5 DISCUSSÃO
A descoberta de novos compostos é motivada pela busca de substâncias mais ativas e menos tóxicas, que possam ser utilizadas no tratamento de diversas patologias, ou em substituição aquelas já existentes. Fontes alternativas aos medicamentos industrializados e a implementação de um projeto sistemático para o estudo e validação do uso de plantas medicinais, são de grande interesse para a comunidade científica (SANTOS et al., 2006), visto que, cerca de 40% dos medicamentos disponíveis na terapêutica moderna, foram desenvolvidas direta ou indiretamente, a partir de fontes naturais, sendo 25% de plantas, 13% de microrganismos e 3% de animais ( YUNES e CALIXTO, 2001).
Considerando a importância destes aspectos é que foi realizado um estudo que objetivou a investigação da toxicidade não-clínica aguda e crônica do Extrato Etanólico Bruto da Casca da Raiz de Dioclea grandiflora Mart. Ex Benth (Fabaceae) (EEBCRDg).
A Dioclea grandiflora Mart. Ex. Benth (Fabaceae), popularmente conhecido como "mucuna", "mucuna-de-caroço" e "olho-de-boi", é uma planta trepadeira que cresce na caatinga e cerrado, regiões do Nordeste do Brasil. De acordo com a tradição popular, a casca das sementes desta planta e das raízes têm sido amplamente utilizados para tratar doenças da próstata e pedras nos rins (LIMA, 1989). Estudos fitoquímicos mostraram a presença de várias substâncias na Dioclea grandiflora, tais como o paraibanol, agrandol e diosalol (JENKINS et al., 1999), dioclein, dioflorin, diidroflavonol, dioclenol (BHATTACHARYYA, 1995), isolado a partir do clorofórmio (CHCI3) porção solúvel do extrato de casca da raiz desta planta. Investigações anteriores evidenciaram uma atividade significativa no SNC do extrato etanolico obtido a partir da casca da raiz seca (BHATTACHARYYA, 1998), e do extrato hidroalcoólico a partir das sementes de Dioclea grandiflora (BATISTA et al., 1995). O seu principal constituinte, diocleina, tem um efeito analgésico significativo em roedores (ALMEIDA et al., 2003), e um efeito vaso relaxante no endotélio da aorta de rato (LEMOS, 1999). A triagem farmacológica também revelou a atividade antinoceptiva de dioclenol e dioflorin em camundongos (ALMEIDA et al., 2000). Um estudo foi realizado com uma outra parte da planta, as vagens, e relatou atividade antinoceptiva eficaz em camundongos (SÁ et
al., 2010).
O ensaio farmacológico não-clínico agudo consiste em uma avaliação preliminar das propriedades tóxicas de uma substância-teste, o que permite obter informações acerca dos
riscos para a saúde resultantes de uma exposição de curta duração pela via escolhida, servindo como base para a pesquisa crônica (BRITO, 1994).
O teste de toxicidade aguda, por via intraperitoneal, na dose de 250 mg / kg do extrato etanólico bruto da casca da raiz de Dioclea grandiflora não provocou a morte de nenhum dos animais tratados, enquanto que as doses de 500, 1000, e 2000 mg / kg, matou 10%, 90% e 100% dos animais tratados, respectivamente. As mortes ocorreram dentro de um período de observação de 14 dias. Portanto, estes dados indicam que a DL50 para este extrato é 753 mg / kg (SÁ et al., 2013).
O ensaio farmacológico não-clínico agudo foi realizado a partir do extrato etanólico bruto da casca da raiz de Dioclea grandiflora, por via oral em ratos submetidos à dose de 2000 mg/kg. A triagem farmacológica descrito por Almeida et al., (1999) apresenta uma metodologia simples para screening de extratos, substâncias, dentre outros produtos de vegetais com possíveis atividades no Sistema Nervoso Central, avaliando-se através de um elenco de comportamentos pré-estabelecidos, possíveis de serem observados em qualquer Laboratório de Farmacologia Experimental, que correspondem a atividades estimulantes e depressoras sobre o SNC e atividades sobre o Sistema Nervoso Autônomo. Na observação dos parâmetros descritos no protocolo não foi evidenciado nenhuma alteração em ambos os sexos no período de tempo avaliado.
