T.C.
ERC YES ÜN VERS TES FEN B MLER ENST TÜSÜ
YOLOJ ANAB M DALI
Ephestia kuehniella Zell (PYRALIDAE: LEPIDOPTERA) ÜZER NE RADYASYON ETK N TEK HÜCRE JEL
ELEKTROFOREZ TEKN (KOMET TEST ) LE ZLENMES
Haz rlayan Handan KILIÇO LU
Dan man
Prof. Dr. Ayd n . TUNÇB LEK
Yüksek Lisans Tezi
Eylül 2012 KAYSER
Bu çal madaki tüm bilgilerin, akademik ve etik kurallara uygun bir ekilde elde edildi ini beyan ederim. Ayn zamanda bu kural ve davran lar n gerektirdi i gibi, bu çal man n özünde olmayan tüm materyal ve sonuçlar tam olarak aktard ve referans gösterdi imi belirtirim.
Handan KILIÇO LU
YÖNERGEYE UYGUNLUK SAYFASI
Ephestia kuehniella Zell (Pyralidae: Lepidoptera) Üzerine Radyasyon Etkisinin Tek Hücre Jel Elektroforez Tekni i (Komet Testi) le zlenmesi adl Yüksek Lisans tezi, Erciyes Üniversitesi Lisansüstü Tez Önerisi ve Tez Yazma Yönergesi’ne uygun olarak haz rlanm r.
Tezi Haz rlayan Dan man
Handan KILIÇO LU Prof. Dr. Ayd n . TUNÇB LEK
Biyoloji ABD Ba kan Prof. Dr. Nusret AYYILDIZ
ÖNSÖZ / TE EKKÜR
Tez çal mam n tüm a amalar nda yard m ve de erli önerilerini esirgemeyen dan man hocam Prof. Dr. Ayd n . TUNÇB LEK’e ve sayg de er hocam Ar . Gör. Ülkü CANPOLAT’a te ekkürlerimi bir borç bilirim.
Bunun yan nda laboratuar çal malar a amas nda desteklerini esirgemeyen Uzman Biyolog Nizamettin YAZICI, G da Mühendisi Yakup EREL, Yrd. Doç. Dr.Servet ÖZCAN, Ar . Gör. Sevgi BAKIR, Ar . Gör. Arzu YAY, Sunay TEK N, Dilek DABANLI ve Metin KILIÇ’a çok te ekkür ederim.
ki y ll k yüksek lisans dahil olmak üzere, alt y ll k üniversite hayat mda da dualar ve desteklerini esirgemeyen sevgili aileme te ekkürlerimi borç bilirim.
Bu çal may FBY-10-3305 kodlu proje ile destekleyen Erciyes Üniversitesi Ara rma Projeleri Birimine te ekkür ederim.
Handan KILIÇO LU Kayseri, Eylül 2012
(KOMET TEST ) LE ZLENMES
Handan KILIÇO LU
Erciyes Üniversitesi, Fen Bilimleri Enstitüsü Yüksek lisans Tezi, Eylül 2012
Tez Dan man : Prof. Dr. Ayd n . TUNÇB LEK
ÖZET
Bu çal mada E. kuehniella Zell (Lepidoptera: Pyralidae) üzerine radyasyon etkisini tek hücre jel elektroforez tekni i (komet testi) ile tespit çal mas yap lm r. E. kuehniella Zell (Lepidoptera: Pyralidae)’n n ergin, larva ve pupalar 0, 50, 100, 150 ve 200 Gy dozlar nda nlanm r. Erginle yapt z çal mada kontrol gurubuna göre radyasyon dozu artt kça DNA’n n kuyruk olu turma yüzdesi de artm ve DNA’da farkl komet görüntüleri izlenmi tir. Bu dozlar n erginde yüksek dozlara gerek kalmadan DNA’ya zarar verdi i tespit edilmi tir. Erginde kuyruk uzunlu u 27.514 ( m) iken 50 Gy’de 94.875 ( m) olarak ölçülmü tür. DNA komet yöntemi DNA k klar çabuk, hassas güvenli ve oldukça ucuz ölçebilen bir yöntemdir.
