Elektrostatik Kavram Testi’nin Elektriksel Kuvvet İle İlgili On Beşinci Sorusunun Değerlendirilmesi İle İlgili Bulgular

O estudo fitoquímico bioguiado fornece uma ferramenta que pode ser usada para testar a atividade alvo em uma amostra específica. Bioensaios em um “screening” devem ser rápidos, simples, capazes de serem automatizados, de baixo custo e produzir alta rentabilidade (SPAINHOUR, 2005).

4.5.1 Ensaio citotoxico

Câncer é uma doença que afeta milhares de pessoas em todo o mundo, estimativas sugerem que esta doença matou cerca de 7,6 milhões de pessoas ao redor do mundo, e este número pode chegar a 17,5 milhões até 2050. É um grupo de doença que afeta diversos órgãos do corpo humano, e é caracterizado pelo crescimento descontrolado de células anormais e invasão em tecidos saudáveis. As células cancerígenas podem também se espalhar para outras partes do corpo e produzir novos tumores. O tratamento de câncer ainda é limitado para diversos tipos da doença, e a presença de diversos tumores resistentes a drogas existentes é um problema para a eficiência do tratamento (KHARWAR et al., 2011).

A procura por produtos naturais com potencial anticâncer tem levado à descoberta e desenvolvimento de diversos fármacos anticancerígenos (como, a vimblastina, vincristina, taxol, camptotecina, etc.), a descoberta de novas drogas anticancerígenas pode ser um dos principais objetivos dos produtos naturais e química medicinal para auxiliar no tratamento da doença (CHANDRA, 2012).

A atividade citotóxica de todas as amostras está apresentada na Tabela 3 com seus respectivos percentuais de inibição. Somente os extratos que apresentaram valores de inibição ≥ 75% em pelo menos duas linhagens tumorais são considerados ativos, valor esse considerado como cut-off para o screening de novas substâncias com potencial antitumoral.

Tabela 3: Percentual de inibição do crescimento celular (IC%) das amostras em três

linhagens tumorais testadas na dose única de 50 µg mL-1 _{Valores são média ± DPM.}

Amostra HCT-8

GI% (media) SD MDAMB-435 GI% (media) SD GI% (media) SF-295 SD

Ej-f1 20,49% 8,53% 15,49% 13,63% 7,47% 7,98% Ej-f2 19,01% 7,30% 23,35% 1,79% 9,25% 18,85% Ej-f3 76,10% 1,53% 59,01% 3,47% 69,70% 0,64% Ej-c1 14,24% 8,90% 23,01% 3,94% -1,35% 27,15% Ej-c2 12,68% 8,65% 22,08% 1,67% 5,93% 1,80% Ej-c3 100,74% 0,18% 99,75% 0,12% 98,82% 0,00% Ej-c4 11,38% 6,81% 23,43% 5,02% 5,38% 4,50% Amostra HCT-8

GI% (media) SD OVCAR GI% (media) SD GI% (media) SF-295 SD

Ej-fm1 99,14% 0,36% 88,60% 8,57% 75,03% 2,88% Ej-fv1 10,75% 8,73% 9,98% 1,23% 3,82% 2,56% Ej-fv2 22,79% 4,18% 13,62% 3,78% 20,09% 0,83% Ej-fv3 1,83% 16,49% 2,14% 2,69% 7,97% 0,38% Ej-fv4 6,21% 1,33% 8,87% 9,73% 8,78% 22,44% Ej-fv5 11,67% 14,25% 4,97% 8,86% 7,74% 3,40%

Na avaliação da atividade antitumoral observa-se (Tabela 3) que os fungos codificados como Ej-c3 e Ej-fm1 apresentaram forte inibição do crescimento das linhagens testadas, evidenciando a produção de substâncias citotóxicas.