A avaliação ponderal não apresentou variação estatisticamente significativa durante os 14 dias da toxicidade aguda para os animais de ambos os sexos, no entanto houve aumento no consumo de água e ração para ambos os sexos comparados ao grupo controle. A determinação desses parâmetros são importantes no estudo de segurança de um produto com fins terapêuticos, uma vez que a adequada ingestão de água e nutrientes, são essenciais para o bom funcionamento do sistema fisiológicos dos animais e, consequentemente, para uma adequada resposta à droga testada, já que condições nutricionais impróprias podem acarretar deficiência do organismo (STEVENS; MYLECRAINE, 1994; IVERSEN; NICOLAYSEN, 2003). Como também são importantes para a avaliação das possíveis alterações metabólicas produzidas pelo produto utilizado (MOTA, 2009).
Na análise laboratorial do sangue, realizada após o término do tratamento agudo, foi possível observar que os machos e as fêmeas apresentaram alterações na avaliação bioquímica evidenciada pelo aumento da albumina e diminuição da fosfatase alcalina, proteínas totais e globulinas. Nos machos, evidenciou-se um aumento na albumina e nas fêmeas uma diminuição da fosfatase alcalina, proteínas totais e globulinas.
Os aumentos nas concentrações séricas de albumina são pouco frequentes, embora acorram em casos de desidratação na medida em que a fase líquida do plasma sofre retração, após a reidratação, a concentração de albumina deve voltar aos valores de referência normais (CASTELLO BRANCO et al., 2011).
A fosfatase alcalina encontrada no soro é resultado da presença de diferentes isoenzimas originadas em diferentes órgãos, com predomínio das frações renais, ósseas e hepáticas. É também uma enzima presente em praticamente todos os tecidos do organismo, especialmente nas membranas das células dos túbulos renais, ossos (osteoblastos), placenta, trato intestinal e fígado. A análise desse parâmetro irá mostrar se existe alguma doença óssea, nas quais ocorre diminuição da atividade das células ósseas, bem como patologias hepáticas e desvio cardiopulmonar (HENRY, 2008).
Os perfis de hipoproteinemias resultantes da desnutrição ou da perda proteica importante apresentam redução em todas as frações, por tanto, aumento e diminuição de proteínas são anormalidades laboratoriais comumente encontradas em animais. Tais alterações se devem a anormalidades no teor de albumina/globulina. A interpretação das alterações no teor de proteína depende da identificação da fração protéica do soro ou plasma (albumina, globulina e, no plasma, fibrinogênio). Aumento ou diminuição na concentração de albumina ou globulina nem sempre provoca alteração detectável do conteúdo da proteína total. Portanto, na interpretação dessas alterações devem-se avaliar os teores de albumina e de globulina, além da concentração de proteína total. A globulina na forma de haptoglobina tem a função de se combinar com a hemoglobina liberada pela lise dos eritrócitos a fim de preservar as reservas de ferro corporal e de proteínas. Concentrações baixas de haptoglobina podem acompanhar as hepatopatias quando a capacidade sintética do fígado encontra-se comprometida (CASTELLO BRANCO et al., 2011).
As análises hematológicas não apresentaram alterações estatisticamente significativas para os machos, e foi evidenciado uma diminuição nas hemácias das fêmeas.
Hemácias são unidades morfológicas da série vermelha do sangue, também designadas por eritrócitos ou glóbulos vermelhos, que estão presentes no sangue em número de cerca de 4,5 a 6,5 x 106/mm³, em condições normais. São constituídas basicamente
por globulina e hemoglobina (composta de 4 moléculas protéicas de estrutura terciária e 4 grupamentos heme) que contém o ferro (cada íon ferro é capaz de se ligar frouxamente a dois átomos de oxigênio, um para cada molécula de hemoglobina), e a sua função é transportar
o oxigênio (principalmente) e o gás carbônico (em menor quantidade) aos tecidos. E apresenta o seu número reduzido em alguns tipos de anemias (LORENZI, 2006).
