; TURRIN et al., 2001). O aumento de temperatura produzido por essa dose de LPS assemelha-se àquele observado em animais privados de sono, cerca de 1°C (SEABRA & TUFIK, 1993; PALMA et al., 2009; YEHUDA et al., 2009).

4.3 DELINEAMENTO EXPERIMENTAL

4.3.1 Experimento I: Curva temporal da temperatura dos animais privados de sono

Objetivo específico: Identificar o momento em que se inicia o aumento de temperatura nas primeiras 24 horas de privação de sono.

Neste experimento foram utilizados 20 animais, sendo 10 pertencentes ao grupo controle (CTR) e 10 animais pertencentes ao grupo privação de sono (PS). Todos os animais foram habituados ao protocolo de medição de temperatura (5 dias) mas apenas os animais do grupo PS foram habituados à técnica de privação de sono (2 dias).

Após o período de habituação ao protocolo, todos os animais (n=20) foram submetidos a uma medição basal de temperatura (iniciada às 13h30min). Imediatamente após o término desta medição, os animais do grupo PS (n=10) foram submetidos à privação de sono enquanto que os animais do grupo controle (n=10) permaneceram em suas gaiolas-moradia.

Nas primeiras 24 horas de privação, a temperatura dos animais foi mensurada a cada 2 horas a fim de identificar o momento do aumento da temperatura. Para tanto, foi construída uma curva da temperatura corpórea desses animais. Terminadas as 24 horas, os animais continuaram na privação de sono até que se completassem as 96 horas, no entanto, foram submetidos à medição de temperatura apenas uma vez ao dia (sempre às 13h30min) (Figura 6).

Figura 6. Representação do desenho experimental I. Inicialmente foi realizada a habituação dos

animais à medição da temperatura e à técnica de privação. A seguir, mediu-se a temperatura basal dos animais, imediatamente antes à privação (0h) e, durante as primeiras 24 horas de privação, a cada 2 horas. Passadas as 24 horas, os animais foram submetidos apenas à uma medição diária da temperatura até o final do período de privação de sono (96 horas). Os animais do grupo CTR passaram pelo mesmo protocolo de medição de temperatura, mas foram mantidos nas gaiolas-moradia durante todo o experimento.

4.3.2 Experimento II: Bloqueio da IL-1 circulante dos animais privados de sono

Objetivo específico: Avaliar o efeito da administração do anticorpo anti-IL-1 na temperatura dos animais privados de sono.

Para a realização deste experimento os animais foram divididos em dois grupos experimentais:

o Grupo Controle (CTR): animais mantidos em suas gaiolas-moradia (n=20) - metade desse grupo recebeu anticorpo anti-IL-1 (n=10) e a outra parte, veículo (n=10);

HABITUAÇÃO