Gen klonlanmasında, bir gene ait pek çok kopya izole edilir. Büyük kompleks bir genomdaki klonlanmak istenen bir yada daha fazla gen, küçük basit bir genoma aktarılır.

BAKTERİYEL GENETİK VE GEN KLONLANMASI

 Gen klonlanmasında, bir gene ait pek çok kopya izole edilir.

 Büyük kompleks bir

genomdaki klonlanmak

istenen bir yada daha fazla

gen, küçük basit bir genoma

aktarılır.

BAKTERİYEL GENETİK VE GEN KLONLANMASI

 Bu işlem in vitro (bir test tüpü içinde) koşullarda yapıldığı için in vitro rekombinasyon olarak da bilinir.

 Restriksiyon enzimleri, DNA ligaz, PCR ve sentetik

DNA’ lar moleküler klonlama çalışmalarında

kullanılmaktadır.

DNA baz dizilerinin

belirlenmesinde Restriksiyon Enzimlerinin kullanımı

 Restriksiyon enzimleriyle belli bölgelerden parçalara ayrılan DNA, agaroz jel elektroforezde birbirlerinden ayrılarak bu parçaların büyüklükleri tespit edilir.

 Farklı restriksiyon enzimleri kullanılarak DNA’nın restriksiyon haritası çıkarılabilir. Bu tür restriksiyon analizleri iki yada daha fazla DNA arasındaki

farklılıkların gösterilmesinde kullanılır.

 Agaroz jeldeki bu DNA fragmentleri daha sonra jelden alınarak hibridizasyon yada dizi analizi (DNA sequencing) çalışmalarında kullanılabilir.

 DNA ısıtılarak tek zincirlere ayrılır (denatürasyon).

 Sıcaklık düşürülünce bu tek iplikler tekrar çift iplikli hale gelir (annealing).

 Bu tek zincirli DNA'larla, farklı kaynaklardan elde edilen tek zincirli DNA'lar yada RNA'lar birleşebilir. Bu işleme hibridizasyon denir.

Farklı kaynaklardan elde edilen tek

ipliklerdeki homolog bölgeler belirlenir.

 Hibridizasyon Southern Blot ve Northern Blot

tekniklerinde kullanılır.

 Southern Blot tekniğinde, agaroz jelde elde edilen DNA fragmentleri bir membrana

transfer edilir.

 Daha sonra denatüre edilerek tek iplikler elde edilir.

 Membran floresan yada radyoaktif olarak işaretli bir prob (baz dizisi belli bir DNA parçası) ile muamele edilerek hibritlerin oluşması sağlanır.

 Bu işlemde jelde DNA varsa, prob da DNA

yada RNA ise sourhern blot olarak, jelde RNA varsa, prob olarak da DNA yada RNA

kullanılıyorsa Northern Blot olarak

adlandırılır.

DNA baz dizilerinin belirlenmesi

 DNA'nın kimyasal olarak parçalanmasını temel alan Maxam-Gilbert metodu

 Kimyasallar DNA'yı G, A+G, C ve C+T olmak üzere dört bölgeden parçalar.

 DNA fragmentleri elektroforezle büyüklüklerine göre ayrılır. Jelin x ışınlarına maruz kalmasıyla (otoradyografi) belirlenir.

 Sanger metodu: DNA polimerazlarla

sentezlenen DNA'nın uçlarına dideoksinükleotidler (deoksiribozun 3'-OH grubu içermeyen ) ilave

edilir.

Gen klonlanması başlıca üç aşamada gerçekleştirilir

1. DNA izolasyonu:

2. DNA fragmentlerinin bir vektöre DNA ligazla bağlanması:

Farklı organizmalardan ve homolog olmayan kaynaklardan gelen DNA’ ların birleşmesi (kimerik DNA)

3. Klonlanan DNA’ nın konukçuya aktarılması:

Doğal aktarım mekanizmaları

Laboratuvar koşullarında geliştirilen yollar (protoplast füzyonu, protoplast

transformasyonu, elektroporasyon ve

mikroenjeksiyon)

Klonlama Vektörleri

 in vitro çalışmalara uygun büyüklükte olmalı

 hücrede verimli replikasyon yapmalı

 Klonlanacak DNA’ nın eklenebileceği uygun restriksiyon bölgeleri vektörde bulunmalı

 Vektör üzerindeki bu klonlama bölgeleri için tek kesim yapan restriksiyon endonukleaz bölgeleri çok önemlidir. Bu şekilde yabancı

DNA, vektörün belli bir bölgesine bağlanabilir.

 Vektör, rekombinant molekülün kolay

tanınmasını sağlayan bir özellik (antibiyotik

dirençlilik gibi) taşımalıdır.

Plazmidler

 Süperhelisel yapı içeren küçük bir genoma sahip olmaları nedeniyle kolay izole

edilebilirler.

 Kendilerini girdikleri hücrede çoğaltabilirler.