Anahtar Kelimeler: DNA, komet testi, radyasyon, Ephestia kuehniella
THE SINGLE CELL GEL ELECTROPHORESIS TECHNIGUE (COMET ASSAY) FOR MONITORING RADIATION EFFECTS ON Ephestia kuehniella
ZELL (PYRALIDAE: LEPIDOPTERA)
Handan KILIÇO LU
Erciyes University, Graduate School of Natural and Applied Sciences M.Sc. Thesis, September 2012
Thesis Supervisor: Prof. Dr. Ayd n . TUNÇB LEK
ABSTRACT
In this study, the effect of radiation was determined in E. kuehniella Zell ( Lepidoptera:
Pyralidae) with single cell gel electrophoresis (comet test). Adult, larvae and pupae of E. kuehniella Zell (Lepidoptera: Pyralidae) were radiated with 0, 50, 100, 150 and 200 Gy doses. In our study with adults, as the radiation dose increased, percentage of tail formation of DNA was also increased and different comet images were observed in comparison with control group. These dosages were seen to damage DNA without higher dosage amounts. While the extent of tail was measured 27.514 ( m) in adults, it was 94.875 ( m) in 50 Gy. DNA comet method is a quick, sensitive safe and reasonably cheap method in measuring DNA breaks.
Keywords: DNA, comet assay, radiation, Ephestia kuehniella
Ephestia kuehniella Zell (PYRALIDAE: LEPIDOPTERA) ÜZER NE
RADYASYON ETK N TEK HÜCRE JEL ELEKTROFOREZ TEKN
(KOMET TEST ) LE ZLENMES
YÖNERGEYE UYGUNLUK SAYFASI ... ii
KABUL VE ONAY SAYFASI... iii
ÖNSÖZ ... iv
ÖZET ... v
ABSTRACT ... vi
NDEK LER ... vii
TABLOLAR L STES ... x
EK LLER L STES ... xi
... 1
1. BÖLÜM GENEL B LG LER 1.1. Kullan m Alanlar ... 10
1.2. Uygulama Protokolü ... 11
1.3. Komet Tekni ini Etkileyen Faktörler ... 14
1.4. Komet Tekni inin Avantajlar ... 14
2. BÖLÜM GEREÇ VE YÖNTEM 2.1. Böcek Yeti tirilmesi... 16
2.1.1. Ephestia kuehniella (Zeller, 1879) (Lepidoptera: Pyralidae)... 16
2.1.2. Ergin, Larva ve Pupalar n Toplanmas ... 18
2.1.3. E. kuehniella Ergin, Larva ve Pupalar n I nlanmas ... 19
2.2. Tek Hücre Süspansiyonlar n Haz rlanmas ... 19
2.2.1. Lamlar n Kaplanmas ... 19
2.2.2. Lizis ... 20
2.2.3. Elektroforez... 21
2.2.4. Boyama A amas ... 21
2.3. Mikroskopta Foto raf Çekme ... 22
2.4. Veri Analizi... 23
3. BÖLÜM BULGULAR 3.1. E. kuehniella Erginlerine Radyasyon Etkisi... 24
3.2. E. kuehniella Larvalar na Radyasyon Etkisi... 31
3.3. E. kuehniella Pupalar na Radyasyon Etkisi ... 31
4. BÖLÜM TARTI MA, SONUÇ VE ÖNER LER 4.1. Tart ma ... 33
4.2. Sonuç ve Öneriler... 35
KAYNAKLAR ... 37
ÖZGEÇM ... 42
TABLOLAR L STES
Tablo 3.1. E. kuehniella erginlerin komet parametlerinin veri analizleri ...
