AYIRMA TEKNİKLERİ

-186-8.1. K R O M A T O G R A F İ

Kromatografi ilk olarak 1903 yılında bir Rus biyokimyacısı olan Tsweet tarafından yeni bir ayırma tekniği olarak bulunmuştur. Bu araştırmacı çok iyi toz edilmiş bir absorban ile doldurulmuş bir kolondan bitki ekstreleri geçirildiğinde renkli halkaların kolonda ayrıldığını görmüş. Bu nedenle yöntem kromatografi olarak adlandırılmıştır, olarak adlandırılmıştır. Bu yöntem adsorpsiyona dayalıdır. Tsvvett'im buluşundan sonra yöntem yaklaşık 25 sene kadar unutulmuş, daha soma tekrar ele alınıp yemden detayları ile araştırılmış ve rutin analitik işlemlerde kullanılmaya başlanmıştır. Partisyon kromatografisi 1941 yılında kullanıma girmiştir. Daha soma bu konuda yapılan çalışmalar ile 1948 de A.W.K. Tiselius, soma 1952 de A J.P.Martin ve R.L.M. Synge Nobel ödülü almışlardır.

Kromatografi, analitik kimyacdar için çok önemli olup değişik ayırma yöntemlerim içerir ve kanşımlardaki maddelerin birbirlerinden ayrılmaları, izole edilmeleri ve dana soma tanınmaları ve miktar tayinleri edilmelerine olanak sağlar. Kromatografi teriminin tarifi kesin olarak yapılamamasına karşılık genel olarak kramatografi; bir karışımdaki bileşenlerin hareketli fazın (mobile phase) etkisi ile sabit faz (stationary phase) boyunca değişik hızlarda hareket ederek birbirlerinden ayrılma temeline dayalı bir yöntemdir.

Kromatografi, maddelerin iki veya daha fazla fazdan meydana gelmiş, ki bunlardan birisi devamlı olarak bir yönde hareket etmektedir, bir sistem içerisinde dinamik bir farklılarıma yürüyüşü (migration) yardımıyla birbirlerinden ayrılmaları işlemi olarakta tanımlanabilir.

Bu işlemde; ayrılacak olan bileşikler bu sistem içerisinde adsorpsiyon, partitisyon, çözünürlük, buhar basıncı, molekül büyüklüğü veya iyonik yük yoğunluğu gibi karekterlerindeki farklılıklar nedeniyle farklı hareketlilikler gösterirler ve birbirlerinden ayrılırlar.

Genel kromatografik tekniklerde biri sabit diğeri hareketli olan iki faz arasında çözünen maddenin dağılmaya uğraması temel işlemdir. Hareketli faz ayrılacak maddeleri ortamda birbirlerinden daha önce veya soma hareket edecek şekilde taşımak görevim üstlenir. Genel olarak, ayrılacak madde ayrılma ortamı boyunca bir gaz veya sıvı akımı (eluant) yardımıyla taşınır. Sabit faz, aktive edilmiş alumina, silika jel ve iyon değiştirici reçineler gibi adsorbanlann olduğu bir ortamda adsorpsiyona, veya ayrılacak maddeyi

-187-önce çözüp sonra sabit ve hareketli faz arasında dağılmaya uğratarak partisyona neden olur. Partisyon işleminde inert bir katı (support) üzerine kaplanmış bir sıvı sabit faz görevini yapar. Bu anlatılan işlemlere göre genel olarak kromatografi; sabit fazın katı olduğu Adsorpsiyon kromatografi ve sıvı olduğu Partisyon kromatografi olmak üzere iki ana grup altında toplanabilir. Adsorpsiyon kromatografisinde maddeler adsorbana tutunma güçlüklerinde farkklıklar, partisyonda ise birbirine karışmayan iki sıvı arasındaki dağılmalarının farklılığı nedeniyle birbirlerinden ayrılırlar.