 Hücrede çok sayıda kopya oluştururlar.

 Antibiyotik direnç genleri gibi,

fonksiyonları kolay tanımlanabilen genler

taşırlar.

E. coli de çoğalabilen pBR322 plazmidi

 Klonlama için uygun bir büyüklüktedir (4361 bp).

 Kolay izole edilebilir.

 Normalde bir E. coli hücresinde 20-30 kopya

oluşturacak şekilde replike olabilir. Eğer hücredeki protein sentezi kloramfenikolle inhibe edilirse bir hücrede 1000-3000 kopya sayısına (genomun %4 0 ’ ı) ulaşabilirler.

 Yabancı DNA’ yı bağlayabilirler (maksimum 10 kbp büyüklüğünde).

 Pek çok restriksiyon enziminin tanıdığı kesim bölgelerine sahiptirler. Her enzim tek bir kesim bölgesinden plazmidi kesebilir.

 Tetrasiklin ve amfisilin direnç genlerine sahip oldukları için bulundukları hücrede kolay

belirlenebilirler. Taşıdıkları direnç genlerinde

restriksiyon enzimlerinin kesim bölgeleri bulunur.

 Doğal ya da yapay transformasyonla hücreye kolaylıkla aktarılabilirler.

Fajlar

Lamda genomunda fajın enfeksiyonu için gerekli

olmayan J ve N genleri arasındaki bölge, yabancı DNA ile yer değiştirir.

 Faj DNA’ sı izole edilip uygun bir restriksiyon enzimi ile kesilir.

 DNA ligazla yabancı DNA fragmenti, iki lamda fragmenti arasına bağlanır. En fazla 20 kbp büyüklüğündeki DNA parçaları bağlanabilir.

 Faj kafa ve kuyruk proteinlerini içeren hücre

ekstraktının ortama ilavesiyle, rekombinant DNA kafa içine paketlenip faj partikülleri oluşturulur.

 E. coli enfekte edilir ve faj klonları plaklardan izole edilir.

 Rekombinant fajın taşıdığı yabancı DNA dizisi, nükleik asit hibridizasyon teknikleriyle, DNA dizi analizi yapılarak belirlenir.

Kozmidler

 Lamda fajının cos bölgesini içeren plazmid vektörlerdir.

 Bu bölge Lamda virionları içine DNA’ nın paketlenmesi için gereklidir.

 Kozmidler E.coli’ yi enfekte edebilir.

 Kozmidler 50 kbp lik DNA’ ların klonlanmasında kullanılır.

 Kozmidlerin kullanımı ile plazmid yerine bir faj partikülü içinde DNA depolanır. Fajlar

plazmidlerden daha stabildir. Rekombinant

DNA’ yı uzun süre koruyabilir.

 Bakteriyel Kromozom

 Mikrobiyel Genomiks

Bir hücrenin ya da bir virüsün genlerinin tümü genom olarak

adlandırılır. Genomiks ismi genom haritalaması dizi analizi ve

genomların karşılaştırılması çalışmalarının tümünü

kapsamaktadır.

 Dizi analizi yapılan ilk genom 1976 yılında, 3569 nükleotidli MS2 fajının RNA’ sıdır.

 Bundan bir yıl sonra 1977 yılında, ilk DNA genom dizisi, tek iplikli DNA fajı olan 5386 nükleotidli Φ X174 fajında belirlenmiştir.

 İlk hücresel genom dizisi 1995 yılında 1,830,137 bp lik kromozoma sahip

Haemophilus influenzae bakterisinde belirlenmiştir.

 2000 yılından sonra ise insan genomunun

dizi analizi yapılmıştır.

Proteomiks

 Proteom, bir hücre, doku ya da

organizmada herhangi bir zamanda bulunan proteinlerin tamamıdır.

 Proteomiks (fonksiyonel genomiks) ise, bir organizmanın proteinlerinin yapısal ve fonksiyonel özellikleri ile regülasyonunun büyük ölçüde genoma bağlı olarak

çalışılması olarak tanımlanmaktadır.

 Bakterilere yapay olarak hazırlanmış genler verilip yeni istenilen özelliğe sahip hücrelerin üretimi

 Mühendislik yöntemlerinin biyolojiye uygulanması’

 Doğada bulunan biyolojik sistemlerin yeniden düzenlenmesi

 Doğada bulunmayan biyolojik yapıların ve sistemlerin tasarlanması ve imal edilmesi

 Hücrelere yeni genetik şifrelerin eklenmesi veya çıkarılması

SENTETİK BİYOLOJİ

Sentetik Biyoloji Uygulamaları

 Bakteri ve mantarlara insan proteinleri yaptırmak:

 Mantar hücresi:insülin,eritropoetin,HGH....

 Keçi,inek vb.: hormonlar,örümcek ağı...

 Bakterilere yakıt (mazot) ürettirmek

 Mantarlara antibiyotik ürettirmek

 Hayvanlarda insan doku ve organları üretmek