ANKARA ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ
YÜKSEK LİSANS TEZİ
ENANTİYOMERİK SAFLIKTA 1-FENİL-1-PROPANOLÜN TRANSESTERLEŞME TEPKİMESİYLE BİYOREAKTÖRDE
KİNETİK REZOLÜSYONU
Pınar BAKIŞ
KİMYA MÜHENDİSLİĞİ ANABİLİM DALI
ANKARA 2007
Her hakkı saklıdır
ÖZET Yüksek Lisans Tezi
ENANTİYOMERİK SAFLIKTA 1-FENİL-1-PROPANOLÜN TRANSESTERLEŞME TEPKİMESİYLE BİYOREAKTÖRDE
KİNETİK REZOLÜSYONU Pınar BAKIŞ
Ankara Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü Kimya Mühendisliği Anabilim Dalı Danışman: Doç. Dr. Emine BAYRAKTAR
Bu çalışmada, 1-fenil-1-propanolün dolgulu yatak biyoreaktörde enantiyomerik saflıkta üretimi incelenmiştir. İlaç etken maddesi olarak kullanılan 1-fenil-1-propanol, rasemik karışımından Novozym 435 biyokatalizörlüğünde transesterleşme tepkimesiyle elde edilmiştir. Rasemik 1-fenil1-propanolün lipaz katalizli transesterleşme tepkimesinin, çift substratlı Ping Pong Bi Bi kinetik modeline uyduğu belirlenmiş ve bu modeldeki kinetik sabitler bilgisayar programı ile bulunmuştur. 1-fenil 1-propanolün üretimine kolonda kalma süresinin, L/D oranının, moleküler elek/enzim oranının etkileri araştırılmıştır. Enzimin kullanılabilirliliğinin tepkime süresiyle değişimi (12, 24, 48, 72, 96, 120 saat) tespit edilmiştir.
Rasemik 1-fenil1-propanolün lipaz katalizli transesterleşme tepkimesinin kinetik modelinde yer alan kinetik sabitler; Km,gözA113 mM, Km,gözB 300mM, Vm,göz 18.9 mmol/Ldk olarak bulunmuştur. L/D oranı 5 olan kolonda kalma süresinin etkisi incelenmiş, %60 dönüşümde, ee(s)>%99 ve 15,8 E değerlerine kalma süresinin 1.85 dk olduğu durumda ulaşılmıştır. Moleküler elek/enzim oranının (1/2, 1/1, 3/2, 2/1) etkisi araştırıldığında en iyi sonuçlara % 63 dönüşümde % 96 ee(s), 13.2 E ile moleküler elek/enzim oranı 1/2 iken ulaşılmıştır. Yüksek kalma sürelerinde düşük enzim miktarlarında çalışıldığında, kalma süresinin 4 ve 5,5 dk olduğu durumlarda sırasıyla
%61 dönüşüm ee(s)>%99 22,2 E ve %60 dönüşüm ee(s)>%99 24 E değerleri elde edilmiştir. L/D oranı farklı (5, 10, 15) 3 kolonda 3 farklı kalma süresinde (2.6, 1.2, 0.70 dk) çalışılmıştır. Her zaman yüksek enantiyomerik aşırılık değerlerine ( ee(s)>%99) ulaşılmıştır. L/D oranı 15/1 olan kolonda %57 dönüşümle ee(s)>%99 34 E değerlerin kalma süresi 1.2 dk iken ulaşılmıştır. Enzimin kullanım süresinin incelendiği çalışmalarda, enzim uzun sürelerde tepkime ortamında bekletilmiş (12, 24, 48, 72, 96, 120 saat) ve deneyler sürekli sistemde gerçekleştirilmiştir. Deneyler sonunda 72 saate kadar lipaz aktivitesi belli ölçüde azalırken, enantiyomerik aşırılık ve dönüşümde önemli değişiklikler gözlenmemiştir. Ancak 96. saatten sonra enzimin hem aktivitesi hem de enantiyoseçimliliği önemli ölçüde azalmıştır.
2007, 100 Sayfa
Anahtar Kelimeler: Kiral, rezolüsyon, enantiyoseçimlilik, transesterleşme, 1-fenil-1- propanol, dolgulu yatak biyoreaktör.
ABSTRACT Master Thesis
KINETIC RESOLUTION OF ENANTIOMERICALLY PURE 1-PHENYL-1- PROPANOL BY TRANSESTERIFICATION IN A BIOREACTOR
Pınar BAKIŞ Ankara University
Graduate School of Natural And Aplied Sciences Department of Chemical Engineering Supervisor: Assoc.Prof. Dr. Emine BAYRAKTAR
In this study, the production of enantiomerically pure 1-phenyl-1-propanol was performed in a packed-bed bioreactor. 1-phenyl-1-propanol which has been used as cancer and stimulating drugs was produced using Novozym 435 with transesterification reaction. Kinetic resolution of transesterification reaction of 1-phenyl-1-propanol by enzyme fitted a Ping Pong Bi Bi mechanism. The kinetic parameters were obtained by a computer program. The effects of residence time (τ), L/D ratio, molecular sieve/
enzyme weight ratio on production of 1-phenyl-1-propanol were investigated. The changes in the enzyme activity and enantioselectivity with reaction time (12, 24, 48, 72, 96, 120 h) were determined.
The kinetic constants for the lipase-catalyzed transesterification of 1-phenyl-1-propanol were found to be Km,appA=113 mM, Km,appB= 300mM, Vm,app=18.9 mmol/Ldk. The effects of τ in the bioreactor (L/D ratio 5) were investigated and the values of ee(s) (enantiomeric excess)>%99 and E=15 (enantiomeric ratio) were obtained at the residence time1.85 min, respectively. The experiments were also performed to determine the effect of molecular sieves/enzyme ratio (1/1, 1/2, 2/1, 3/2) and maximum ee and E value were obtained at the high τ and low enzyme amount as >%99 of ee(s), 22.2 of E for 4 min of τ and >%99 of ee(s), 24 of E for 5.5 min of τ. It was studied at different L/D ratio (5, 10, 15) and different τ (2.6, 1.2, 0.7 min), the ee(s) was obtained as >% 99 in all experiments. E value was 34 for 1.2 min of τ in L/D ratio 15 bioreactor. In order to investigate the enzyme using time, enzyme was added into the reaction media for different times (12, 24, 48, 72, 96, 120 h) and experiments was performed using these enzyme in the continuous system. Lipase activity decreased but enantioselectivity did not almost change until 72 h. But after 72 h, lipase activity and enantioselectivity decreased.
2007, 100 pages
Key Words: Chiral, resolution, enantioselectivity, 1-phenyl-1-propanol, transesterification, bioreactor, packed bed reactor.
TEŞEKKÜR
Yüksek lisans çalışmalarım süresince her zaman sabırla karşılaştığım sorunlarda bana çözüm yolları bulan, yardımlarını hiçbir zaman esirgemeyen, sonsuz tecrübeleriyle bilime ve bilgiye ulaşmamda yol gösteren danışman hocam Doç. Dr. Emine BAYRAKTAR’a, bilgi, deneyim ve önerilerinden yararlandığım, her zaman ilgi gördüğüm Prof. Dr. Ülkü MEHMETOĞLU’na, Doç. Dr. Afife GÜVENÇ’e, iyi niyeti ve yardım severliliğinden dolayı Araştırma Görevlisi Özlem AYDOĞAN’a sonsuz kere teşekkür ederim.
Laboratuar çalışmalarıma başladığımda bitip tükenmek bilmeyen soru ve sorunlarıma usanmadan cevap veren Binnaz LURÇİ’ye, sevgilerini, fedakarlılıklarını, yollarımız ayrılsa da varlıklarını hep yanımda hissettiğim, dostluğun anlamına inanmama sebep yine canım Binnaz LURÇİ’ye ve Nihal İŞBAKAN’a, aynı evi paylaştığımız, iki yıla çok şeyler sığdırdığımız, sevgisiyle, pozitif enerjisi ve her zaman güler yüzüyle hayatıma ayrı bir anlam katan ev arkadaşım Yeliz BEKTAŞ’a sonsuz kere teşekkür ederim.
İş hayatına yeni girdiğim günlerde işe ve Alpullu’ya alışmam için her türlü ilgi ve alakayı gördüğüm T.Ş.F.A.Ş Alpulu Şeker Fabrikası Kalite ve İşletme Kontrol Müdür Yardımcısı A.Mihriban ESER’e ve tüm laboratuar çalışanlarına sonsuz kere teşekkür ederim.
Hayatın en zor basamaklarında bile yaşama sevincim olan, sevgi ve desteklerini her zaman sabırla gösteren, benim için anlamlarının yüceleği anlatılması zor canım annem Binnaz BAKIŞ’a, babam Yüksel BAKIŞ’a, kardeşlerim Başak ve Ezgi BAKIŞ’a sonsuz kere teşekkür ederim.