Kromatografik yöntemler önce hareketli fazın yapısına göre, ikinci olarakta sabit fazın yapısına göre adlandırılırlar. Buna göre genel şartlarda kromatografi aşağıdaki gibi bir tablo halinde sınıflandırılabilir :

KROMATOGRAFİ

Adsorpsiyon Partisyon (Sabit faz katı) (Sabit faz sıvı)

katı-sıvı gaz-katı sıvı-sıvı gaz sıvı

kromatografi kromatografi kromatografi kromatografi (hareketli faz sıvı) (hareketli faz gaz) (hareketli faz sıvı) (hareketli faz gaz)

a) Sıvı-sıvı kromatografisinde; klasik adsorpsiyon kromatografi, ince tabaka kromatografisi (thin layer chromatography), Jel kromatografisi (gel chromatography)

b) Gaz- katı kromatografisinde ; gaz - katı kromatografi

c) Sıvı-sıvı kromatografisinde; klasik partisyon kromatografi (partition chromatography), kağıt kromatografisi, (paper chromatography), HPLC (high pressure liquid chromatography),

d) Gaz- katı kromatografisinde ; gaz - katı kromatografisi ve kapiler kolon kromatografisi (capillary column chromatography) gibi kromatografik teknikler yer alır.

-188-Şimdi; yukarıda genel olarak açıklanan kromatografik yöntemler hakkında biraz daha detaylı bilgi vermek istiyoruz:

1) Kafot kromatografısi (paper chromatographv):

Bu kromatografı türünde adsorban uygun kalınlıkta ve yapıda bir kağıt yaprağıdır.

Kromatografik ayrılma işlemi kolondaki adsorpsiyon kromatografisine analog olarak tek bir sıvı fazda gerçekleşir. Kağıdın doğal olarak su içeriği veya sıvı fazın hidrofilik bileşenleri ile selektif olarak emdirilmiş kağıt lifleri sabit faz olarak düşünülür ve partisyon mekanizması ayırım için çalışmaya başlar.

Kağıt kromatografısi inen ve çıkan olmak üzere 2 şekilde uygulanır:

1) İNEN (Descending chromatography)

Bu işlemde mobil faz kromatografı kağıdından aşağıya doğru hareket eder.

Kromatografide kullanılan kağıtların genişliği en az 2,5 cm dir, yükseldiği ise kullanılan kromatografi kabının boyuna göre ayarlanır.

Kromatografı kağıdının bir ucu kromatografi tankının içinde yüksekte asılı olan mobil faz deposunun içine daldırılır ve üzerine bir ağırlık konularak aşağı sarkıtılan diğer ucun tankın içine düşmesi önlenir. Elle yerleştirme de çok fazla kontaminasyon ve kirlenme olmamasına dikkat edilmelidir.

Lekeler (ayrılacak maddeleri içeren çözeltiler) kağıdın mobil faz deposundan çıktığı yerin 1-2 cm ilerisine tatbik edilir.

Kromatografi tankının dibinde çözücü sistemi bulunur, tankın içindeki kromatografi kağıdının herhangi bir yere veya alt taraftaki çözücüye değmemesine dikkat edilmelidir.

Tankın açıhp kapanması sırasmda içerisindeki mobil faz deposundaki çözücünün kağıt üzerine dökülmemesi gerekir.

Kağıt üzerinde ayrılmış olduğu düşünülen lekelerin yerlerinin belirlenmesi için bir belirleyici reaktifin püskürtülmesi gerekir. Ayrılan lekeler aynı şartlarda aynı kağıt üzerine tatbik edilen standartların lekeleri ile karşılaştırılarak kalitatif analiz yapılabildiği gibi ayrılan lekelerin kağıttan kesilerek alınması ve ardından uygun çözücü ile ekstraksiyonu sonucunda kantitatif analiz de yapılabilir.

-189-2) ÇIKAN (Ascending chromatography) Bu teknikte kağıdın bir ucu alttaki çözücüye daldırılır, böylece mobil fazın kapiler etkisi ile yükselmesi sağlanır.

Kağıdın çözücüye daldığı yüksekliğin yaklaşık 1-2 cm yukarısına olacak şekilde lekeler tatbik edilir.

Yapdan işlemler aynen inen sistemde olduğu gibidir. Aynlan lekelerden kalitatİf ve kantitatif analiz yapılabilir.

2) İnce Tabaka Kromatografisi (İTK)(Thin Layer Chromatography) : Bu kromatografi yönteminde; adsorban ince ve uniform bir tabaka halinde cam, metal veya plastik bir plaka üzerine yaydmıştır. En çok kullamlanlan cam plakalardır ve genellikle 20x20 cm ebatlanndadır. Kaplanmış plaklar "açık kromatografik kolonlar" olarak düşünülür. Bu plaklar üzerinde ayrım sabit fazın cinsine bağlı olmak üzere adsorpsiyon partisyon veya herikisinde etkisiyle oluşur.

