Elektrostatik Kavram Testi’nin Elektriksel Alan İle İlgili On Dördüncü Sorusunun Değerlendirilmesi İle İlgili Bulgular

Estudos sobre o sequenciamento do genoma de fungos têm revelado a presença de inúmeros genes desconhecidos, que codificam as enzimas responsáveis pela produção dos metabólitos secundários (CHEN et al., 2013). Os métodos de fermentação típicos como agitação em “shaker”, culturas estáticas ou artificialmente definidas são pobres em mimetizar o habitat natural dos fungos endofíticos. Como consequência, muitos genes responsáveis pela produção de metabólitos secundários não são expressos no ambiente artificial de laboratório; apenas um subconjunto de vias biossintéticas são expressas, limitando assim as perspectivas para realizar uma completa busca no potencial de descoberta de novos metabólitos bioativos em micro- organismos. Esta constatação sugere que novas alternativas devem ser utilizadas de

O OH OH O O O H O O O H O OH OR OH OH O OH XLIV R = SO3Na XLV R = H O O H O OH OH O OH OH OH OH XLVI

modo a mimetizar, de forma mais precisa, o habitat natural dos micro-organismos (WILLIAMS et al., 2008; CHEN et al., 2013).

Existem alguns métodos para mimetizar o ambiente natural dos endófitos ou alterar a produção metabólica tentando a maior expressão gênica das vias biossintéticas. Uma delas é a dependência da produção metabólica com as condições utilizadas no cultivo conhecido como OSMAC (do inglês one strain many compounds). A abordagem desse método resulta na observação de que pequenas alterações nas condições de cultivo podem mudar completamente o perfil metabólico de muitos micro-organismos (PARANAGAMA; WIJERATNE; GUNATILAKA, 2007). Com esta variação metabólica, novas entidades químicas podem ser produzidas e possivelmente com potencial a ser utilizados na terapêutica.

Outro método de modificar a produção metabólica de endófitos e aumentar a expressão de genes é a utilização dos manipuladores de genes, também conhecidos como modificadores epigenéticos. Esses modificadores atuam na transcrição do DNA alterando as rotas biossintéticas, ou ativando as rotas biossintéticas silenciosas (WILLIAMS et al., 2008).

O método de cultivo epigenético em fungos foi relatado por Williams e colaboradores (2008), demonstrando ser eficaz na produção de diferentes metabólitos secundários, indicando que está técnica é promissora e racional para a expressão natural das vias biossintéticas silenciosas.

Existem diferentes mecanismos epigenéticos, estes estão envolvidos nas alterações do epigenoma, que controla a acessibilidade transcricional dos genes que codificam as enzimas biossintéticas. Dos mecanismos epigenéticos, os mais estudados e conhecidos são a metilação do DNA e as modificações das histonas (CICHEWICZ, 2010; FISCH et al., 2009).

O DNA é modificado pós-translacional em fungos pelas enzimas DNA metiltransferases (DNMTs), resultando na conversão da citosina em seu correspondente 5-metilcitosina (Figura 10). A metilação do DNA ocorre quase exclusivamente em dinucleotideos CpG (pares de Citosina-fosfato-Guanina) de células diferenciadas e tem uma importante função na regulação da expressão gênica e no silenciamento de elementos repetitivos do genoma (CICHEWICZ, 2010; CHERBLANC et al., 2013).

A metilação do DNA é um traço hereditário, mas esta marca epigenética pode ter estabilidade limitada durante contínuos repiques. Manipulações genéticas, resultando em alteração de metilação do DNA têm sido estudadas e estas tendem a resultar em fenótipos modificados drasticamente, incluindo desenvolvimento sexual e a aberração no comportamento cromossômico (replicação do DNA anormal ou segregação cromossômica) (CICHEWICZ, 2010).

Figura 10: Metilação do resíduo Citosina do DNA

N N H NH₂ O N N H NH₂ O C H3 DNA metiltransferase Citosina 5-metilcitosina

As histonas são proteínas associadas à cromatina e possuem duas importantes funções. Encontram-se sob a forma da estrutura básica de condensação do DNA, o nucleossomo, e participam no controle da regulação transcricional, que é essencial para o bom funcionamento celular (CICHEWICZ, 2010). O nucleossomo é a unidade básica da cromatina e é composto por dois complexos idênticos, cada um constituído de 4 proteínas histonas, que formam um octâmero. As proteínas histonas presentes em cada nucleossomo são: a H2A, H2B, H3 e H4. Duas voltas da molécula de DNA incorporam-se a esta estrutura, que tem também a proteína histona H1 associada ao DNA, contribuindo para sua condensação (MULLER; PRADO, 2008).

