As quatro enzimas foram incubadas na presença de suportes DVS-ativados sob diferentes condições, e os resultados são mostrados nas Figuras 5.1 a 5.4. Entre as condições estudadas, os detergentes podem ser uma variável importante. Em primeiro lugar, as lipases em solução podem produzir agregados biomoleculares, com a forma aberta de uma lipase interfacialmente ativada por outra forma aberta da outra lipase (PALOMO et al., 2003; FERNANDEZ-LORENTE et al., 2003; PALOMO et al., 2004; PALOMO et al., 2005; FERNANDEZ-LORENTE et al., 2007). Isto significa que a imobilização covalente na ausência de detergente pode ser complexa, com monômeros e dímeros a serem imobilizados. Em segundo lugar, os suportes ativados com DVS apresentam uma camada moderadamente hidrofóbica. Considerando-se que o glutaraldeído é suficiente para forçar a ativação
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interfacial de CALB (BARBOSA et al., 2012), não é descartado que esta camada de grupos DVS pode ser reconhecida como uma superfície hidrofóbica por lipases e estas podem tornar- se imobilizada sobre ele.
No entanto, é conveniente ter em mente que os detergentes podem ter um efeito complexo sobre as propriedades de enzimas, em alguns casos, conduzir à inativação (MOGENSEN; SEHGAL; OTZEN, 2005). Para as enzimas utilizadas, PFL e RML podem ser tratadas usando triton X100 (FERNANDEZ-LORENTE et al., 2007), CTAB para TLL (FERNANDEZ-LORENTE et al., 2007) e SDS para Lecitase (DOS SANTOS et al., 2014).
A pH 10 e na ausência de detergente, PFL e RML foram imobilizadas sobre o suporte (em diferentes taxas) com baixa atividade de recuperação. A adição de Triton X100 para quebrar os dímeros de enzimas melhorou a taxa de imobilização, mas não melhorou a atividade recuperada.
Figura 5.1. Perfis de imobilização de Lecitase sobre DVS-agarose em diferentescondições. Painel (A): Perfis de imobilização de Lecitase sobre DVS-agarose sem detergente e a pH 10: círculos, linha preta sólida: suspensão pH10; círculos, linha tracejada: pH10 sobrenadante; Painel (B): perfis de imobilização de Lecitase sobre DVS- agarose sem detergente e em pH 5: Triângulos, linha preta sólida: pH 5 - suspensão; Triângulos, linha tracejada: PH5 - sobrenadante. O painel (C): Perfis de imobilização de Lecitase sobre DVS-agarose na presença de 0,01% de SDS e a pH 5: quadrados, linha preta sólida: suspensão pH 5; quadrados, linha tracejada: pH5 sobrenadante. As condições experimentais estão detalhadas na Seção 5.3.
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O uso de um valor de pH mais baixo (pode diminuir a reatividade da enzima com o suporte) não promoveu qualquer melhoria significativa da atividade, tornando apenas mais lenta a imobilização. No caso da RML, a atividade da enzima imobilizada foi insignificante, e a pH 10, a taxa de imobilização sofreu uma grande redução. PFL deu um máximo de 20% na atividade, e imobilização levou a inativação enzimática imediata em todas as condições experimentais testadas.
Figura 5.2. Perfis de imobilização de RML na DVS-agarose sob diferentes condições. Painel (A): Perfis de imobilização de RML sobre DVS-agarose na presença de 0,01% de TRITON X-100 e a pH10: círculos, linha preta sólida: suspensão pH 10; círculos, linha tracejada: sobrenadante pH10; Painel (B): perfis de imobilização de RML em DVS-agarose sem detergente e em pH 5: Triângulos, linha preta sólida: suspensão pH 5; Triângulos, linha tracejada: sobrenadante pH5. Painel (C): Perfis de imobilização de RML sobre DVS-agarose na presença de 0,01% de Triton X-100 e a pH 5: quadrados, linha preta sólida: suspensão pH 5; quadrados, linha tracejada: pH5 sobrenadante. As condições experimentais estão detalhadas na Seção 5.3.
Fonte: Elaborada pelo autor.