Um estudo de toxicidade crônica visa a caracterização do perfil toxicológico de uma determinada substância administrada repetidamente a uma espécie de mamífero por um período longo de tempo e é efetuada após a obtenção de dados de toxicidade aguda (BRITO, 1994).
Ensaios toxicológicos não-clínicos crônicos foram realizados em ratos, machos e fêmeas, utilizando-se o extrato etanólico bruto da casca da raiz de Dioclea grandiflora, administrado por via oral, em diferentes doses: dose de 10, 50 e 250 mg/kg. O ensaio foi conduzido por um período de 90 dias e parâmetros como temperatura corpórea, glicemia, consumo de água e ração, evolução ponderal, avaliação comportamental, parâmetros hematológicos e bioquímicos e estudo anatomopatológico foram avaliados.
A temperatura apresentou variação estatisticamente significativa durante o segundo mês, aumentando em relação ao grupo controle, nas doses de 50 e 250 mg/kg para os machos e diminuindo nas doses de 50 e 250 mg/kg para as fêmeas em relação ao grupo controle, podendo mostrar que a relação metabolismo/regulação não manteve-se preservada durante a administração prolongada da planta.
Os machos e as fêmeas apresentaram alterações significativas na glicemia, foi evidenciada uma diminuição significativa da glicemia no segundo e terceiro mês para os machos e no terceiro mês para as fêmeas. a glicemia mostrou ligeira tendência à queda em algumas avaliações.
Os efeitos da administração crônica sobre o consumo de água e alimentos mostraram alterações significativas em ambos os sexos. No consumo de água, os machos apresentaram uma diminuição na 2ª semanas na dose 50 mg/kg, 3ª, 4ª e 5ª semanas na dose de 50 e 250 mg/kg, 7ª semana nas doses de 10, 50 e 250 mg/kg, 8ª e 11ª semanas na dose de 50 mg/kg.
As fêmeas aumentaram o consumo de água na 2ª, 7ª, 8ª semanas na dose 10 mg/kg, diminuiu na 2ª semana nas doses de 50 mg/kg, na 9ª, 10ª, 11ª e 12ª semanas diminuiu o consumo da dose de 50 mg/kg.
Os machos diminuíram o consumo de ração na 3ª, 4ª, 6ª, 7ª, 10ª, 11ª e 12ª semanas na dose de 50 mg/kg e na 3ª, 4ª, 5ª, 9ª, 10ª e 11ª na dose de 250 mg/kg.
As fêmeas demonstraram aumento no consumo de ração na 7ª e 8ª semanas na dose de 10 mg/kg, diminuíram na 9ª semana na dose de 50 mg/kg e na 2ª, 5ª, 9ª e 11ª na dose de 250 mg/kg.
Uma nutrição adequada é essencial para o estado fisiológico dos animais e para garantir que o efeito de uma droga testada seja confiável, e não uma resposta inadequada devido a deficientes condições nutricionais (STEVENS; MYLECRAINE, 1994; IVERSEN; NICOLAYSEN, 2003). Além disso, alterações no peso corporal de roedores são indicativos de efeitos indesejáveis, uma vez que, animais que sobrevivem a tratamento com fármacos administrados por longos períodos, não podem perder mais de 10% do seu peso inicial (RAZA et al., 2002; TEO et al., 2002; FÉRES et al., 2006).
Nos machos, ocorreu uma perda significativa de peso na 5ª, 6ª e 11ª semanas na dose de 10 mg/kg. Uma perda significativa de peso na 6ª semana, e um ganho significativa de peso na 12ª semana na dose de 50 mg/kg. Na dose de 250 mg/kg ocorreu perda significativa de peso na 5ª, 6ª semana e um ganho significativa de peso na 7ª e 12ª semana.