As modificações das histonas regulam as funções da cromatina alterando a acessibilidade do DNA aos diferentes fatores que atuam em trans, como as enzimas de transcrição, ou pelo recrutamento de proteínas específicas que reconhecem as modificações ocorridas nas histonas. As principais modificações são as acetilações, metilações e fosforilações, que ocorrem nos resíduos N-terminais dos amino ácidos presentes nas histonas (CICHEWICZ, 2010; FISCH et al., 2009; MULLER, PRADO 2008).

A acetilação do grupo 3-amino da lisina é a mais estudada modificação pós- traducional em histonas de fungos. O processo de acetilação e desacetilação da lisina é realizado por dois grupos de enzimas: histonas acetiltransferases (HATs) e histonas

deacetilases (HDAC), respectivamente. A acetilação do resíduo lisina diminui a sua afinidade de ligação com o DNA (Figura 11), o que contribui para uma transição entre o estado da cromatina “aberta” e “fechada”, que estão envolvidos na regulação da expressão ou não dos genes, respectivamente (CICHEWICZ, 2010).

Figura 11: Acetilação do resíduo lisina encontrado nas histonas e sua interação com o DNA

Fonte: CICHEWICZ, 2010

Metilação de resíduos de lisina e arginina representam outro conjunto de modificações pós-traducionais que são frequentemente encontrados. Considerando que a acetilação da lisina normalmente leva à inibição da transcrição, os efeitos de metilação são variadas e vão desde a ativação ou silenciamento de genes. A metilação de resíduos de lisina e arginina é realizada por diferentes conjuntos de enzimas que exibem especificidades distintas para as funções -amino ou -guanidina (CICHEWICZ, 2010; CHERBLANC et al., 2013).

Uma série de pequenas moléculas surgiram como ferramentas e tem permitido o desenvolvimento de técnicas epigenéticas químicas (Figura 12), essas moléculas são capazes de seletivamente ou semi-seletivamente inibir a DNA metiltranferase (DMNT) ou a histona deacetilase (HDAC) alterando o processo de transcrição do DNA. Essas moléculas ainda são orientadas a examinar como os recursos epigenéticas regulam os processos biológicos, o que inclui a regulação de mecanismos biossintéticos envolvidos na geração de metabólitos secundários (CICHEWICZ, 2010).

Figura 12: Exemplos de moléculas utilizadas como modificadores epigenéticos

Os modificadores epigenéticos podem ser empregados para expressar vias biossintéticas silenciosas e melhorar a produção de metabólitos secundários de fungos (WILLIAMS et al., 2008). As vias biossintéticas silenciosas são uma fonte rica de diversos compostos químicos (características estereoquímicas, incorporação de heteroátomo, etc.) com excelente potencial para a geração de novos derivados terapêuticos (FISH et al., 2009).

Essa técnica tem sido utilizada por diversos grupos de pesquisa e tem-se comprovada a sua eficiência. Chen e colaboradores (2013) isolaram dois novos compostos (XLVII e XLVIII) no cultivo de Fusarium oxysporum tratado com SAHA (inibidor de DMNT). Chung e colaboradores (2013) observaram a mudança da produção metabólica do fungo Beauveria felina cultivado com SAHA, isolando três compostos diferentes não encontrados no controle, sendo dois inéditos (XLVIX e L). Beau et al. (2012) obtiveram um aumento da produção de três compostos antimicrobianos (LI, LII e LIII) na cultura de Staphylococcus aureus tratada com butirato de sódio (inibidor de HDAC). Asai et al. (2012a) obteveram alteração do perfil da produção metabólica do fungo entomopatogênico Gibellula formosana no cultivo

com os dois modificadores epigenéticos SBHA e RG-108 (inibidor de HDAC e inibidor de DMNT, respectivamente), comparando com o controle ou o cultivo com os modificadores separadamente, sendo isolado 8 compostos novos (LIV-LXI). Asai et al. (2012b) isolaram uma substância nova com esqueleto policetídeo (LXII) no cultivo de Isaria tenuipes na presença dos dois modificadores epigenéticos SBHA e RG-108.

Essa técnica exibe várias vantagens em relação às técnicas existentes disponíveis. A principal é que fornece uma ferramenta para o acesso rápido aos produtos naturais de fungos presentes apenas em seus hospedeiros nativos. Essa metodologia pode ser facilmente implantada na maioria dos laboratórios sem a necessidade de equipamentos caros, e os custos e esforços para obter informações sobre as vias metabólicas silenciosas são reduzidos, uma vez que não é necessário fazer uma varredura pré-selecionando fungos utilizando diferentes condições de cultivo (WILLIAMS et al., 2008).

2 OBJETIVOS