Pınar BAKIŞ
Ankara, Temmuz 2007
İÇİNDEKİLER
ÖZET... i
ABSTRACT... ii
TEŞEKKÜR ... iii
SİMGE DİZİNİ ... vi
ŞEKİLLER DİZİNİ ... vii
ÇİZELGELER DİZİNİ ... ix
1.GİRİŞ ...1
2. KURAMSAL TEMELLER...4
2.1 Kiralite ...4
2.2 Stereokimyasal Kavramlar ...5
2.2.1 Enantiyomerler, diastereoizomerler ve özellikleri ...7
2.2.1 Enantiyomerler, diastereoizomerler ve özellikleri ...7
2.3 Kiral Bileşikler İçin Üretim Yöntemleri ...9
2.4 Lipazların Katalizlediği Tepkimeler ...12
2.5 Enantiyoseçimlilik...14
2.6 Enantiyoseçimli Transesterleşme Tepkimeleri...15
2.7 Çok Substratlı Enzimatik Tepkimelerin Kinetiği ...16
2.7.1 Ping Pong Bi Bi mekanizması ...17
2.8 Kaynak Araştırması...22
2.8.1 Çok substratlı enzimatik tepkimelerin kinetiği ile ilgili kaynaklar ...22
2.8.2 Sürekli sistemde enantiyomerik saflıkta kiral maddelerin üretimi ...32
3. MATERYAL VE YÖNTEM...46
3.1 Materyal...46
3.2 Yöntem ...46
3.2.1 Rasemik 1-fenil 1-propanolün transesterleşmesi tepkimesinin kinetiğinin belirlenmesi...46
3.2.2 Sürekli sistemde rasemik 1-fenil 1-propanolün transesterleşmesi ...47
3.2.3 Kolonda kalma süresinin belirlenmesi...48
3.2.4 HPLC analizleri...49
3.2.5 Lipazın aktivitesinin belirlenmesi...50
4.TARTIŞMA VE BULGULAR...51
4.1 Tepkime Kinetiğinin Belirlenmesi...51
4.2 Sürekli Sistemde Tepkimeyi Etkileyen Parametrelerin İncelenmesi ...59
4.2.1 Kolonda kalma süresinin etkisi...60
4.2.2 Moleküler elek/enzim oranının tepkime üzerine etkisi...66
4.2.3 L/D oranının etkisi ...71
4.2.4 Dolgulu yatak biyoreaktörde enzim kullanma süresinin etkisi ...74
5. SONUÇLAR ...79
KAYNAKLAR ...82
EKLER...84
EK 1 KULLANILAN KİMYASALLARIN ÖZELLİKLERİ...85
EK 2 KESİKLİ TEPKİME KABINDA YAPILAN DENEYLER İÇİN TOPLU SONUÇLAR ...86
EK 3 DOLGULU YATAK BİYOREAKTÖRDE YAPILAN DENEYLER İÇİN TOPLU SONUÇLAR...92
EK 4 ENZİM AKTİVİTE HESABI ...98
EK 5 REYNOLDS SAYISI HESABI ...99
ÖZGEÇMİŞ...100
SİMGELER DİZİNİ
App Gözlenen c Dönüşüm
C Derişim, mol/L
D Kolon çapı
E Enantiyomerik oran
Eo (Σ) Toplam enzim miktarı
ee Enantiyomerik aşırılık ee(P) Ürün için enantiyomerik aşırılık ee(S) Substrat için enantiyomerik aşırılık
ε Kolon gözenekliliği
K Denge sabiti
Km,i Michaelis-Menten sabiti, mol/L kfcat Maksimum spesifik hız, molg-1s-1 kR, kS, k1, k2 Hız sabitleri
L Kolon boyu
mE Enzim konsantrasyonu, g/L
n Mol sayısı
PCL Pseudomanas cepacia lipaz
rmax Maksimum reaksiyon hızı
R Mutlak konfigürasyonu R olan enantiyomer S Mutlak konfigürasyonu S olan enantiyomer
Vin Varolan hız
τ Kalma süresi, dk xE Enzim kesri, g/g Kısaltmalar
Ac Asetat
CPB Rasemik siyanohidrin
HPLC Yüksek Performans Sıvı Kromotografi R-MP R-1-metoksi-2- propanol
R-MPA R-1-metoksi-2-propil-asetatın
S-MPA S-1-metoksi-2-propil-asetatın S-MP S-1-metoksi-2- propanol
(rac-MPTL) rac-α-methyl-β-propiothiolakton TLC İnce tabaka kağıt kromotografisi
ŞEKİLLER DİZİNİ
Şekil 1.1 Optikçe saf 1-fenil-1-propanol üretimi ...3
Şekil 2.1 Bromokloroflorometanın ayna görüntüleri...4
Şekil 2.2 Klordiflorometanın ayna görüntüleri ...4
Şekil 2.3 C3H8O’nun yapı izomerleri...5
Şekil 2.4 1,1,1 Triflor-2,3-dimetilpentanın stereoizomerleri ...6
Şekil 2.5 Kiral molekülde stereojenik merkez ...6
Şekil 2.6 2-Klorbütanın enantiyomerleri...7
Şekil 2.7 Diastereoizomerler...8
Şekil 2.8 Enantiyomerik olarak saf bileşiklerin elde edilmesi (Ghanem and Aboul-Enein 2004)...9
Şekil 2.9 Stereoseçimli sentez (Ghanem and Aboul-Enein 2004) ...10
Şekil 2.10 Katalitik kinetik rezolüsyon...11
Şekil 2.11 Dinamik kinetik rezolüsyon...12
Şekil 2.12 Lipazların katalizlediği tepkimeler ...13
Şekil 2.13 Enantiyoseçimli transesterleşme tepkimesi (Ema et al. 1996) ...16
Şekil 2.14 Ping Pong Bi Bi tepkime sistemi ...17
Şekil 2.15 King-Altman mekanizması ...18
Şekil 2.16 1/[A];1/V grafiği ...21
Şekil 2.17 CPB alkolün lipaz katalizli transesterleşme tepkimesi ...22
Şekil 2.18 Enzim katalizli transesterleşmenin formülasyonu ...23
Şekil 2.19 King-Altman mekanizması ...23
Şekil 2.20 (R/S)-1-metoksi-2-propil-asetatın enantiyoseçimli hidrolizi ...27
Şekil 2.21 n-oktanol (A) için Lineweaver-Burk çizimi ...30
Şekil 2.22 Lipaz katalaizli transesterleşme tepkimesinin mekanizması ...31
Şekil 2.23 rac-MPTL’ nin kinetik rezolüsyonu ...32
Şekil 2.24 Dolgulu yatak reaktör tepkime sistemi ...33
Şekil 2.25 Dolgulu yatak rektörde ham ve tutuklanmış enzim için tepkime Profili ...34
Şekil 2.26 S-asit için dönüşüm ve ee değerleri ...36
Şekil 2.27 Dolgulu yatak reaktörde ±2-(4-klorofenoksi)propionik asidin kinetik rezolüsyon tepkimesi için dönüşüm ve ee profili...37
Şekil 2.28 Ketoprofenin 2-kloroetil esterinin enantiyoseçimli hidrolizi...38
Şekil 2.29 Akış hızının dönüşüm ve başlangıç hızına etkisi...39
Şekil 2.30 L/D oranının başlangıç hızına etkisi ...40
Şekil 2.31 Substrat derişiminin dönüşüme ve başlangıç hızına etkisi ...41
Şekil 2.32 4-metoksi-6-metil-2-pironun hidrojenasyonunu...42
Şekil 2.33 Cinchonine/4-metoksi-6-metil-2-piron oranının ee ve reaksiyon hızı üzerine Etkisi...42
Şekil 2.34 Toplam akış hızının ee, dönüşüm ve reaksiyon hızına etkileri...43
Şekil 2.35 1-fenil etanolün vinil propionatla enantiyoseçimli esterleşme Tepkimesi...44
Şekil 2.36 Dönüşümün zamanla değişimi...44
Şekil 3.1 Sürekli sistemde 1-fenil 1-propanolün üretim sistemi ...48
Şekil 3.2 HPLC sistemi...49
Şekil 4.1 Sabit açil verici derişiminde substrat derişimlerinin
zamanla değişimi...53
Şekil 4.2 Sabit substrat derişiminde açil verici derişimlerinin zamanla Değişimi ...53
Şekil 4.3 Sabit açil verici derişiminde hızın derişimle değişimi...54
Şekil 4.4 Sabit substrat derişiminde hızın derişimle değişimi ...54
Şekil 4.5 Sabit açil verici derişiminde deneysel ve modelden elde edilen Başlangıç hızların karşılaştırılması ...55
Şekil 4.6 Sabit substrat derişiminde deneysel ve modelden elde edilen başlangıç hızların karşılaştırılması...56
Şekil 4.7 Açil verici derişiminin sabit tutulduğu durumda farklı substrat ...57