Nas fêmeas, ocorreu um ganho significativa de peso na 2ª semana na dose de 10 mg/kg, uma perda significativa de peso na 1ª semana, e um ganho significativa de peso na 2ª e 6ª semanas na dose de 50 mg/kg.
O teste de campo aberto foi realizado para a avaliação de alterações comportamentais mediante o uso do aparelho de campo aberto proposto por Carlini et al., (1986), com finalidade de avaliar a atividade exploratória dos animais mediante sua movimentação espontânea (ambulação), o número de comportamentos de auto limpeza (grooming), de levantar (rearing) e o número de bolos fecais como índice de emocionalidade (MANSUR et
al., 1971). Esses parâmetros foram utilizados como índice da interferência do extrato
etanolico bruto da casca da raiz de Dioclea grandiflora sobre o comportamento emocional do animal, indicando alterações sobre o sistema nervoso central.
Aumentou significamente no 2º comportamental no ato de levantar nas fêmeas da dose de 50 mg/kg. Ocorrendo uma diminuição estatisticamente significativa no 4º comportamental na defecação das fêmeas na dose de 250 mg/kg. Houve aumentou estatisticamente significativo no 5º comportamental na ambulação e limpeza das fêmeas na dose de 10 mg/kg e levantar dos machos na dose de 250 mg/kg, todas em relação ao grupo controle.
O teste no aparelho de Rota-rod foi realizado para a avaliação de alterações motoras e não foram verificadas alterações significativas em ambos os sexos, assim o EEBCRDg não interferiu no tempo de permanência dos animais na barra giratório do aparelho de Rota-rod.
Tanto os animais do grupo controle quanto os grupos experimentais permaneceram no equipamento durante aproximadamente 180 segundos, demonstrando que nas doses em análise a planta não apresenta efeito estimulante sobre o sistema nervoso.
Ocorreram alterações bioquímicas estatísticamente significativas em ambos os sexos, sendo evidenciado apenas uma diminuição na glicose e albumina nos machos da dose de 250 mg/kg. Aumento nos níveis de creatinina, LDH e albumina nos machos da dose de 10 mg/kg. Aumentou nos níveis de creatinina, AST, LDH, Proteínas totais, albumina e globulina nos machos na dose de 50 mg/kg. Aumentou nos níveis de AST, ALT, LDH e globulina nos machos da dose de 250 mg/kg. Aumento nos níveis de proteínas totais e globulina nas fêmeas na dose de 50 mg/kg.
As determinações da glicose são críticas para o diagnostico e monitoramento de doenças que afetam o metabolismo dos carboidratos. A glicose é quantificada no sangue total, plasma, soro, LCE, liquido pleural e urina para a variedade de finalidades diagnósticas e monitoramento. Além disso, a quantificação da glicose no liquido intersticial ou permitem monitorar continuamente as concentrações em pessoas com diabetes. A Hipoglicemia caracteriza-se por concentrações plasmáticas baixas de glicose e um grupo associado de sintomas que pode ser aliviados pela a ingestão de alimentos ou de carboidratos (Triade de Whipple).
A creatinina é formada como resultado da degradação não enzimática da creatina muscular. As condições que podem reduzir a creatinina incluem a idade, atrofia muscular, uma dieta pobre em carne, nas hepatopatias, no hipertireodismo, na sindrome de Cushing e nas terapias com glicocorticóides (RAVEL, 1997; HENRY, 2008).
Os hepatócitos contêm concentrações elevadas de inúmeras enzimas. Com a lesão hepática estas enzimas podem extravasar para o plasma e podem ser úteis para o diagnósticos e monitoramento da lesão hepática (HENRY, 2008).
As HDLs exercem a função de transporte reverso do colesterol, processo pelo qual o excesso de colesterol é removido dos tecidos periféricos para o fígado e transportado novamente para o orgão sendo reutilizado ou eliminado na bile (HENRY, 2008).