Lecitase (Figura 5.1) foi rapidamente imobilizada a pH 10, mas a atividade diminuiu de uma forma progressiva até que a preparação se tornou completamente inativa depois de 24 h. Após a cinética de inativação, esta inativação não foi relacionada com a primeira imobilização como com as enzimas anteriores, mas por uma fixação covalente multipontual entre a enzima e o suporte. Resultados semelhantes foram obtidos a pH 5, a
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imobilização é mais lenta, mas a atividade da enzima diminuiu progressivamente após imobilização. A adição de SDS fez reduzir a recuperação de atividade, embora a reduzida taxa de imobilização em oposição às outras duas enzimas (talvez esta enzima possa sofrer, na ausência de detergente, alguma ativação interfacial contra a superfície do suporte).
Figura 5.3. Perfis imobilização de PFL no DVS-agarose em condições diferentes. Painel (A): Perfis de imobilização de PFL sobre DVS-agarose na presença de 0,01% e pH 10: círculos, linha preta sólida: suspensão pH 10; círculos, linha tracejada: sobrenadante pH10; Painel (B): perfis de imobilização de PFL no DVS-agarose sem detergente e em pH 5: Triângulos, linha preta sólida: suspensão pH 5; Triângulos, linha tracejada: sobrenadante pH5. Painel (C): Perfis de imobilização de PFL sobre DVS-agarose na presença de 0,01% de CTAB e a pH 5: quadrados, linha preta sólida: suspensão pH 5; quadrados, linha tracejada: sobrenadante pH5. As condições experimentais estão detalhadas na Seção 5.3.
Fonte: Elaborada pelo autor.
TLL foi a enzima que apresentou melhor desempenho de imobilização sobre este suporte (Figura 5.4). Na ausência de CTAB, a pH 10, a enzima é imobilizada de uma forma muito rápida (imobilização completa após 4 h), enquanto que a pH 7, a imobilização só atinge uma redução de 50% (da proteína inicial) e a pH 5, inferior a 25% após 24 h. Este resultado, sabendo-se da reatividade química dos grupos reativos da proteína, sugere que a enzima é diretamente imobilizada sobre o suporte por meio de reações covalentes e através de um outro mecanismo (Capítulo 3 desta tese).
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Figura 5.4. Imobilização de TLL no DVS-agarose na ausência (painel A) ou presença de 0,01% (v/v) CTAB (painel B). As condições experimentais estão detalhadas na Seção 5.3. Círculos, linha preta sólida: suspensão pH 5; círculos, linha tracejada: sobrenadante pH 5; Quadrados, linha preta sólida: suspensão pH 7; Quadrados, linha tracejada: sobrenadante pH 7; Triângulos, sólida linha preta: suspensão pH10; Triângulos, linha tracejada: sobrenadante pH10.
Fonte: Elaborada pelo autor.
Em todos os casos, a retenção de atividade é bastante elevada, é curiosamente superior a pH 10 e o mínimo é em pH 7, a reatividade do suporte diminui junto a redução do valor do pH. A adição de 0,01% de CTAB (Figura 5.4b) não produziu uma diminuição da taxa de imobilização, mas sim um incremento desta taxa em todos os valores de pH estudados (70% da TLL é imobilizada a pH 7 e mais do que 30% a pH 5). Este fato poderia ser explicado pela quebra dos dímeros lipase-lipase de TLL (PALOMO et al., 2003; FERNANDEZ-LORENTE et al., 2003) e isto, de alguma forma, facilita a imobilização de moléculas de TLL em DVS-agarose.
A Figura 5.5 mostra que TLL não se tornar interfacialmente ativada pelo suporte ativado com DVS; muito provavelmente, a hidrofobicidade moderada do suporte não é capaz de "quebrar" os dímeros TLL. A retenção da atividade após a imobilização da enzima permaneceu muito elevada a pH 10 e pH 5, sendo ligeiramente inferior em pH 7. Em seguida, seguiu-se com a otimização e caracterização mais profunda das preparações DVS-TLL obtidos na presença de CTAB, onde a enzima deve estar em uma forma monomérica antes da imobilização sobre o suporte DVS.
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Figura 5.5 Imobilização de TLL em suporte-DVS inativado. O suporte foi incubado por 24 h em NaOH 0,1 M para destruir os grupos vinilsulfona. Círculos, linha preta sólida: sobrenadante sem CTAB; quadrados, linha preta sólida: sobrenadante com 0,01% de CTAB.
Fonte: Elaborada pelo autor.