Şekil 4.8 Substrat derişiminin sabit tutulduğu durumda farklı açil verici derişimlerinde ee(s)’nin zamanla değişimi ...57
Şekil 4.9 Açil verici derişiminin sabit tutulduğu durumda farklı substrat ...58
Şekil 4.10 Substrat derişiminin sabit tutulduğu durumda farklı açil verici derişimlerinin dönüşüm ve E üzerine etkisi...59
Şekil 4.11 Kalma süresinin enantiyomerik aşırılık ve dönüşüm üzerine etkisi ...61
Şekil 4.12 Kalma süresinin enantiyomerik aşırılık ve dönüşüm üzerine etkisi ...62
Şekil 4.13 Kalma süresinin enantiyomerik aşırılık ve dönüşüm üzerine etkisi ...62
Şekil 4.14 Kalma süresinin enantiyomerik aşırılık ve dönüşüm üzerine etkisi ...63
Şekil 4.15 Kalma süresinin enantiyomerik aşırılık ve dönüşüm üzerine etkisi ...63
Şekil 4.16 Kalma süresinin enantiyomerik aşırılık ve dönüşüm üzerine etkisi ...64
Şekil 4.17 Kalma süresinin enantiyomerik aşırılık ve dönüşüm üzerine etkisi ...64
Şekil 4.18 Yatışkın halde, farklı kalma sürelerinde enantiyomerik aşırılık ve dönüşüm değerleri...65
Şekil 4.19 Yatışkın halde, farklı kalma sürelerinin E üzerine etkisi...65
Şekil 4.20 Yatışkın halde, farklı Moleküler elek/Enzim oranlarının enantiyomerik aşırılık ve dönüşüm üzerine etkisi...68
Şekil 4.21 Yatışkın halde, farklı Moleküler elek/Enzim oranlarının E üzerine etkisi ...68
Şekil 4.22 Yatışkın halde, aynı moleküler elek/enzim oranında, farklı kalma sürelerinin enantiyomerik aşırılık ve dönüşüm üzerine etkisi...70
Şekil 4.23 Yatışkın halde, aynı moleküler elek/enzim oranında, farklı kalma sürelerinin E üzerine etkisi...70
Şekil 4.24 L/D oranları farklı kolonlarda kalma süresinin dönüşüm üzerine etkisi ...72
Şekil 4.25 L/D oranları farklı kolonlarda kalma süresinin enantiyomerik aşırılık üzerine...73
Şekil 4.26 L/D oranları farklı kolonlarda kalma süresinin E üzerine etkisi...73
Şekil 4.27 Dolgulu kolon biyoreaktörde zamanla enantiyomerik aşırılık ve dönüşümün değişimi ...75
Şekil 4.28 Dolgulu kolon biyoreaktörde zamanla E’nin değişimi ...76
Şekil 4.29 Dolgulu kolon biyoreaktörde zamanla enantiyomerik aşırılık ve dönüşümün değişimi ...76
Şekil 4.30 Dolgulu kolon biyoreaktörde zamanla E’nin değişimi ...77
Şekil 4.31 Dolgulu kolon biyoreaktörde zamanla enantiyomerik aşırılık ve dönüşümün değişimi ...77
Şekil 4.32 Dolgulu kolon biyoreaktörde zamanla E’nin değişimi ...78
ÇİZELGELER DİZİNİ
Çizelge 2.1 Değişik sıcaklıklarda tespit edilen kinetik parametreler...29
Çizelge 2.2 n-oktanolün vinil asetatla tutuklanmış lipaz katalizli transesterleşme tepkimesinin kinetik sabitleri ...31
Çizelge 2.3 Farklı lipaz ve çözücü varlığında ee değerleri ...35
Çizelge 2.4 Sıcaklığın enantiyoseçimlilik ve esterleşme üzerine etkisi...36
Çizelge 2.5 Enzim miktarının ee ve enantiyoseçimliliğe etkisi ...37
Çizelge 4.1 Enzim aktiviteleri...75
1.GİRİŞ
Ayna görüntüsü üst üste çakışmayan stereoizomerlere enantiyomer, enantiyomerlerin oluşturduğu karışıma ise rasemat denir. Rasematlardan ilaç olarak kullanılabilecek aktif enantiyomeri ayırmak, diğer enantiyomerin hastada oluşturduğu olumsuz etkileri engellemek açısından büyük önem taşır. Farmasotik endüstrisinde enantiyomerik saflıkta bileşenlere ilgiden dolayı biyokatalitik olarak enantiyomerik saflıkta ilaç etken maddesi üretimi ile ilgili çalışmalar artmıştır. İstenmeyen enantiyomer safsızlık olarak nitelendirilir, yan etki ve toksik etki gösterebilir ya da diğer enantiyomerin etkisini azaltacak yönde etki gösterebilir. İlaç etken maddesinde istenmeyen enantiyomerin % 0.1 seviyesine düşürülmesi istenir. Enantiyomerik saflıkta bileşiklerin elde edilmesi asimetrik sentez ve rasemik bileşiklerin rezolüsyonu ile kesikli veya sürekli olarak gerçekleştirilebilir. Asimetrik sentez ve rasemik bileşiklerin rezolüsyonu tepkimelerde katalizör olarak kimyasal katalizör veya biyokatalizör kullanılabilir (Ghanem and Aboul-Enein 2004). Lipazlar, rasemik bileşiklerin rezolüsyonunda yüksek enantiyoseçimlilik sağlamaları, geniş substrat spesifikliği, kiralliği tanıma yeteneği ve kofaktöre ihtiyaç duymamaları nedeniyle yaygın olarak kullanılmaktadır. Günümüzde endüstriyel biyoteknoloji alanında kullanılan enzimlerin % 25’i lipazlardır (Lee et al.
2001).
Literatürde sürekli sistemde rezolüsyonun gerçekleştirildiği çalışmalar incelendiğinde tepkimeye L/D oranının, başlangıç hızının, substrat derişimin, akış hızının ve sıcaklığın etkilerinin incelendiği görülmektedir. Sürekli sistemin kesikli sisteme göre bir takım avantajları bulunmaktadır. Büyük ölçüde cam dolgulu yatak reaktörde gerçekleştirilen sürekli çalışmalarda, kesikli çalışmalara kıyasla daha yüksek enantiyomerik aşırılık elde edilmesinin yanı sıra istenen dönüşüm değerlerine daha yakın değerler elde edilmiştir.
Jeong et al. (2000) rac-α-methyl-β-propiothiolaktone (rac-MPTL)’ nun kinetik rezolüsyonunu dolgulu kolon yatak reaktörde, enantiyomerik saflıkta (R)-MPTL elde etmek için incelemişler ve %60 dönüşümde %100 ee değerine ulaşılmışlardır. Bu sonuçlarda kinetik rezolüsyonda ulaşılmak istenen değerlere (%50 dönüşüm %100 ee) yakın sonuçlardır. Başka bir çalışmada Ujang et al. (2003) dolgulu yatak reaktörde Candida rugoza lipaz katalizli ±2-(4-klorofenoksi)propionik asidin 1-bütanol ile kinetik
rezolüsyonunu incelemişlerdir. 6 saatten sonra S-asit için %50 dönüşüm değerinde
%100 ee’ye ulaşılmışlar. Ujang et al. (2003) elde edilen bu değerleri kesikli sistemde elde edilen değerlerle karşılaştırmış ve dolgulu yatakta sürekli çalışmanın mantıklı olduğu kanısına varmışlardır. Xi et al. (2004) tutuklanmış Candida rugoza lipaz (Lipaz OF) ile enantiyomerik saflıkta (S)-ketoprofenin üretimine L/D oranının, akış hızının ve başlangıç hızının etkilerini araştırmışlardır. Yapılan tüm deneylerde her zaman ee>%99 değerine ulaşılmıştır. K.Frings et al. (1999) 1-fenil etanolün enantiyoseçimli esterleşme tepkimesini iki farklı akış hızında gerçekleştirmiş, her iki durumdada %50 dönüşüm ve
%100 ee değerleri elde etmişler. Ester ve alkol silika jel kromotografi ile ayırmışlar.
