Araştırma Modeli

A maioria das técnicas que avaliam a metilação de sítios específicos é baseada na modificação do DNA após a exposição ao bissulfito de sódio. Citosinas metiladas no DNA original permanecem não afetadas com o uso do bissulfito, enquanto que, citosinas não metiladas são convertidas em uracil e, posteriormente, em timina (Ahmadian et al., 2006).

Assim, a retenção da citosina em uma posição específica indica a presença de metilação e a presença da timina em um sítio onde normalmente há citosina indica a presença de citosina não metilada na molécula original de DNA (Tost e Gut 2007).

A técnica do pirosequenciamento é um método que analisa qualitativamente e quantitativamente em tempo real a incorporação de nucleotídeos mediante a conversão enzimática e liberação de pirofosfato através de detecção luminométrica (Dupont et al., 2004).

Na reação de pirosequenciamento as enzimas, os substratos e os nucleotídeos A, T, C e G, são carregados em um cartucho e dispensados um de cada vez em cada poço, na ordem determinada pelo aparelho. Após ser dispensado, o nucleotídeo é incorporado a fita simples de DNA e libera um Pi (pirofosfato), este Pi se liga ao ADP formando ATP, que é degradado pela luciferina liberando um pico de luz que é capturado por uma câmara de CCD e convertido em pico no pirograma (gráfico). O sinal fluorescente é gerado proporcionalmente à quantidade de nucleotídeo incorporado, de modo que, os picos presentes no pirograma indicam o número e tipo de nucleotídeos presentes. Posteriormente, os nucleotídeos não incorporados são degradados pela apirase (Figura 5).

____________________________________________________Material e Métodos ₃₅ Polimerase TGAATGCGCAT ACTTAC 3´ 5´ 5´ Sulfulirase Luciferase Apirase PPI(Pirofosfato) ATP

Figura 5. Demonstração do processo enzimático da reação de pirosequenciamento. A enzima DNA polimerase promove a incorporação de nucleotídeos e a liberação de PPI que reage com a luciferase produzindo luz. Os nucleotídeos não incorporados são degradados pela apirase para que ocorra a incorporação dos próximos nucleotídeos.

O uso do pirosequenciamento na pesquisa de metilação permite algumas vantagens em relação a outras técnicas: 1) controlar a qualidade da reação após o tratamento com bissulfito, 2) analisar sítios de metilação adjacentes ao sítio principal, identificando inclusive sequências parcialmente metiladas, 3) confirmar a correta posição do primer na molécula de DNA modificada através da sequência de nucleotídeos gerada ao redor do sítio de metilação, que é rica em adenina e timina (Dupont et al., 2004; Ahmadian et al., 2006).

Em nosso estudo foram avaliados os níveis de metilação de 27 sítios CpG localizados entre os códons 795 a 606 do gene PTEN, demonstrados em negrito na região promotora do PTEN (figura 5). Este experimento foi realizado utilizando o kit Human PTEN CpG Methylation (Epigendx, EUA).

____________________________________________________Material e Métodos ₃₆

aggacacagatttgggggaagggggaatctctaggcaaaggctgttacagtcaaatctctgcgaacgattgtgatccgacagcggtgcaaaagga aagagcgaatgcagtccacgccgcggaaatctaggggtagaggcaaggggggagggtattccccttgcagggaccgtccctgcatttccctctac actgagcagcgtggtcacctggtccttttcacctgtgcacaGGTAACCTCAGACTCGAGTCAGTGACACTGCTCAA