4.5.2 Ensaio anticolinesterásico

Os fármacos atualmente utilizados no tratamento do mal de Alzheimer ou doença de Alzheimer, que é uma doença neurodegenerativa progressiva do sistema nervoso central, são principalmente inibidores da enzima acetilcolinesterase (AChE), por apresentarem melhores resultados no controle da doença (VIEGAS JUNIOR et al., 2004). Alguns exemplos desses fármacos são a tacrina, fisistigmina e a galantamina, que é de origem natural (CARDOSO, 2003). A galantamina tem sido usada como protótipo para o desenvolvimento de drogas inibidoras de AChE. A possibilidade de explorar distintos modos de ação tem estimulado estudos fitoquímicos visando a obtenção de novos modelos, com isso, várias espécies tem sido investigadas como fontes de inibidores de AChE (VIEGAS JUNIOR et al., 2005).

A avaliação da atividade anticolinesterásica em potencial dos extratos brutos foi realizada segundo a metodologia de Marston, Kissling e Hostettmann (2002) por cromatoplaca. Após a eluição dos extratos e o borrifamento das soluções, a coloração roxa aparece em aproximadamente 2 minutos. O aparecimento de manchas brancas (indicação de inibição da reação enzimática) em alguns extratos, sobre o fundo de coloração roxa, indica a inibição da enzima acetilcolinesterase.

Este ensaio é qualitativo e é definido através do halo branco em fundo roxo, para atividade inibitória positiva. De acordo com o observado na Tabela 4 praticamente todos os extratos apresentaram atividade positiva neste ensaio, apenas o extrato do fungo Ej-f3 não apresentarou resultado positivo. Este resultado evidencia a potencialidade dos fungos endofíticos na produção de metabólitos com potencial anticolinesterásico.

Tabela 4: Fator de Retenção das substâncias que apresentaram inibição da enzima

acetilcolinesterase (sílica gel – eluente Hex:AcOEt 3:7)

Extratos brutos RF Ej-f1 0,6 Ej-f2 0,8 Ej-f3 - Ej-c1 0,8 / 0,4 / 0,4 / 0,1 Ej-c2 0,8 / 0,4 / 0,1 Ej-c3 0,6 Ej-c4 0,8 / 0,4 / 0,1 Ej-fm1 0,0 Ej-fv1 0,0 Ej-fv2 0,0 Ej-fv3 0,0 Ej-fv4 0,0 Ej-fv5 0,3 / 0,0 Fisostigmina 0,3

4.5.3 Ensaio antifúngico

A atividade antifúngica foi determinada por bioautografia pela nebulização dos fungos C. cladosporioides e C. sphaerospermum. Após a revelação da cromatoplaca (contendo os extratos) com a solução fúngica, foi observada a inibição do crescimento dos fungos em vários extratos, indicando a atividade antifúngica potencial. O padrão utilizado para comparação foi a nistatina (5 μg). Os resultados obtidos deste bioensaio estão presentes na Tabela 5 e Figura 42.

Tabela 5: Fator de Retenção das substâncias que apresentaram inibição no crescimento

dos fungos fitopatógenos (sílica gel – eluente Hex:AcOEt 3:7)

Amostras C. cladosporioides C. sphaerospermum

Ej-f1 * 0,0/0,6 Ej-f2 * 0,6 Ej-f3 * rastro Ej-c2 * 0,2 Ej-c3 * 0,6 Ej-c4 * - Ej-fm1 0,4/ 0,2/ 0,0 0,4 / 0,2 / 0,1 Ej-fv1 0,4 / 0,2/ 0,1 0,4 / 0,2 / 0,3 Ej-fv2 0,1 0,1/ 0,05 Ej-fv3 0,258 / 0,094 0,3 Ej-fv4 0,3/ 0,2/ 0,05 0,2 / 0,05 Ej-fv5 0,3 / 0,2 / 0,05 0,2 / 0,05 *não testados

Os resultados da avaliação deste bioensaio evidenciaram que os extratos brutos são potencialmente antifúngicos, somente o Ej-c4 não apresentou atividade positiva. Os extratos presentaram inibição do crescimento dos testados.