Kiral ilaçlarin stereoseçici farmakokinetiklerinin ve farmakodinamiğinin sonuçları, sadece bilimsel bir fenomena değildir. Pratik tedavi yöntemlerine, sağlık bakımlarına, eczacılık ve psikiyatri uygulamalarına kadar geniş bir etkiye sahiptir. Stereomerik olarak saf, "homokiral" ilaçların, ilaç piyasasını canlandırması, tedavi yöntemi kararları alan kişilerin kiralitenin de göz önünde bulundurulması konusunda daha çok eğitim görmeleri gerektiği fikrini desteklemektedir. Homokiral ve rasemik ilaçlar arasındaki seçimler net olarak belirlenmiş değil. Bu nedenle tedavi yöntemlerini teftiş eden kurulların, plan ve prosedürlerini bu konuya göre belirlemeye başlamaları gerekmektedir.
Çalışma kapsamında kanser tedavisinde kullanıldığı ve tümör hücrelerinin kimyasal duyarlılığını artırdığı, ayrıca solunum açıcı olarak kullanıldığı bilinen optikçe aktif 1- fenil-1-propanolün, sürekli sistemde lipaz katalizli transesterleşme tepkimesiyle üretimi amaçlanmıştır (Şekil 1.1). Öncelikle kesikli tepkime kabında çalışılarak tepkime kinetiği belirlenmiştir. Daha sonraki aşamalarda optikçe aktif 1-fenil-1-propanol üretimine, kalma süresi, moleküler elek miktarının enzim miktarına oranı, kolon boyunun çapına (L/D) oranı gibi parametrelerin etkileri incelenmiştir. Dolgulu kolon biyoreaktörde, farklı sürelerinde çalışılarak enzimin zamanla aktifliğinin değişimi araştırılmıştır.
Şekil 1.1 Optikçe saf 1-fenil-1-propanol üretimi
Enzim
Açil verici, Çözücü, Moleküler elek
OH OAc
+
OH
(R)-ester (S)-1-fenil-1-propanol (R,S) 1-fenil-1-
Propanol
2. KURAMSAL TEMELLER 2.1 Kiralite
Ayna görüntüsü ile üst üste çakışmayan bir nesneye kiraldir denir. Kiral sözcüğü Yunanca’da el anlamında cheiros kelimesinden gelmektedir. Ayna görüntüsü ile üst üste çakışan nesne kiral olmayıp buna akiraldir denir. Bromokloroflorometan da bir karbon atomuna dört farklı grup bağlanmıştır. Bu molekülün iki ayna görüntüsü üst üste çakışmaz (Şekil 2.1). Klordiflorometanda ayna görüntüleri çakışır ve ayrıca karbon atomuna iki tane aynı grup bağlanmıştır (Şekil 2.2). Bu da kiraliteyi bozmaktadır.
C Cl H Br
F
C Cl F
Br H
Şekil 2.1 Bromokloroflorometanın ayna görüntüleri
C F
Cl Cl Br
F
C Br Cl Cl
Şekil 2.2 Klordiflorometanın ayna görüntüleri
2.2 Stereokimyasal Kavramlar
Aynı molekül formülüne sahip farklı bileşiklere izomer denir. İzomerler, yapı izomerleri ya da stereoizomerler olabilirler.
A. Yapı izomerleri, atomların bağlanış düzeninde farklılık olan izomerlerdir.
Örneğin kapalı formülü C3H8O’nun üç yapı izomeri vardır (Şekil 2.3).
CH
3H
2C C
H
2OH
1- Propanol
CH3 CH
CH3 OH
2- Propanol
CH
3H
2C O CH
3Etil metil eter
Şekil 2.3 C3H8O’nun yapı izomerleri
B. Stereoizomerler, kapalı formülleri ve atomların birbirine göre bağlanma sıraları aynı, fakat atomların uzaydaki düzenlenmeleri farklı olan moleküllerdir (Şekil 2.4).
Stereoizomerler enantiyomer ve diastereoizomer olarak ikiye ayrılır. Kiral karbonları olan fakat kendi ayna görüntüsü ile çakışan stereoizomere mezo şekli denir.
Kiral olan yani 4 farklı grup bağlı olan her türlü atoma genel olarak stereojenik merkez denir. Bazı moleküllerde birden çok stereojenik merkez bulunabilir (Şekil 2.5). Bu durumda olası stereoizomer sayısı da doğal olarak ikiden fazla olmaktadır. Stereoizomer sayısı 2n = stereoizomer sayısı (n=stereojenik merkez sayısı) formülü ile hesaplanmaktadır.
Polarize ışık düzleminin yönünü çeviren moleküllere optikçe aktif molekül adı verilir.
Bir bileşiğin optikçe aktiflik gösterebilmesi için ya kiral olmalıdır ya da enantiyomerlerinden birinin miktarı diğerinden fazla olmalıdır. Günümüzde bilinen optikçe aktif en basit molekül CHFClBr’dir.
Şekil 2.4 1,1,1 Triflor-2,3-dimetilpentanın stereoizomerleri
C W
X Z Y
C W Z X Y
Stereojenik merkez
Şekil 2.5 Kiral molekülde stereojenik merkez
2.2.1 Enantiyomerler, diastereoizomerler ve özellikleri
Enantiyomerler, ayna görüntüsünün üst üste çakışmadığı stereoizomerlerdir (Şekil 2.6). Optikçe aktif her maddenin iki tane enantiyomeri vardır ve bunların optik dönme açıları rakam olarak aynı ama işaret olarak tam terstir. Chan-Ingeld-Prelog sistemine göre biri (R) iken diğeri (S) enantiyomeri oluştururlar.
H3CH2C (R)
Cl H CH3
(R)-(-)-2-Klorbütan
Cl (S)
CH2CH3 H
CH3
(S)-(+)-2-Klorbütan
Şekil 2.6 2-Klorbütanın enantiyomerleri
Enantiyomerler, farklı kirallik göstermelerine rağmen, erime, kaynama noktaları, yoğunlukları ve birçok spektroskopik verileri itibarı ile aynı özellikleri gösterirler ve fiziksel metotlarla kolayca birbirlerinden ayırt edilemezler. Enantiyomerlerin biri polarize ışığı sağa çevirirken diğeri sola (birbirine zıt) çevirmekle beraber, çevirme açıları aynıdır.
Enantiyomerlerin, kimyasal özellikleri benzer ancak biyolojik özellikler bakımından farklı özellikler gösterirler. Örnek olarak, enzimler (+) laktik asiti pürivik asite dönüştürürken, (-) laktik asiti dönüştürmezler.
Diastereoizomer, enantiyomer olmayan moleküllerdir (Şekil 2.7). Geometrik izomerlik ve konformasyon izomerliği olarak ikiye ayrılır.
Şekil 2.7 Diastereoizomerler
Buradan da anlaşıldığı üzere (l) ve (ll) birbirlerinin enantiomeridir, (lll) ve (lV) ise (l)’in diastereoizomerleridir. Fiziksel ve kimyasal açıdan enantiyomerler birbirlerine benzerken, diastereomerler büyük farklılıklar gösterebilirler. Bunlar farklı erime noktalarına, kaynama noktalarına ve fiziksel sabitlere sahip olurlar.
Aynı molekülün enantiyomerlerinden her biri düzlem polarize ışığın polarizasyon düzlemini eşit miktarda ama zıt yönlü çevirirler. Enantiyomerlerinden eşit miktarda içeren bir karışım optikçe aktiflik göstermez ve rasemik karışım olarak adlandırılır.
Akiral moleküllerde optikçe aktiflik göstermez. Işığı polarlandırmak için tasarlanmış alete polarimetre denir ve optikçe aktif bieşiğin, ışığın polarizasyon düzlemini çevirme açısını ölçmekte kullanılır. Çevirme açısı;
9 Moleküllerin yapısına 9 Sıcaklığa
9 Işığın dalga boyuna
9 Işığın yolu üzerindeki moleküllerin sayısına bağlıdır.
100 g/ml derişimindeki örneğin, belirli bir sıcaklık, dalga boyu ve çözücüde, uzunluğu 1.00 dm olan bir tüpte çevrilme miktarına ‘özgül çevrilme’ denir.
2.3 Kiral Bileşikler İçin Üretim Yöntemleri
Genel olarak, enantiyomerik saflıkta bileşikler elde etmek için kullanılan başlangıç noktasına göre üç farklı yöntem bulunmaktadır (Ghanem and Aboul-Enein 2004).
Bunlar; kiral substratlar, prokiral substratlar veya rasemik (rasemat) karışımlardır (Şekil 2.8).
Kiral substratlardan yola çıkılarak stereoseçimli sentez metodu, kiral havuz bileşikleri adı verilen kiral başlangıç substratı ve kimyasal ya da biyolojik kiral ayırıcı ve kiral çevre kullanılarak akiral bileşiklerle gerçekleştirilebilmektedir (Şekil 2.9).