EK LLER L STES
ekil 1.1. Alkali komet tekni inde kritik basamaklar n ematik gösterimi [31]...
ekil 1.2. Görsel Skorlama Tekni i (AU) le Hücrelerin S fland lmas (0:Hasars z DNA Görüntüsü, 1-4: Hasarl DNA’lar hasar n derecesine göre puanlanmas ) [21]. ...
ekil 1.3. Görüntü analizinin ematik ekli [28]. ...
ekil 2.1. E. kuehniella ergini
ekil 2.2. E. kuehniella larvas ...
ekil 2.3. E. kuehniella pupas ...
ekil 2.4. E. kuehniella’ n yeti me kaplar ...
ekil 2.5. E. kuehniella ergin toplama aspiratörü...
ekil 2.6. E. kuehniella erginlerinin tüplere al nmas ve nlanmaya haz rlanmas ...
ekil 2.7. Hücre süspansiyonunun kar lma a amas ...
ekil 2.8. Hücre süspansiyonunun lama yay lmas ...
ekil 2.9. Preparatlar n lizis a amas ...
ekil 2.10. Elektroforez tamponu
ekil 2.11. Ethidium bromide ile preparatlar n boyama a amas ...
ekil 2.12. Elektron mikroskobu ve görüntü çekimi ...
ekil 2.13. Numunelerin görüntü analizindeki kafa ve kuyruk görüntüleri
ekil 3.1. E. kuehniella ergin kontrol (1) ...
ekil 3.2. E. kuehniella ergin kontrol (2) ...
ekil 3.3. E. kuehniella ergin 50 Gy (1)...
ekil 3.4. E. kuehniella ergin 50 Gy (2)...
ekil 3.5. E. kuehniella ergin 100 Gy (1)...
ekil 3.6. E. kuehniella ergin 100 Gy (2)...
ekil 3.7. E. kuehniella ergin 150 Gy (1)...
ekil 3.8. E. kuehniella ergin 150 Gy (2)...
ekil 3.10. E. kuehniella ergin 200 Gy (2)...
ekil 3.11. E. kuehniella larvas nda tek hücre jel elektroforez yöntemi ile radyasyon sonucu hasara u ram DNA’lar n görüntüleri. I-0 Gy (kontrol); II- 50 Gy;
III- 100 Gy; IV- 150 Gy; V- 200 Gy.
ekil 3.12. E. kuehniella pupas nda (a ve b) kontrol grubu ...
ekil 3.12. E. kuehniella pupas nda (a ve b) 100 Gy...
KISALTMA VE S MGELER
Gy : Gray l : Mikro litre ml : Mili litre
C : Celcius derece
60C : Kobalt 60 Sn : Saniye dk : Dakika M : Molar
SDS : Sodyum dodesilsülfat V : Volt
mg : Mili gram
% : Yüzde
Ülkemizde tar msal üretimin önemli k sm olu turan tah l ürünleri depolama döneminde birçok zararl taraf ndan tahrip edilmektedir. Ephestia. kuehniella, E.
cautelle, Lasioderma serricorne, Oryzaephilus surinamensis, Plodia interpunctella, Rhyzopertha dominica, Sitophilus spp., Tribolium spp. ve Trogoderma granarium ülkemizde s k rastlanan önemli depo zararl lar r [1].
Zararl kontrolü gerek sa k aç ndan, gerekse ekonomik aç dan önemli zararlara neden oldu undan yap lmas artt r. Bu amaçla çe itli yöntemler uygulanmaktad r.