Tanıma, aynı plak üzerinde aynı mobil faz kullamlarak numune ve standardın Rf değerleri ve büyüklükleri karşdaştınlarak yapdabilir. Elde edilen lekelerin büyüklüklerinin gözle karşdaştınlması yan kantitatif bir analiz olarak düşünülebilir. Kantitatif analiz, dansitometri, floresans veya floresans yoketme yardımıyla, veya plak üzerindeki lekelerin kazınarak alınmasının ardından bunun uygun çözücülerdeki çözeltileri hazırlandıktan soma spektrofotometrik tayini ile yapdabilir.

Rf değeri (Retention factor); lekenin tatbik edildiği noktadan kromatografik olarak derlediği son noktadaki lekenin orta noktasına kadar ki mesafenin, mobil fazın aynı tatbik edilme noktasından itibaren ilerlediği uç nokta (front) arasındaki mesafeye oranıdır.

Genellikle 14-15 cm lik bir mobil faz hareketliliğine göre bu Rf değeri hesaplanır.

İki yönlü (two-dimensional) kromatografi de; bir yönde ilerleme yapıldıktan soma plak 90° çevrilerek ya başka bir çözücü sisteminde yemden yürütülür. Kromatografik işlemler 'Tank " adı verilen saydam ve inert kaplar içerisinde yapılır. Tank'ın Boyutlan kromatografik plaklan içerisine alabilecek büyüklükte olmalıdır.

Adsorban olarak; 5-40 pm çaph iyi toz edilmiş materyaller kullanılır. Bunlar içerisinde bağıl adsorpsiyon güçlerindeki azalma sırasına göre aktive edilmiş karbon, aktive edilmiş alumina, aktive edilmiş silika jel, magnezyum oksit,kalsiyum karbonat, potasyum karbonat, talk ve nişasta saydabilir. Plak üzerine bu maddeler yayılırken içerisine bazen

-190-floresans veren maddeler de ilave edilir ki plak üzerindeki lekelerin yeri UV ışığı kaynağı ile (genellikle Hg lambasıdır) ışık gönderildiğinde (254 ve 360 nm) meydana gelen maddenin veya katı fazın meydana getirdiği floresans yardımıyla daha net gözlenebilir.

Plak üzerinde lekelerin yerlerinin görülebilmesi için (lekeler renksiz ise ki genellikle böyledir) plak üzerine bazı reaktifler püskürtülür. Bu reaktifler (visualisation reagent veya revelatör) ile meydana gelen renklenme gözle görülebilir. Aynlacak veya yürüyecek maddenin çözeltisi plak üzerine (adsorbanın üzerine) mikropipetler yardımıyla çok geniş bir leke olmayacak şekilde ve plağın alt ucundan yaklaşık 1.5 cm yüksekte olacak şekilde kontrollü olarak tatbik edilir.

Maddelerin tatbik edilmesinden önce adsorban kaplı plaklar etüvde 100 - 105° C da 1 saat kurutularak üzerindeki suyun tamamen uçması sağlanır. Böylece tam bir adsorpsiyon olayının oluşması sağlanır.

Plaklar tank'a konulmadan önce kullanılacak mobd faz 2 cm yükseklik alacak şekliyle tank'a konulur. Sonra içerisine tüm tankın duvarlarını kaplayacak şeldlde bir süzgeç kağıdı konularak tamamen ıslanması sağlanır. Böylece tankın içerisindeki atmosferin tamamen mobil faz üe doyurulması sağlanmış olur. Yürüme sağlandıktan sonra; tanktan çıkardan plaklar açıkta veya sıcak hava akımı altında kurutulur. Sonra yukarıda anlatdan şekillerde oluşan lekelerin yeri veya miktan belirlenir.

DENEY: ASPİRİN, FENASETİN VE KAFEİN'in İNCE TABAKA KROMATOGRAFİSİ İLE AYRILMALARI:

Adsorban: Silika jel (gf254)

Mobü faz (developer solvent): metanol: glasiyel asetik asit: eter : benzen (1 : 18 : 60 : 120)

Belirteç (revelatör) : 0.05 N H2S04 içerisinde hazırlanmış 0.1 N KMn04

Numune çözeltüeri : Aspirin, fenasetin ve kafein'in metanoldeki 5-10 mg/ml çözeltileri.

Deneyin yapılışı:

Numune çözeltileri ince bir kılcal yardımıyla ve bir saç kurutma makinesinden üflenen sıcak hava akımı altında ve daha önceden aktive edümiş süika jel kaplı 20x20 cm lik cam plaklar üzerine çapı 0.5 cm yi geçmeyecek şekilde damlatılır. Numunelerin plak üzerine