Şekil 2.8 Enantiyomerik olarak saf bileşiklerin elde edilmesi (Ghanem and Aboul- Enein 2004)
Enantiyomerik saflıkta bileşik
Kiral havuz
Sentez
Prokiral substrat
Asimetrik sentez
Rasemat
Kinetik rezolüsyon
Kristalizasyon Biyokatalizörler
Kromatografi
Enzimatik Kimyasal
A
Şekil 2.9 Stereoseçimli sentez (Ghanem and Aboul-Enein 2004)
Asimetrik sentezdeki etkileyici gelişmelere rağmen, endüstriyel alanda tek bir enantiyomerin elde edilmesi için kullanılan en yaygın üretim metodu, rasematların rezolüsyonudur. Enantiyomerlerin rezolüsyonu dört farklı kategoride incelenebilir;
i) Direkt tercihli kristalizasyon, ii) Diastereomerik tuzların kristalizasyonu, iii) Kromatografi, iv) Kinetik rezolüsyon. Tercihli kristalizasyon yöntemi endüstriyel ölçekli çalışmalarda yaygın olarak kullanılır. Örnek olarak endüstride kloramfenikol ve α-metil-L-dopa üretiminde kullanılmaktadır. Bu proses teknik olarak sadece eş miktarda iki enantiyomerin kristallerinin karışımlarının bulunduğu durumda uygulanabilir. Ancak rasematların %20’den daha azı bu şekildedir. Bu yüzden avantajlı bir yöntem değildir.
Tercihli kristalizasyonun başarısı, rasemik karışımında bulunan enantiyomerlerin birinin diğerinden daha çözünür olmasına bağlıdır.
Diastomer kristalizasyonu; rasem bileşiğin optikçe aktif bir bazın enantiyomeri ile tuzu oluşturduğunda bu bileşik diasteromer tuz haline gelmektedir ve fiziksel özellikleri ve çözünürlülükleri birbirinden çok farklıdır. Uygun bir çözücüde kristallendirilerek birbirinden ayrılabilir ve ayrılan tuzlar bir mineral asitle etkileştirilerek asidin anyonu proton alarak serbest hale dönüştürülebilir. Kromatografi, kolon dolgu maddesi olarak optikçe aktif katı maddeler (glikoz, sakaroz, laktoz gibi) kullanıldığında kolondan rasem bir bileşiğin çözeltisi geçirildiğinde enantiyomerlerden biri diğerinden daha güçlü tutulur ve rezolüsyon gerçekleştirilir. Kolon uzunluğu yeterli ise toplanan çözeltide sadece bir enantiyomer bulunur. Kolonda tutulmuş olan diğer enantiyomer ise başka çözücü ile alınabilir. Kinetik rezolüsyon yönteminin başarısı ise; kiral girdi varlığında iki enantiyomerin farklı hızlarda tepkime vermesine bağlıdır. Bu kiral girdiler ortamda
kR
kS
(R)-B
(S)-B
katalitik miktarlarda bulunmalıdır. Kiral girdi olarak, biyokatalizörler (enzim veya mikroorganizma) veya kemokatalizörler (kiral asit veya baz, kiral metal kompleksler) kullanılabilmektedir. Rasemik bileşiklerin kinetik rezolüsyonunda en yaygın olarak lipaz enzimi kullanılmaktadır. Lipaz enzimi rasemik karışımdaki iki enantiyomer arasında ayrım yapabilir (Ghanem and Aboul-Enein 2004). Dolayısıyla bir enantiyomer diğerinden daha hızlı ürüne dönüştürülür (Şekil 2.10).
(R)- substrat
⎯ ⎯→
kR (P)-ürün (S)-substrat⎯ ⎯→
kS (Q)-ürün Şekil 2.10 Katalitik kinetik rezolüsyonKinetik rezolüsyon kR≠kS olduğunda gerçekleşir. Tepkime %0 ve %100 dönüşüm arasında bir yerde durdurulur. İdeal durumda bir enantiyomer diğerinden daha hızlı tepkime verir örneğin tepkime girdisi (R) tepkimeye giren tek enantiyomerdir. %50 dönüşüme ulaşıldığında son karışımda %50 girdi (S) ve %50 ürün (P) bulunmaktadır.
Bu yöntem tek bir enzim kullanılarak enantiyomerlerin kolay şekilde ayrılmasında avantaj sağlar. Kinetik rezolüsyonda bazı sınırlamalar vardır. Bu sınırlama; rasemik karışımdan enantiyomerik saf bileşiklerin maximum %50 verimle elde edilebilmesidir.
Böyle bir sınırlamanın üstesinden, meso bileşikler veya prokiral substratlar kullanılarak, istenmeyen enantiyomerin stereokimyası değiştirilerek, rasemizasyon ve istenmeyen enantiyomerin diğer enantiyomere dönüşümü sağlanarak, dinamik kinetik rezolüsyon (DKR) gibi farklı bir yöntem kullanılarak gelinebilir. Dinamik kinetik rezolüsyonda enzim katalizli kinetik rezolüsyon ile rasemizasyon birlikte gerçekleştirilir. Dinamik kinetik rezolüsyonda (R)-substratı, (S)-substratından daha hızlı (R)-ürününe dönüştürülür (kR>kS) (Şekil 2.11).
Dinamik rezolüsyonun kinetik rezolüsyondan tek farkı (S) enantiyomeri rezolüsyon prosesi süresince (R) enantiyomerine dönüştürülür. Böylece başlangıç R-substratının
tamamı R-ürününe dönüşebilir ve kras≥kR olmalıdır. Maksimum verim %100’e ulaşabilir (Ghanem and Aboul-Enein 2004).
(R)-substrat
⎯ ⎯→
kR (R)-ürün(S)-substrat
⎯ ⎯→
kS (S)-ürün Şekil 2.11 Dinamik kinetik rezolüsyon2.4 Lipazların katalizlediği tepkimeler
Lipazlar, hidroliz, esterleşme ve transesterleşme tepkimelerini katalizlerler (Şekil 2.12).
Transesterleşme tepkimeleri, esterdeki açil grubu değişimi, bir asit ile yapılıyorsa asidoliziz, alkol kullanılıyorsa alkoliziz, bir başka ester kullanılıyorsa interesterleşme ve bir amin kullanılıyorsa aminoliziz adını alır (Kösali 2005).
1. Hidroliz
R1 C
O O
R2 + H2O R
1
C O
H O
R2 O + H
2. Esterleşme
R1 C
O H
R2 O
H R1
C O
R2
O O
+ H2O +
kras
kras
3. Transesterleşme A. Asidoliziz
R1 C
O R2 O
R3 C
O H O
R3 C
O R2 O
R1 C
O H O
+ +
B. İnteresterleşme
R1
C O
R2
O
R3 C
O R4 O
R1 C
O R4 O
R3 C
O R2 O
+ +
C. Alkoliz
R1 C
O R2
R3 O
H R1
C O
R3
O O
+ + R2 O H
D. Aminoliziz
R1 C
O O
R2 R3
N H H
R1 C O
N H
R2 O
H R3
+ +
Şekil 2.12 Lipazların katalizlediği tepkimeler
2.5 Enantiyoseçimlilik
Tersinmez enzimatik rezolüsyon tepkimesi aşağıda görüldüğü gibidir:
Enzim + substrat (A)
⇔
12
k k
[Enzim -A] ⎯⎯→k3 Enzim + P (ürün)
Enzim + substrat (B)
⇔
45
k k
[Enzim-B]
⎯ ⎯→
k6 Enzim +Q (Ürün)Enantiyoseçimlilik; eeS, eep ve dönüşüme (c) bağlı olarak (Tersinmez tepkime);
ürün için;
E=ln[1 (1 )]
)]
1 ( 1 ln[
p p
ee c
ee c
−
− +
−
substrat için;
E=ln[(1 )(1 )]
)]
1 )(
1 ln[(
S S
ee c
ee c
+
−
−
− formülleri ile hesaplanır. Burada dönüşüm;
So Ro
S R
C C
C c C
+
− +
= 1
formülünden hesaplanır.
E değeri eeS ve eep’ye bağlı olarak;
E=
) (
)]
1 ( ln[
) (
)]
1 ( ln[
S P
S P
S P
s P
ee ee
ee ee
ee ee
ee ee
+ + +
−
formülünden hesaplanır.
Tersinir enzimatik rezolüsyon tepkimesi aşağıdaki gibidir:
Enzim + substrat (A)
⇔
12
k k
[Enzim -A]
⇔
34
k k
Enzim + P (ürün)
Enzim + substrat (B)
⇔
56
k k
[Enzim-B]
⇔
78
k k
Enzim +Q (Ürün)
Tersinir tepkime için, eeS, eeP ve c’ye bağlı olarak E değerleri,
ürün için;
E= ln[1 (1 ) (1 )]
)]
1 ( ) 1 ( 1 ln[
P P
ee c
k
ee c
K
− +
−
+ +
−
substrat için;
E=ln[1 (1 )( (1 ))]
))]
1 ( )(
1 ( 1 ln[
c ee
c K
c ee
c K
S S
−
− +
−
− +
+
− formüllerinden hesaplanabilmektedir.