Uygulanan bu yöntemler de böcekler hakk nda elde edilen bilgiler artt kça de ebilmektedir. En yayg n olarak kullan lan yöntem insektisit olarak adland lan kimyasal preparatlar n kullan r. Ancak; gerek kimyasal preparatlar n çevreye ve canl lara verdi i zararlar n anla lm olmas ve gerekse de böceklerin bu tür bile iklere kar olu turduklar direnç mücadele yöntemlerini temelinden de tirmi tir. Yap lan ara rmalar n sonuçlar na paralel olarak çevreye ve do al hayata en az zararl , böceklerde ba kl k olu turmayan, sadece hedef al nan böcekleri etkileyip do al denge aç ndan gereksinim duyulan böceklere zarar vermeyen mücadele yöntemlerinin geli tirilmesi sa lanm r. Zararl böceklerle mücadelede günümüze kadar biyolojik mücadele strateji ve yöntemleri de ik ekillerde incelenmi ve uygulanm r. Bu yöntemlerden birisi olan gama radyasyonu depo zararl lar na kar uygulanabilir bir alternatiftir. Bu uygulama h zl ve etkili bir yöntemdir. Ayr ca bu uygulama sonucunda fosfine kar direnç olu turmu zararl n kontrolü de sa lanabilir. Depolanm ürünlerdeki zararl lar n gama radyasyonuna kar tolerans nda farkl klar vard r. Buna ilaveten belirli bir evrede olan (ergin, larva, vb.) böcek türünün iyonize radyasyona kar hassasl da belirlenebilir. Çünkü bireyin baz hayat evrelerinde öldürücü seviyenin alt ndaki nlamada geli mesini devam ettirebilme kabiliyeti vard r [2].
Raporlara göre fiziksel ajanlar (s cak, so uk, bas nç, ses, elektromanyetik m ve elektrik ak ), gama radyasyonu, X nlar , kimyasal bile ikler canl hücredeki DNA’ya zarar verebilirler [3]. Diploid (2n kromozom ta yan hücre) memeli hücrelerinde 1 Gray (Gy) iyonize radyasyon ortalama 1000 tek ve 30 çift zincir k na yol açt bilinmektedir. lk olarak 1960’lar n ortalar nda E. coli’de yap lan çal mada radyasyon sonucu olu an DNA zincir k klar McGrath ve Williams taraf ndan tespit edilmi tir [4].
DNA zincir hasarlar belirlemede çe itli metotlar geli tirilmi tir. Genotoksik veya mutajenik etkilere sahip olan fiziksel veya kimyasal maddelerin (pestisitler, gama veya UV klar) hedef organizma üzerinde belirli bir periyot ve konsantrasyonda DNA hasar olu turup olu turmad komet analiziyle belirlenebilir. DNA üzerinde stres faktörlerinin hasar olu turup olu turmad , e er hasar olu turuyor ise hasar derecesinin belirlenmesi hedef organizman n gelece i aç ndan önemlidir. imdiye kadar DNA hasar n belirlenmesi ile ilgili çok say da teknikler kullan lm r. Bunlar n birço unun pahal ve uzun çal ma süresi gerektirmesi, kimi zaman da beklenen ba ar n elde edilememesi bu alandaki güçlükleri ortaya koymaktad r [5].
Son y llarda t p ve biyoloji alanlar nda yukar da belirtilen sorunlara cevap verebilecek
‘tek hücre jel elektroforez’ veya ‘komet analizi’ moleküler test sistemi gibi yöntemler geli tirilmi tir. Bu metot sayesinde DNA’da hasar olup olmad , varsa hasar seviyelerinin anla lmas ile farkl bir boyut kazanm r [6]. DNA hasar ölçmek ve analiz etmek amac yla kullan lan h zl , basit, duyarl ve yayg n kullan m alan na sahip bir tekniktir. lk defa 1978 y nda Rydberg ve Johanson taraf ndan DNA sarmal klar n ölçülmesi amac yla kurulan, daha sonra 1984 y nda Östling ve Johanson taraf ndan geli tirilen teknik nötral pH’daki lysing artlar nda uygulanarak DNA çift sarmal k klar tayin etmede kullan lm r. 1988 y nda Singh ve arkada lar taraf ndan protokolde birtak m de iklikler yap larak yöntem alkali lysing ko ullar nda uygulanm r. Singh ve arkada lar n komet yöntemi protokolü bugün küçük de ikliklerle dünya genelinde en yayg n kullan lan protokoldür [7].
