B452 Ökaryot Genetiği
6. HAFTA
6. HAFTA KONU(LAR)
ÖKARYOTLAR ARASI GENETİK MADDE NAKLİ
GEN AKTARIMI
• Bazı özel DNA dizilerinin, farklı hücrelerin genetik yapılarına eklenmesine gen aktarımı denilmektedir.
Genetik transformasyon olarak da adlandırılabilen bu
yöntemin aşamaları yabancı DNA’nın bir vektör
(taşıyıcı) aracılığıyla genom içine yerleştirilmesi, genin
ifadesi ve kazanılan yeni özelliklerin yavru döllere
aktarımıdır.
DNA Aktarım Teknikleri
• Konak hücreye aktarılmak için izole edilen DNA’nın
iletiminde biyolojik ve fiziksel olmak üzere iki aktarım
sistemi kullanılmaktadır.
Biyolojik Aktarım Sistemleri
• Bitki transformasyonunda Agrobacterium tumefaciens
ve Agrobacterium rhizogenes olmak üzere 2 bakteri
türü kullanılmakta olup bu bakteriler kök boğazı uruna
ve saçak kök oluşumuna neden olurlar. Ayrıca bu
bakteriler kendi DNA’larının bir kısmını bitki
genomuna katmak gibi özel bir yeteneğe sahiptirler.
• Bu bakteriler tümör oluşumunda anahtar rol oynayan
büyük bir megaplazmid içerirler (yaklaşık 250kbp) ve
bunlara Ti (tumor-inducing) plazmidi veya Ri (root-
inducing) plazmid adı verilir. Bitki dokusunun bakteriyel
enfeksiyonu sırasında Ti veya Ri plazmidinin hareketli
kısmı olan T-DNA (transfer DNA), bitki hücresinin
çekirdeğine aktarılarak kromozomuna katılır.
• T-DNA transferi ve bitki çekirdek ekspresyonu
yapıldıktan sonra bitki hücreleri eklenen T-DNA
çeşidine göre değişen çeşitli opinleri sentezlerler ve
üretirler. Üretilen bu opinler Agrobacterium için C ve
N kaynağı olarak kullanılmaktadır. 30 kb’lık vir bölgesi
T-DNA transferi ve transfer etkisinin artırılmasında
gerekli 7 operonun (virA,B,C,D,E,G ve H) organize
olduğu yerdir. Ayrıca bakteri kromozomunda bazı
genlerin (örn; chvA, chvB, chvE vb.) bakteri
kolonizasyonunda ve Agrobacterium’un bitkiye
tutunmasında görev aldıkları gösterilmiştir.
Fiziksel Aktarım Yöntemleri
•Biyolistik (partikül bombardımanı, mikroprojektil bombardımanı) yönteminin bakterilere bağımlılığı ve vektör gereksinimi yoktur. DNA’nın bitki hücresine girişine kadar biyolojik sınırlamalar olmadığından biyolistik yöntemi hücre tipi, tür ve genotiple sınırlanmayan çok yönlü ve etkili bir transformasyon metodudur.
Vektör gereksinimiolmadığından istenilen büyüklükte ve
düzenlemede transgenler aktarılabilir ve çoklu gen
transformasyonları sağlanabilir.
• Agrobacterium ve partikül bombardımanı
transformasyon sistemleri en yaygın kullanılan
metotlar olmasına rağmen alternatif metotlar da
bulunmaktadır. Polyethyleneglycol (PEG) aracılığıyla
gen aktarımında protoplastlara gen aktarımında
kullanılan en yaygın ve en eski metot protoplastları
DNA ile birlikte PEG ile muamele etmektir.
Lipozom aracılığıyla gen aktarımı, PEG sisteminin ilerletilmesiyle oluşmuş bir teknik olup yabancı DNA lipozom adı verilen küresel çift tabakalı yağ molekülleriyle kaplanır.
PEG varlığında konak hücre protoplastlarının plazma
zarları lipozom ile birleşir ve birleşme sonucu DNA
stoplazmaya ulaşır daha sonra genoma girer.
Membran geçirgenliğini artırmak için uygulanan diğer bir metot elektroporasyondur.
Bu yöntemde hücreler kısa süreli şiddetli elektrik akımına maruz bırakılarak plazma zarı geçirgenliği artırılır.
Elektroporasyonla transformasyon tekniği çeşitli türlerde ve hücre tiplerinde başarı sağlamıştır fakat türe özgü protoplast rejenerasyon problemi halen diğer tekniklerin kullanımını gerektirmektedir.