K=Denge sabiti=k1/k2=k3/k4…
Enantiyomerik aşırılık (ees);
%eeS= *100
S R
S R
C C
C C
+
− eşitliği yardımıyla hesaplanmaktadır (Ghanem and Aboul-
Enein 2004) .
2.6 Enantiyoseçimli Transesterleşme Tepkimeleri
Enantiyoseçimli transesterleşme tepkimelerinde, önce enzim, açil verici ile açil enzim kompleksini oluşturur. Açil grup hidrolazın aktif merkezine direk bağlanarak stereokimyasal kontrolü sağlarlar. Hidrolazın aktif merkezindeki serin kalıntıları, organik çözücülerde, farklı açilleme araçlarıyla kolaylıkla açillenebilir. Açil-enzim, kr ks
sabitlerinin büyüklüklerine göre R-substrat veya S-substrat ile kompleks oluştururlar.
Daha sonra ürün oluşur ve ürün ile enzim ayrılır (Şekil 2.13) (Ema et al. 1996, Kösali 2005).
Şekil 2.13 Enantiyoseçimli transesterleşme tepkimesi (Ema et al. 1996)
2.7 Çok Substratlı Enzimatik Tepkimelerin Kinetiği
Çok substratlı enzimatik tepkimelerin kinetiği için farklı yöntemler bulunmaktadır (Segel 1975). Bunlar;
¾ Bir substrat ve iki ürünlü: Uni Bi
¾ İki substrat ve iki ürünlü: Bi Bi 9 Sıralı mekanizma
9 Ping Pong Bi Bi mekanizması
¾ Üç substratlı ve iki ürünlü: Ter Bi
¾ Üç substratlı ve üç ürünlü: Ter Ter dir.
Açil-enzim---R substrat
Açil-enzim---S substrat k-r
kr
k-s ks
Enzim +R enantiyomer
Enzim + S enantiyomer k-1
k
1k2 k-2 Enzim Açil - enzim Açil verici
2.7.1. Ping Pong Bi Bi mekanizması
Ping Pong Bi Bi mekanizması enzim katalizli iki substratlı iki ürünlü tepkimelerin kinetiğinin belirlenmesinde kullanılan bir yöntemdir (Şekil 2.14) (Segel 1975).
E
A + B → P + Q
A,B : Substrat P,Q : Ürün E : Enzim Şekil 2.14 Ping Pong Bi Bi tepkime sistemi
Bu mekanizma iki temele dayanmaktadır;
1. Öncelikle A substratı, enzimle tepkimeye girer ve ilk ürün P oluşur, ardından ikinci substrat B, enzimle tepkimeye girer ve ikinci ürün Q oluşur.
2. Burada enzim yüzeyinde A ve B substratları karşılaşmazlar.
İki substratlı iki ürünlü tepkimlerini kinetiği için King-Altman mekanizması geçerlidir (Şekil 2.15). Bu mekanizmanın çözümü ise yine Ping Pong Bi Bi’ye dayanmaktadır.
Yani önce A substratı ile enzim tepkimeye girip enzim-substrat kompleksini oluştururlar. Daha sonra birinci ürün (P) oluşur. İlk ürün oluştuktan sonra ikinci substrat-enzim kompleksi oluşur ve ardından bu kompleksten ikinci ürün Q ayrılır.
k1[A]
E (EA↔FP) k-1
k4 k-4[Q] k-2[P] k2
k-3
(EQ ↔ FB) F k3[B]
Şekil 2.15 King-Altman mekanizması
E: Serbest enzim, EA: Enzim-substrat kompleksi, FP: Amino enzim-ürün kompleksi, F:
Amino enzim, FB: Amino enzim-substrat kompleksi, EQ: Enzim-ürün kompleksi King-Altman mekanizmasında her tepkimenin denklemi aşağıda verilmiştir (Şekil 2.15). Bu denklemlerden yola çıkılarak tepkime için hız ifadesi bulunmuştur.
k1
E + A ⎯⎯→ EA EA = FP (2.1) ←⎯⎯
k-1
k2
FP ⎯⎯→ F + P (2.2) ⎯⎯←
k-2
k3
F + B ⎯⎯→ FB FB = EQ (2.3) ←⎯⎯
k-3
k4
EQ ⎯⎯→ E+ Q (2. 4) ←⎯⎯
k-4
Tepkime için (Şekil 2.14) hız ifadesi
V = k1[E][A] – k-1[FP] (2.5)
Toplam enzim miktarı Eo,
Eo=[E]+[FP]+[F]+[EQ] (2.6)
Her basamak için hızlı denge varsayımıyla aşağıdaki eşitlikler yazılmıştır;
k1[E][A] = k-1[FP] (2.7)
k2[FP] = k-2[F][P ] (2.8)
k 3[F][B] = k- 3[EQ] (2.9)
k4[EQ] = k-4[E][Q] (2.10)
2.7, 2.8, 2.9 ve 2.10 eşitliklerinden Eo ifadesinde yer alan bilinmeyenler bulunur;
[E]= k4k-1k-2[P]+k2k3[B]k4+k3[B]k4k-1+k-3k-2[P]k-1 (2.11) [FP]= k4k-1[A]k-2[P]+k-4[Q]k-3k-2[P]+k3[B]k4k1[A]+k-3k-2[P]k 1[A] (2.12)
[F]= k4k1[A]k2+k-4[Q]k-3k2+k-1k-4 [Q]k-3+k-3k1[A]k2 (2.13) [EQ]=k-2[P]k-1k-4[Q]+k-4[Q]k2k3[B]+k-1k-4[Q]k3[B]+k1[A]k2k3[B] (2.14)
2.11, 2.12, 2.13 ve 2.14 eşitlikleri 2.6’ da yerine yazılır ve Eo bulunur.
Eo= k4k-1k-2[P]+k2k3[B]k4+k3[B]k4k-1+k-3k-2[P]k-1 + k4k-1[A]k-2[P]+k-4[Q]k-3k- 2[P]+k3[B]k4k1[A]+k-3k-2[P]k 1[A] + k4k1[A]k2+k-4[Q]k-3k2+k-1k-4 [Q]k-3+k-3k1[A]k2 +
k-2[P]k-1k-4[Q]+k-4[Q]k2k3[B]+k-1k-4[Q]k3[B]+k1[A]k2k3[B] (2.15)
2.15, 2.5’te yazılırsa;
] [
] ][
][
[ ]
][
][
[ 1 2 3 4
4 3 2 1
Eo
Q P Eo k k k k B A Eo k k k k V
−
−
−
− −
= (2.16)
2.16’yı basitleştirirsek;
k Eo k
k Vm k
4 2
4 2
= + (2.17)
) (
) (
4 2 1
2 1 4
k k k
k k KmA k
+
= − + (2.18)
) (
) (
4 2 3
4 3 2
k k k
k k KmB k
+
= − + (2.19)
2.17, 2.18 ve 2.19 2.16’da yazılırsa;
] ][
[ ] [ ]
[
] ][
[
B A B KmA A
KmB
B A V Vm
+
= + (2.20)
Eşitlik 2.20 [B] ile bölünüp [A] yalnız kalacak şekilde düzenleme yapılırsa;
] [ ] 1 [
] [ ] 1 [
A B
KmB KmA
A B KmB Vm
V
+ +
+
= (2.21)
] [ '
] ['
A KmA
A V Vm
= + (2.22)
] 1 [ '
B KmB Vm Vm
+
= (2.23)
] 1 [ '
B KmB KmA KmA
+
= (2.24)
: , , ,'
,'KmB KmA KmBVm
KmA Kinetik sabitler
2.22, 2.23 ve 2.24 eşitliklerindeki kinetik sabitlerin bulunabilmesi için doğrusallaştırma yapılır.
Eşitlik 2.22 doğrusallaştırılırsa;
' 1 ] [
1 '
' 1
Vm A Vm KmA
V = + (2.25)
elde edilir. Bu bir doğru denklemdir. Bu doğrunun eğimi ve kaymasından Vm,' KmA' bulunur (Şekil 2.16).
Eşitlik 2.23 doğrusallaştırılırsa
Vm B Vm KmB Vm
1 ] [
1 '
1 = + (2.26)
elde edilir. Bu doğrunun eğimi ve kaymasından Vm,KmB bulunur.