CGCACCCATCTCAGCTTTCATCATCAGTCCTCCACCCCCGCCCCACAACAGCCTACCCTGC

CTCCGGCTGGGTTTCTGGGCAGAGGCCGAGGCTTAGCTCGTTATCCTCGCCTCGCGTTGC

TGCAAAAGCCGCAGCAAGTGCAGCTGCAGGCTGGCGGCTGGGAACCGGCCCGAGCAAGC

CCCAGGCAGCTACACTGGGCATGCTCAGTAGAGCCTGCGGCTTGGGGACTCTGCGCTCGC

ACCCAGAGCTACCGCTCTGCCCCCTCCTACCGCCCCCTGCCCTGCCCTGCCCTCCCCTCGC

CCGGCGCGGTCCCGTCCGCCTCTCGCTCGCCTCCCGCCTCCCCTCGGTCTTCCGAGGCGCC

CGGGCTCCCGGCGCGGCGGCGGAGGGGGCGGGCAGGCCGGCGGGCGGTGATGTGGCGG

GACTCTTTATGCGCTGCGGCAGGATACGCGCTCGGCGCTGGGACGCGACTGCGCTCAGTT

CTCTCCTCTCGGAAGCTGCAGCCATGATGGAAGTTTGAGAGTTGAGCCGCTGTGAGGCGA

GGCCGGGCTCAGGCGAGGGAGATGAGAGACGGCGGCGGCCGCGGCCCGGAGCCCCTCTC

AGCGCCTGTGAGCAGCCGCGGGGGCAGCGCCCTCGGGGAGCCGGCCGGCCTGCGGCGGC

GGCAGCGGCGGCGTTTCTCGCCTCCTCTTCGTCTTTTCTAACCGTGCAGCCTCTTCCTCGG

CTTCTCCTGAAAGGGAAGGTGGAAGCCGTGGGCTCGGGCGGGAGCCGGCTGAGGCGCGG

CGGCGGCGGCGGCACCTCCCGCTCCTGGAGCGGGGGGGAGAAGCGGCGGCGGCGGCGG

CCGCGGCGGCTGCAGCTCCAGGGAGGGGGTCTGAGTCGCCTGTCACCATTTCCAGGGCTG

GGAACGCCGGAGAGTTGGTCTCTCCCCTTCTACTGCCTCCAACACGGCGGCGGCGGCGGC

TGGCACATCCAGGGACCCGGGCCGGTTTTAAACCTCCCGTGCGCCGCCGCCGCACCCCCC

GTGGCCCGGGCTCCGGAGGCCGCCGGCGGAGGCAGCCGTTCGGAGGATTATTCGTCTTCT

CCCCATTCCGCTGCCGCCGCTGCCAGGCCTCTGGCTGCTGAGGAGAAGCAGGCCCAGTCG

CTGCAACCATCCAGCAGCCGCCGCAGCAGCCATTACCCGGCTGCGGTCCAGAGCCAAGC

GGCGGCAGAGCGAGGGGCATCAGCTACCGCCAAGTCCAGAGCCATTTCCATCCTGCAGA

AGAAGCCCCGCCACCAGCAGCTTCTGCCATCTCTCTCCTCCTTTTTCTTCAGCCACAGGCT

CCCAGACATGACAGCCATCATCAAAGAGATCGTTAGCAGAAACAAAAGGAGATATCAAG

AGGATGGATTCGACTTAGACTTGACCT

Figura 6. Demonstração da seqüencia genômica do PTEN (verde, segmento 5´; negrito – ilhas CpG na região promotora e alvo dos primers, amarelo – inicio do sitio transcricional).

____________________________________________________Material e Métodos ₃₇

Devido a extensão dos pares de bases nucleotídicas a serem analisados e as limitações da técnica do pirosequenciamento em analisar sequências superiores a 100 pares de bases, foram utilizados dois primers que avaliaram, respectivamente, as ilhas CpG de 1 a 11 e 12 a 27, localizadas entre os códons 795 a 606 (Quadro 3).

Quadro 3. Primers FS1 e FS2, sequências de análise e sequência após a leitura do

DNA.

Primer Sequência de análise Sequência após leitura

ADS955FS1 (CpG 1 a 11) GTYGTTGTGAGGYGAGGTYGGGTTTAGG YGAGGGAGATGAGAGAYGGYGGYGGTY GYGGTTYGGAGTTTTTTTTAGYGTTTGTG AGTAGT

AGTCGCTGTGATGTCGAGTCGTCATG TCGAGAGATGAGAGTATCAGTCGTCA GTCGTCAGTCGAGTCTAGTCGT ADS955FS2 (CpG 12 a 27) GTYGYGGGGGTAGYGTTTTYGGGGAGTY GGTYGGTTTGYGGYGGYGGTAGYGGYG GYGTTTTTYGTTTTTTTTTYGTTTTTTTTA ATYGTGTAGTTTTTTTTTYGGTTTTTTTTG AAAGGGAAGGTGGA

AGTCGTCGGTCAGTCAGTTCGGATGT CAGTCGTCGTCGTCGTCGCTATGTCA GTCGTCAGTTCGTTCGTTGATCGTGT

ATGTTCGT

A preparação da fita simples de DNA para o Pirosequenciamento foi realizada usando o PSQ Vaccuun Prep Tool (Qiagen, Valencia, CA) de acordo com as instruções do fabricante. Vinte e cinco µl do produto de PCR são imobilizados em streptavidin-coated Sepharose beads (Streptavidin Sepharose High Performace, GE Healthcare).

Em uma placa de 96 poços são transferidos 25 µl do produto amplificado por PCR e adicionado 55 µl do mix de beads de sefarose (3 µl de beads de sefarose, 40 µl de tampão de ligação e 15 µl de água deionizada) em cada poço. A placa é agitada por 15 min a 1350rpm e em seguida é levada à bomba de vácuo (Vaccuun Presp Toll), onde o produto de PCR ligado as beads é precipitado com álcool 70%, desnaturado em Denaturation buffer e lavado em Washing buffer.

____________________________________________________Material e Métodos ₃₈

Em seguida os produtos purificados são incubados com 0,4 µmol/L de primers de sequenciamento, previamente diluídos em 38,6 µl de Anneling buffer à 80ºC por 2 min em placa de sequenciamento (PSQ 96 plate), 5 minutos na placa aquecedora e 5 minutos em temperatura ambiente.

Os produtos purificados ligados ao primer de sequência são transferidos a base do PSQ HS 96 A Pyrosequencer (Qiagen, Valencia, CA), onde acontece o sequenciamento em tempo real do PTEN usando PyroGold reagents (Qiagen, Valencia, CA)

Nas reações de pirosequenciamento, foram utilizados linfócitos hipermetilados e hipometilados como controles positivos e negativos, respectivamente (Anexo G).