Figura 42: Placas de CCDC obtida no ensaio antifúngico para os extratos obtidos dos

fungos endofíticos (sílica gel – eluente Hex:AcOEt 3:7)

Esses dados podem estar diretamente relacionados à ecologia química do fungo, onde os micro-organismos endofíticos produzem substâncias bioativas para autodefesa contra micro-organismos fitopatógenos. Deste modo, os fungos associados a espécies vegetais são promissoras fontes na busca por novos metabólitos secundários com atividade antifúngica.

4.5.4 Ensaio antioxidante

A propriedade antioxidante está relacionada com as atividades anti- inflamatórias e quimiopreventivas, e estas são necessárias para proteger o organismo contra as doenças provocadas pelo estresse oxidativo. O estresse oxidativo é o maior causador de isquemia cerebral, pois o cérebro consome grande quantidade de oxigênio. A geração de radicais livres de maneira desordenada no corpo humano provoca danos oxidativos em macromoléculas biológicas como lipídeos, proteínas e DNA, alterando suas propriedades, estruturas, funções das membranas celulares e do material genético. Os danos causados por radicais livres estão ligados a doenças neurodegenerativas e ao câncer. A oxidação das lipoproteínas de baixa densidade (LDL) é a principal causa de doenças do coração e arteriosclerose (SHIN; PARK; KIM 2006). Legenda: 1 - Ej-fm1 2 - Ej-fv1 3 - Ej-fv2 4 - Ej-fv3 5 - Ej-fv4 6 - Ej-fv5 P – nistatina (5µg)

As propriedades antioxidantes das substâncias estão relacionadas a vários mecanismos de ação, incluindo a captura de radicais livres e a inibição da geração de espécies reativas durante o metabolismo celular (ZHANG et al., 2008).

Ensaios rápidos e baratos utilizando β-caroteno e DPPH foram desenvolvidos no intuito de detectar a presença de substâncias potencialmente antioxidantes em extratos brutos.

A avaliação qualitativa dos extratos por cromatoplaca em sílica gel, revelada com solução metanólica do radical DPPH (0,2%), demonstrou para os extratos a existência de substâncias com atividade antioxidante, evidenciadas pela presença de manchas amarelas sobre fundo púrpuro, resultantes da redução do radical DPPH. Os resultados obtidos estão demonstrados na Tabela 6. Apenas o extrato do fungo Ej- fv1 não apresentou substâncias com potencial antioxidante.

Tabela 6: Tempo de Retenção das substâncias que apresentaram potencial antioxidante

(sílica gel – eluente Hex:AcOEt 3:7)

Extratos brutos RF Ej-f1 0,9/0,8/0,6/0,0 Ej-f2 0,9/0,8/0,6/0,0 Ej-f3 0,8/0,6/0,0 Ej-c1 0,9 Ej-c2 0,9 Ej-c3 0,9/0,8 Ej-c4 0,9/0,8 Ej-fm1 0,9/0,8/0,6/0,0 Ej-fv1 - Ej-fv2 0,9/0,9/0,8/0,3/0,0 Ej-fv3 0,9/0,8/0,0 Ej-fv4 0,9 Ej-fv5 0,9

A triagem química e biológica realizada para os fungos endofíticos isolados de

E. jambonala apresentaram resultados bastante satisfatórios. Após avaliação da

possível selecionar dois fungos para cultivo em escala ampliada e isolamento dos metabólitos produzidos por estes. Com os resultados obtidos os fungos identificados como Saccharicola sp. (Ej-c3) e Botryosphaeria parva (Ej-f1) foram selecionados para o estudo químico. Em uma revisão na literatura (SciFinder e Web of Science) sobre essas espécies notou-se que não há relatos do estudo químico das mesmas.