Şekil 2.16 1/[A];1/V grafiği
Eşitlik 2.24 doğrusallaştırılırsa
KmA B
KmA KmB KmA
1 ] [
1 '
1 = + (2.27)
elde edilir. Bu doğrunun eğiminden ve kaymasından KmA,KmB bulunur. Grafiksel olarak çözülemeyen kinetik modeller için non-lineer regresyon analizi kullanılır. Non- lineer regresyon analizi için farklı bilgisayar programları mevcuttur. Bu tez çalışmasında lineerleştirme kullanılmamıştır. Non lineer regrasyon programı ile hız sabitleri bulunmuştur. Km sabiti derişim hakkında bilgi verir. Km’nin substrat
derişiminden çok büyük olduğu durumlarda; enzimin katalitik aktivitesi boşa harcanır, tepkime hızı çok düşük olur. Substrat derişimin Km’den çok büyük olduğu durumlarda ise, substrat boşa harcanır. 1. mertebeden enzimatik tepkimeler için Vmax/2 olduğu durumda substrat derişimi Km’ye eşittir. Deneysel çalışmalarda substrat derişimi ile
Km değeri uyumlu olmalıdır. Yani KmA,KmB değerlerine yakın derişimlerde çalışılmalıdır (Bailey and Ollis 1986).
2.8 Kaynak Araştırması
2.8.1 Çok substratlı enzimatik tepkimelerin kinetiği ile ilgili kaynaklar
Literatürde iki substrat ve iki ürünlü enzimatik tepkimelerin kinetiği belirlenirken Ping Pong Bi Bi ve King-Altman mekanizmaları kullanılarak sonuca varılmıştır. Zhang et al.
(2004), çalışmalarında rasemik siyanohidrinlerden tutuklanmış lipaz katalizli transesterleşme tepkimesi ile optikçe aktif (S)-α-siyano-3-fenoksibenzil (CPB) asetat eldesi tepkimesinin kinetiğini incelemişlerdir (Şekil 2.17). Bu tepkime iki substratlı ve iki ürünlü bir tepkimedir ve kinetiğini belirlerken Ping Pong Bi Bi ve King-Altman mekanizmalarını kullanmışlardır (Şekil 2.18-2.19).
Şekil 2.17 CPB alkolün lipaz katalizli transesterleşme tepkimesi
A: Substrat, vinil asetat, B: Diğer substrat, CPB alkol, Q: Ürün, CPB asetat, P: Ürün, asetil aldehit
Şekil 2.18 Enzim katalizli transesterleşmenin formülasyonu
EA: Enzim ve substrat A kompleksi, F: Serbest enzim, EQ: Enzim ve ürün Q kompleksi, FB: Serbest enzim ve substrat B kompleksi
Şekil 2.18’te gerçekleşen tepkimenin formülasyonu verilmiştir. Öncelikle birinci substrat (A) enzimle tepkimeye girer ve ilk ürün P oluşur. Daha sonra ikinci substrat (B) enzimle tepkimeye girer ve ikinci ürün Q oluşur. Burada ürünler P ve Q uçucu olduklarından dolayı k2 ve k5 kinetik sabitlerine sahip tepkimeler tersinmez olarak gösterilmiştir.
Şekil 2.19 King-Altman mekanizması
Enzim içeren durumlar; [E], [F], [FP], [EQ]
Toplam enzim miktarı Eo (Σ);
(2.28)
CPB alkolün lipaz katalizli transesterleşme tepkimesi için hız ifadesi;
(2.29)
Vin: Gerçek hız, molL-1s-1
(2.30)
(2.31)
Zhang et al. (2004), yukarıdaki eşitlikleri kullanarak hız ifadesini aşağıdaki gibi bulmuşlardır.
(2.32)
Q= 0 iken başlangıç hızı (Vo);
(2.33)
Hız ifadesini daha basitleştirmek için aşağıdaki ifadeler kullanılmıştır;
(2.34)
Sonuçta hız ifadesini;
(2.35)
şeklinde yazmışlardır. BuradaKA , KB, KAB ve Vm kinetik sabitlerdir. Zhang et al.
(2004), substrat derişim testleri yapmış ve V0’ın S0 (başlangıç substrat derişimi, molL-
1) ile lineer bir şekilde değişim gösterdiğini ortaya koymuştur.
Bu nedenle hız ifadesi;
(2.36) şeklinde yazılmıştır. Eğer Q # 0 ise gözlenen hız;
(2.37)
Hız ifadesindeki (2.37) kinetik sabitleri bulmak için Zhang et al. (2004) Matlab programından yararlanmışlar ve sabitleri K = 0.62 LmolA -1s-3, K =1.01 LQA 2mol-2s-3,
KBQA= 19.77L3mol-3s-3 olarak bulmuşlardır. Bu denklemden doğacak olan model hatasını ise %11.18 belirlemişler.
Berendsen et al. (2005), Candida antarctica lipase B katalizli (R/S)-1-metoksi-2-propil- asetatın enantiyoseçimli hidrolizi tepkimesinin kinetiğini incelemişlerdir. Bu çalışmada da Ping Pong Bi Bi mekanizması kullanılmıştır (Şekil 2.20). Bu tepkime için basamaklar aşağıdaki şekildedir;
1. Önce ilk substrat (glikol eter asetat), enzime bağlanır.
E + S1 ↔ ES1
2. İlk ürün glikol eter, açil-enzim kompleksinden ayrılır.
ES1 ↔ EA +P1
3. İkinci substrat (su), açil-enzim kompleksine bağlanır.
EA + S2 ↔ EP2
4. İkinci ürün asetik asit ayrılır, enzim serbest hale geçer.
EP2 ↔ E +P2
R-enantiyomer R-MP Asetat (Ac)
(R-MPA) R-1-metoksi-2- R-1-metoksi-2-propil asetat propanol (R-MP)
S-enantiyomer S-MP Asetat (Ac) (S-MPA) S-1-metoksi-2-
S-1-metoksi-2-propil asetat propanol (S-MP) Şekil 2.20 (R/S)-1-metoksi-2-propil-asetatın enantiyoseçimli hidrolizi
Hız ifadeleri yazılırken, enantiyomerlerin aynı aktif konum için yarışmaları modelin karmaşık olmaması için ihmal edilmiştir. Her iki enantiyomer için hızlar aşağıdaki gibi yazılmıştır.
• R-enantiyomer için hız ifadesi
(2.38)
• S-enantiyomer için hız ifadesi
(2.39)
Yapılan deneyler sonucunda R-enantiyomerin inhibisyona yol açtığı görülmüştür.
Ayrıca CHAC<<< CH2O ve CR-MP<<< CH2O olduğundan tersinirliklerde ihmal edilmiştir ve inhibisyon olduğu ürün varlığında enantiyomerler için hız ifadeleri aşağıdaki gibidir.
• R-enantiyomer için hız ifadesi
(2.40)
• S-enantiyomer için hız ifadesi
(2.41)
CS-MPA<<< CH2O ve CR-MPA<<< CH2O olduğundan;
(2.42)
(2.43)
Berendsen et al. (2005), hız ifadelerinin çözümü için basitleştirme yapmış, eşitlikleri Michalelis-Menten’e indirgemişler ve denklemleri aşağıdaki gibi yazmışlardır. Daha sonra bilgisayar programı kullanılarak farklı sıcaklıklar için kinetik sabitleri tespit etmişlerdir (Çizelge 2.1).
• R-enantiyomer için hız ifadesi
(2.44)
• S-enantiyomer için hız ifadesi
(2.46)
Çizelge 2.1 Değişik sıcaklıklarda tespit edilen kinetik parametreler (Berendsen et al.
2005)
T(ºC) 30 40 50 56 60
kfcat,R(molg-1s-1) 4.8E-05 5.8E-05 6.5E-05 7.7E-05 9.2E-05
Km,R-MPA(mol/L) 0.39a
Ki,R-MPA(mol/L) 0.55a
a Km,R-MPA ve Ki,R-MPA R veya S enantiyomerin dönüşümlerinin değişiminden etkilenmemektedir. Bu nedenle sabit oldukları varsayılmıştır.
Yadav et al. (2003) n-oktanolün vinil asetatla tutuklanmış lipaz katalizli transesterleşme tepkimesinin kinetiğini incelemişlerdir. Tepkime kinetiği belirlenirken deneyleri iki aşamalı yapmışlar ve 30ºC’ta 25 mg Novozym 435 kullanmışlar. Öncelikle vinil asetatın mol sayısı sabit tutulmuş (0.03 mol), n-oktanolün mol sayısının değişen değerlerinde (0.0075 den 0.06’ya) çalışılmış. Daha sonra n-oktanol mol sayısı sabit iken
(0.03 mol), vinil asetatın mol sayısının değişen değerlerinde (0.015 ten 0.06’ya) çalışılmış. Çalışma hacim 30 ml olacak şekilde heptan ile tamamlanmıştır. n-oktanol (A) derişimi arttırıldığında başlangıç hızı (r0) artmıştır (Şekil 2.21). Ancak derişim daha fazla arttırıldığında hem n-oktanolün hem de vinil asetatın inhibisyona yol açtığı gözlenmiştir. Lipaz katalizli tepkimelerde, enzim ilk önce, açil verici ile açil-enzim kompleksi oluşturduğu için (Şekil 2.22) yine burada da Ping Pong Bi Bi mekanizması kullanılmıştır ve denklemler buna göre yazılmıştır (Eşitlik 2.47).