Os perfis de hipoproteinemias resultantes da desnutrição ou da perda proteica importante apresentam redução em todas as frações, por tanto, aumento e diminuição de proteínas são anormalidades laboratoriais comumente encontradas em animais. Tais alterações se devem a anormalidades no teor de albumina/globulina. A interpretação das alterações no teor de proteína depende da identificação da fração protéica do soro ou plasma
(albumina, globulina e, no plasma, fibrinogênio). Aumento ou diminuição na concentração de albumina ou globulina nem sempre provoca alteração detectável do conteúdo da proteína total. Portanto, na interpretação dessas alterações devem-se avaliar os teores de albumina e de globulina, além da concentração de proteína total. A globulina na forma de haptoglobina tem a função de se combinar com a hemoglobina liberada pela lise dos eritrócitos a fim de preservar as reservas de ferro corporal e de proteínas. Concentrações baixas de haptoglobina podem acompanhar as hepatopatias quando a capacidade sintética do fígado encontra-se comprometida (HENRY, 2008).
Albumina é a proteína mais abundante no plasma normal, e constitui até dois terços das proteínas plasmáticas totais. Por esta razão, reduções nas concentrações de albumina por síntese comprometidas (p. ex., desnutrição, mã absorção, disfunção hepática) ou por perdas (p. ex., ascite, nefropatia ou enteropatia com perda protéica) resultam em desequilíbrio grave da pressão oncótica intravascular. Essa perda é manifestada clinicamente pelo desenvolvimento de edema periférico (HENRY, 2008). A albumina também atua como um repositório móvel de aminoácidos para a incorporação a outras proteínas.Uma outra função atribuída a albumina é a de proteína transportadora ou carregadora em geral.
Os aumentos nas concentrações séricas da albumina são pouco freqüentes, embora ocorram em casos de desidratação na medida em que a fase liquida do plasma sofre retração. Após a reidratação, a concentração de abumina deve voltar aos valores de referência normais (HENRY, 2008).
Após os 90 dias de tratamento com o extrato etanólico bruto da casca da raiz de
Dioclea grandiflora Mart, nas análises hematológicas dos machos, foi observado um aumento
estatisticamente significativo nos eritrócitos e hematócritos e diminuição no VCM e CHCM na dose de 50 mg/kg e um aumento do número de leucócitos na dose de 250 mg/kg. Em relação as fêmeas aumentou as hemácias e diminuiu o VCM e HCM na dose de 50 mg/kg.
O número de eritrócitos de um indivíduo varia, principalmente, em função do sexo. No sexo masculino, são obtidos valores maiores do que no sexo feminino. Quando os valores são inferiores aos referidos, diz-se que há oligocitemia e, quando superior, poliglobulia. A oligocitemia costuma estar presente em anemias, mas só este achado não serve para definir o estado anêmico, uma vez que ocorrem anemias com número de eritrócitos normal ou muito próximo do normal (LORENZI, 2006).
Os hematócritos corresponde ao volume ocupado pelos eritrócitos contidos numa certa quantidade de sangue total. Assim como os eritrócitos, o sexo masculino (média de 46%) tem maior valor em percentagem do que o sexo feminino (média de 42%) (LORENZI, 2006).
Para auxiliar no diagnostico de diagnósticos relacionados a patologias hematológicas, no que se refere a série vermelha, existe os índices eritrocitários, tais como: Hemoglobina corpuscular mdia (HCM), Volume corpuscular médio (VCM) e Concentração da hemoglobina corpuscular média (CHCM) (LORENZI, 2006).
O estudo quantitativo dos leucócitos, que são células que atuam na defesa do organismo, inclui a contagem de todas as células brancas, o número total de leucócitos e as contagens relativas e absolutas das várias formas de leucócitos. O termo leucocitose refere-se a um aumento no número total de leucócitos acima do limite superior normal para idade e sexo. Leucopenia traduz o número total de leucócitos abaixo do normal.