Bu teknikte hücreler, agaroz jelle kapl lamlara gömülür. Bu hücreler yüksek tuz tamponu ve deterjanlar taraf ndan lizis edilir. Nötral ko ullar alt nda kromatinler elektroforez yöntemiyle serbest kal r (pH: 9.5). DNA; floresan boya ile boyand ktan sonra (ethidium bromide) “kuyruk” ve “ba ” yap lar ndan bir komet olu ur [8].
Zincir k lmas yla olu an ba ve kuyruktaki DNA miktar orant r. Bu yöntem hemen hemen tüm ökaryot hücrelerinde özellikle erken ortaya ç kan ya da tamir edilememi , DNA’da ortaya ç kan hasarlar bulmaya yard mc olur. Çe itli amaçlara ula mak için farkl modifikasyonlu komet tekni i geli tirilmi tir. Bu yöntemlerden en çok kullan lan tek ve çift zincir k klar tespit edebilen alkali komet tekni idir [9].
Hasar parametrelerini ölçmek için birçok görüntüleme sistemi uygulanm r. En çok kullan lan yöntem ise çekirdek merkezinden kuyruk sonuna do ru ölçülen kuyruk uzunlu u, kuyruktaki DNA yüzdesi ve kuyruk momentidir (kuyruk momenti= kuyruk uzunlu u kuyruktaki DNA yüzdesi) [10].
Bu çal mada ülkemizde yayg n olarak bulunan ve depolanm ürünlerde önemli zararlara neden olan Ephestia kuehniella (Lepidoptera: Pyralidae) üzerine radyasyonun meydana getirdi i de ikliklerin komet yöntemiyle izlenmesi amaçlanm r. Farkl dozlardaki nlaman n böcek popülasyonunda ve farkl hayat safhalar nda etkisi tespit edilmi tir. Bu yöntemde radyasyona maruz kalan bireylerde bir direnç olu mad için sadece hedef organizmay etkilemi tir. Böylelikle radyasyonun hücre üzerindeki olas etkileri ortaya konmu tur.
1. BÖLÜM GENEL B LG LER
nsanlar n, böceklerin do rudan veya dolayl zararlar ndan kurtulma gayretlerinin ba lang çok eskilere dayanmaktad r. Genel bir deyi le, insanlar yarat ld klar günden beri, böcekleri yok etmek veya hiç olmazsa zararlar ndan kurtulabilmek için, ra malar na ra men bunda hâlâ tamamen ba ar olamam lard r. Halen, insanlar elde edecekleri ve ettikleri ürünlerinin en az onda birini böceklere kapt rmaktad rlar [11].
Biyolojik kontrolün uyguland en yayg n organizma grubu böceklerdir. Dünya genelinde 543’ü a n böcek türüne kar 1200’den fazla biyolojik kontrol program uygulanm r ve ço unun amac do al dü manlar n korunmas ve yeti tirilmesi programlar na dayan r. Hedef türlerin en önemlilerini Homoptera, Diptera, Hymenoptera, Coleoptera ve Lepidoptera tak mlar na ait zararl lar olu turmaktad r [12].