Şekil 2.21 n-oktanol (A) için Lineweaver-Burk çizimi
Şekil 2.22 Lipaz katalaizli transesterleşme tepkimesinin mekanizması
A: n-oktanol, B: Vinil asetat, EA: Enzim ve n-oktanol kompleksi, Q: Asetaldehit, P: Oktilasetat, EAB:
Üçlü kompleks, EPQ: EAB’nin izomeri
(2.47) A: n-oktanolün başlangıç derişimi
B: Vinil asetatın başlangıç derişimi r: Reaksiyon hızı
rmax: Maksimum reaksiyon hızı KM-A: n-oktanolün Michaelis sabiti KM-B:Vinil asetatın Michaelis sabiti KI-A: n-oktanolün inhibisyon sabiti KI-B: Vinil asetatın inhibisyon sabiti
Yadav et al.(2003) yukarıda verilen tepkime hız denlemindeki kinetic sabitleri bulmak için Non-lineer regresyon analizi yapmışlardır ve kinetik sabitleri Çizelge 2.2’deki gibi bulmuşlardır.
Çizelge 2.2 n-oktanolün vinil asetatla tutuklanmış lipaz katalizli transesterleşme tepki mesinin kinetik sabitleri (Yadav et al. 2003)
Kinetik sabitler
rmax(kmolm-3s-1kg enzim-1) -0.3396
KM-A (kmolm-3kg enzim-1) 1.44
KM-B (kmolm-3kg enzim-1) 0.1958
KI-A (kmolm-3kg enzim-1) -1.294
2.8.2 Sürekli sistemde enantiyomerik saflıkta kiral maddelerin üretimi
Jeong et al. (2000) rac-α-methyl-β-propiothiolaktone (rac-MPTL)’nun kinetik rezolüsyonunu enantiyomerik saflıkta (R)-MPTL elde etmek için incelemişlerdir (Şekil 2.23). Dolgulu yatak rektörde serbest ve tutuklanmış enzim kullanarak her iki durumda da enantiyomerik aşırılığın ve dönüşümün nasıl değiştiğini tespit etmişler, yüksek substrat derişimlerinin inhibisyona yol açıp açmadığını araştırmışlardır.
Şekil 2.23 rac-MPTL’nin kinetik rezolüsyonu
Enzim olarak 2g Pseudomanas cepacia lipaz (PCL) kullandıkları tepkimeyi dolgulu yatak reaktörde (yükseklik=20cm, hacim= 50 mL) 37 0C’ta gerçekleştirmişlerdir (Şekil 2.24). Reaksiyon karışımı (siklohegzan, su, rac-α-methyl-β-propiothiolaktone) reaktöre akış hızı 2.8 mL/dk olan bir pompa ile beslenmiştir. Reaktörden çıkan sıvı, ekstraksiyon kolonuna beslenmiş, suyla doyurulan siklohegzan substrat rezervuarına beslenirken MMPA’nın tümü sulu faza geçmiştir. Bu sayede siklohegzan geri kazanılmıştır. Aynı zamanda bu ekstraksiyon kolonunun kullanılması ürün inhibisyonunuda önlemiştir.
Jeong et al. (2000) farklı substrat derişimlerinde deneyler yapmışlar ve 50mM’ın üstündeki substrat derişimlerinde inhibisyonun olduğunu görmüşlerdir. Bu nedenle reaksiyon hacmi toplam 20mL olan çalışmalarında her iki durumda da (hem tutuklanmış hem de serbest enzim) substrat derişimini 50mM olarak tespit etmişlerdir.
Jeong et al. (2000) tepkimenin dönüşüm ve ees değerlerini hem tutuklanmış hem de serbest enzim için hesaplamışlardır. Yapılan hesaplamalar sonucunda hem tutuklanmış hem de serbest enzim için yaklaşık aynı değerler bulunmuş (Şekil 2.25). ees değeri altı saatten sonra 100’e ulaşmış ve ilerleyen zamanla değişmemiştir. Dönüşüm değeri ise altıncı saatte %60 lara ulaşmış ve yine bu değerde ilerleyen zamanla değişim göstermemiştir.
Şekil 2.24 Dolgulu yatak reaktör tepkime sistemi
(1: Cam kolon reaktör, 2: Substrat rezervuarı, 3: Ekstraksiyon kolonundan çıkan sıvı faz, 4: Ekstraksiyon kolonundan çıkan siklohegzan, 5:Su ceketi, 6: Su banyosu, 7 ve 7’: Pompa)
Şekil 2.25 Dolgulu yatak rektörde serbest ve tutuklanmış enzim için tepkime profili (rac-MPTL derişimi: 50mM, toplam reaktör hacmi: 20mL, enzim: 2g, akış hızı:1.8mL/dk, ▼: Serbest enzim dönüşümü, ●: Serbest enzim için ees,
♦:Tutuklanmış enzim dönüşümü, ■: Tutuklanmış enzim için ees).
Ujang et al. (2003) Candida rugoza lipaz katalizli ±2-(4-klorofenoksi)propionik asidin 1-bütanol ile kinetik rezolüsyonunu incelemişlerdir. Dolgulu yatak reaktörde çalışmadan önce, sistem için en iyi çalışma koşullarını belirlemek için kesikli sistemde deneyler yapmışlar. Bu çalışmalarda 0.1-0.4g lipaz, 10-20mL 0.1M rasemik ±2-(4- klorofenoksi) propionik asit ve 0.3M 1-bütanol içine eklenmiştir. Tepkime orbital karıştırıcıda 40oC’ta ve 180 rpm karıştırma hızında gerçekleştirilmiş. Gerçekleştirilen kesikli deneylerle çözücü türünün, sıcaklığın ve enzim miktarının tepkime üzerine etkileri araştırılmıştır. İleri aşamalarda tepkimeler dolgulu yatak reaktörde gerçekleştirilmiştir. Dolgulu yatak reaktörde çalışılırken 2.7g ham enzim cam kolona (1.5*30cm2) doldurulmuş ve substrat çözeltisi reaktöre bir pompa ile beslenmiştir.
Substrat çözeltisi 0.1M rasemat ve n-hegzanda çözünmüş 0.6M bütanol kullanılarak hazırlanmıştır. Sürekli çalışmalarında zamanla dönüşümün ve enantiyomerik aşırılığın nasıl değiştiği gözlenmişlerdir.
.
Ujang et al. (2003) yüksek ee değeri elde etmek için öncelikle farklı lipazların ve
CCl4+ hegzan (50:50 v/v) varlığında ulaşılmıştır. Ancak CCl4 doğaya zararlı olduğu ve toksik etkileri bulunduğundan dolayı n-hegzan kullanılmıştır (Çizelge 2.3).
Çizelge 2.3 Farklı lipaz ve çözücü varlığında ee değerleri (Ujang et al. 2003)
Enzim Çözücü Enzim
miktarı (g)
Toplam tepkime hacmi
(mL)
Zaman (h)
Dönüşüm %ee S-asit
PS amano Dietil eter 0.1 10 24 N/C -
PS amano Asetonitril 0.1 10 24 N/C -
PS amano CCl4 0.4 20 24 N/C -
PS amano CCl4+hegzan 0.4 20 24 N/C -
PS II amano CCl4 0.1 20 24 N/C -
PS II amano CCl4+hegzan 0.1 20 24 N/C -
Candida rugosa
Asetonitril 0.1 10 24 1.7 2
Candida rugosa
Dietil eter 0.1 10 24 11.5 10.3 Candida
rugosa
CCl4 0.2 10 24 50-54 100
6 17 20
Candida
rugosa CCl4+hegzan 0.2 10 24 63 100
6 21 29
Novozyme 435
Asetonitril 0.1 20 1.5 8.2 7.7
Novozyme Dietil eter 0.1 20 1.5 17.2 12
Novozyme CCl4 0.1 20 0.5 27.5 20
1.5 70.3 33
Novozyme CCl4+hegzan 0.1 20 0.5 38.4 23.4
1.5 73.4 22.2
N/C, dönüşüm yok.
Şekil 2.26’te CCl4 kullanılarak gerçekleştirilen tepkimede zamanla dönüşümün ve ee değerinin değişimi verilmiştir. 24 saat sonra S-asit için ee, %100’e ulaşmıştır. ees’ye bağlı olarak hesaplanan enantiyoseçimlilik (E) 92-102 aralığında çıkmıştır.