Uma finalidade do estudo dos leucócitos consiste em auxiliar no estabelecimento do diagnóstico, como por exemplo na apêndice aguda ou na mononucleose infecciosa. Assim também para o acompanhamento do curso da doença. Por exemplo, os efeitos tóxicos da radioterapia e da quimioterapia antineoplasica podem ser reconhecidos, e a recuperação pode ser monitorada pelo exame dos leucócitos (HENRY, 2008).
No teste de toxicidade crônica, o estudo anatomopatológico incluiu animais de ambos os sexos, submetidos ao tratamento com o Extrato Etanólico Bruto da Casca da Raiz de
Dioclea grandiflora Mart. ex Benth (Fabaceae) (EEBCRDG) nas doses 10, 50 e 250 mg/kg.
Foram avaliados o coração, pulmão, fígado, rins e cérebro de todos esses animais. Do ponto de vista macroscópico, os órgãos não apresentaram alterações anatômicas. Na avaliação histopatológica dos órgãos dos animais, o coração, fígado, rins e cerebro não apresentaram particularidades histológicas. O exame histopatológico dos pulmões dos machos nas doses 10, 50 e 250 mg/kg, evidenciou a presença de discreto infiltrado crônico peribronquiolar, sem evidencias de exsudação para a luz. Os alvéolos apresentam – se sem alterações histológicas, revestidos por epitélio simples plano e lâmina própria constituída por tecido conjuntivo frouxo contendo esparso feixes de músculo liso. A rede vascular acompanha a trama brônquica, também sem alterações dignas de nota. Podendo estar associada a efeitos medicamentosos (COLETTA, 1997).
6 CONCLUSÕES
Os estudos toxicológicos agudo não-clínico do Extrato Etanólico Bruto da Casca da Raiz de Dioclea grandiflora Mart. ex Benth (Fabaceae) (EEBCRDG) em ratos wistar, induziu alterações na ingestão de água e ração, em parâmentros bioquímicos e hematológicos, na dose de 2000 mg/kg, por via oral.
Os estudos toxicológicos crônico não-clínico Extrato Etanólico Bruto da Casca da Raiz de Dioclea grandiflora Mart. ex Benth (Fabaceae) (EEBCRDG) em ratos wistar demonstraram alterações na ingestão de água e ração, evolução ponderal, temperatura, glicemia, parêmetros bioquímicos e hematológicos e histopatológicos com efeitos pulmonares, nas dose de 10, 50 e 250 mg/kg, por via oral.
Considerando que o uso de plantas medicinais é bastante difundido pela população, é necessária a realização de estudos específicos que possam garantir a segurança de seu uso por esta via.
REFERÊNCIAS
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ALBUQUERQUE, U. P. 2002. Introdução à Etnobotânica. Editora Bagaço, Recife.
ALMEIDA, E. R; ALMEIDA, R. N; NAVARRO, D. S; BHATTACHARRYYA, J; SILVA, B. A. Birnbaun JSP. Central antinociceptive effect of a hydroalcoholic extract of Dioclea grandiflora seeds in rodents. J Ethnopharmacol. 2003; 88:1-4.
ALMEIDA, R. N; NAVARRO, D. S; AGRA, M. F; ALMEIDA, E. R; MAJETICH, G; BHATTACHARYYA, J. Analgesic effect of dioclenol and dioflorin isolated from Dioclea grandiflora. Pharm Biol. 2000; 38:394-395.
ALMEIDA, R.N. et al. Metodologia para avaliação de plantas com atividade no Sistema Nervoso Central e alguns dados experimentais. Rev. Bras. Farm., v.80, p.72-76, 1999.
BARROS, S. B. M.; DAVINO, S. C. Avaliação da toxicidade. In: OGA, S. Fundamentos de
Toxicologia. São Paulo: Ed Ateneu, 2003.
BATISTA, J.S; ALMEIDA, R.N; BHATTACHARYYA, J. Analgesic effect of Dioclea