Lepidoptera tak ndan önemli bir tür olan un güvesi Ephestia kuehniella’n n erginleri dumanl gri renkte ve 10-14 mm boyunda olup, ön kanatlar üzerinde enine zikzak bantlar bulunmaktad r, arka kanatlar sar ms beyaz renkte, geni ve uçlar saçakl r ve kanat aç kl 16-25 mm’dir. Yumurtalar oval ve beyaz renklidir. Larvalar krem renkte ve k llarla kapl , k l diplerinde kahve renkte pigment halkalar bulunmakta ve olgun larvalar 10-19 mm boyunda, pupalar ise sar ms kahve renkte ve 9 mm boyundad r. Un güvesinin larvalar birinci derecede un ve mamullerinde, ikinci derecede tah llarda zarar yapmaktad r. Bu türün larvalar ördükleri a lar ile unlarda topaklanmalara neden olmakta, beslenmeleri sonucu g da maddelerini kirletmekte, k ma sonucu bozulma ve koku malar n ortaya ç kmas na sebep olmaktad r. Di iler çiftle tikten sonra yumurtalar un, tah l taneleri ile di er g da maddeleri, depo veya de irmenlerdeki çatlak veya delikler ile makine aksam na yap rmaktad r. Bir di i ya am boyunca 100- 600 adet yumurta b rakmakta ve yumurtalar 4-6 gün içinde aç lmaktad r. Yumurtalardan kan larvalar ilk devrelerde kendine undan veya di er g da parçac klar ndan yap lm bir k f yaparak bunun içerisinde beslenmektedir. Larva be deri de tirmekte, olgun larva g da ortam terk ederek depolardaki yar k, çatlak ve girinti gibi yerlerde kokon örerek pupa olmaktad r. Böcek, geli me süresini normal artlarda 8-9 haftada
tamamlamakta ve y lda 3-4 döl vermektedir. Erginler bir iki hafta kadar ya amaktad r [13].
E. kuehniella pek çok üründe zarar meydana getirmektedir. Un, incir, kuru üzüm, makarna, m r, ehriye, yulaf, irmik, bisküvi, bu day, pirinç, kepek, erik kurusu, eftali kurusu, ay çiçe i, pestil, ceviz içi, f nd k ve iç badem üzerinde belirlenmi tir [14].
Tar msal ürün ve g dan n; depolanm ürün zararl lar ndan korunmas üretici, i letme ve ihracatç lar için ya amsal öneme sahiptir. Ülkemizde depolarda ve i letmelerde ürünlerin zararl lardan korunmas nda en yayg n yöntem pestisit kullan r.
Depolanm ürün zararl lar ile mücadele amac ile dünyada ve ülkemizde yayg n olarak insektisitler kullan lmaktad r. Bu amaçla kullan lan insektisitler zararl lar k sa sürede öldürmesinin yan s ra çevreye ve insan sa na zarar verebilmektedir. Ülkemizde 1998 y nda hasat sonras uygulamalarda yakla k 297 ton pestisit kullan ld kay tl r. Kullan lan pestisitlerden, kal insektisitler (255 ton)’den 20 tonu bo depo ilaçlamalar nda ve 235 tonu ise ürüne uygulama yöntemi ile kullan lm r. Bu dönemde fümigantlardan metil bromit (Mbr) kullan yakla k 40 ton olmu tur [15]. Depolarda kullan lan birçok pestisite zararl lar n direnç geli tirdi i bilinmektedir. Depolarda kullan lmakta olan malathion, chlorpyrifos-methyl, fenitrothion, pirimiphos-methyl, etrimfos ve benzeri birçok etkili maddeye kar baz zararl lar n direnç geli tirdi i bildirilmektedir [16]. 1950’den beri pestisit kullan 12 kat artm , buna ba olarak da ilaca dayan kl tür say 1960’da 50 civar nda iken 1990’da 490’a ula r [17].
Bu yüzden ara rmac lar kontrol için geli mi metotlar bulma ihtiyac duymu lard r.
Ülkemizde depolanm ürün zararl lar ile sava mda zaman zaman radyasyon ve mikrodalga uygulamalar n da kullan labilece i bildirilmekle birlikte, yayg n bir kullan söz konusu de ildir [18]. Gama nlar gibi iyonize nlar n mikroorganizmalar üzerindeki etkileri hücre içerisine giren nlar n atomlardan elektron uzakla rarak iyonize moleküller olu turmas ile gerçekle tirilir. Bunun sonucu hücre DNA’s ve membran n fonksiyonlar nda önemli ölçüde de imler olu ur ve serbest radikaller meydana gelir. Serbest radikallerin reaktiviteleri de ikincil de imlere yol açar. Mikroorganizmalar n radyasyona kar olan dirençleri radyasyon dozuna, mikroorganizman n cinsine, spor veya vejetatif formda olu una, ortam n bili imine ve cakl a göre de ir. nsan ve hayvanlar 0,005–0,01 kGy, böcekler ise 0,001–0,1 kGy düzeyindeki n dozu ile letal etkilenirler [19]. Dü ük dozda nlama (1 kGy’den az) dalar kemirgenlerden ar nd rmak ve bu zararl lar karantina alt na almak için
kullan labilir. Giderek artan say da ülke g da nlama tekni ini kabul etmi tir. Ayn zamanda, nlanm g da belirleme yöntemleri yetkililer taraf ndan gerekli k nm r [20]. Ayr ca özellikle üçüncü dünya ülkelerinde yer ve israf her zaman bir sorun olu turdu u için g day korumak ve g da kaynakl hastal klar n s kl azaltmak için radyasyon kullan büyük faydalar sa layabilir. Radyasyonun kullan ld baz çal malar a da verilmi tir:
Buzdolab nda et ve et ürünlerinin raf ömrünü uzatmak, Baharatlarda bozulmaya yol açan organizmalar n azaltmak, Patates ve so an n çimlenmesinin engellenmesini sa lamak, Tah llardaki böcek ve parazitlerin yok edilmesi,
Meyve olgunla ma sürecini geciktirmek,
Et, kümes hayvanlar ve su ürünleri sterilizasyonu [21].
Birçok böcek, radyasyona yüksek tolerans olan farkl la hücrelerden olu ur.
nlamaya ba olarak hasarl hücreler bölünmü veya farkl la mam hücrelerden tipik olarak çok daha dayan kl r. Ancak, gonadlarda (e ey bezlerinde) olu an kök hücreler nlamayla genellikle kolayca öldürebilen hücrelerdir. Biyolojik sistemlerde iyonize radyasyonun ayn zamanda reaktif radikallere yol açt da bilinmektedir. Reaktif oksijen türleri ve hücre bile enlerinin yap sal bütünlü ünü sa layan antioksidanlar gibi serbest radikaller aras nda da uygun bir denge sa lanmal r. E er serbest radikal düzeyinde bir dengesizlik varsa DNA, ya lar ve proteinler gibi hassas biyolojik yap lar zarar görebilir. Bu ara rmalar, böcek geli im evrelerinde iyonize radyasyona kar tolerans n oldu unu ortaya koymaktad r. Holometabolik böceklerde (tam ba kala m geçiren böcekler), pupa evresinde doku ve organlar tekrar yap land için bu fazdaki böcekler zararl ajanlara kar daha hassast r. Yap lan çal malarda, larva ve yeti kinlere göre pupada komet parametrelerini kapsayan kuyruktaki DNA miktar üç kat daha fazla oldu u gözlemlenmi tir. Pupa faz nda apoptozis olay (hücre ölümü) larva ve yeti kine göre daha fazla olmas bu olay aç klamaktad r [22].
Genetik olaylar n moleküler düzeydeki temeli genetik materyal görevini üstlenen nükleik asitlerin yap ve özelliklerine dayan r. Nükleik asitlerin iki türü olan deoksiribonükleik asit (DNA) ve ribonükleik asit (RNA) temelde ayn yap sal özelliklere sahiptir. DNA sadece kal tsal bilgiyi ta yan makro moleküller olmay p bu
bilgiyi protein sentezine aktarmaktan da sorumludur [23]. DNA kolay zarar görebilen bir moleküldür ve üzerinde sürekli olarak hasar olu maktad r [24]. DNA üzerinde kendili inden de imler sonucu veya çevresel etmenler sonucu hasar meydana gelebilmekte, olu an hasar DNA onar m sistemleri taraf ndan giderilmekle birlikte, hasar n çok fazla oldu u veya onar m sistemlerinin yetersiz kald durumlarda DNA üzerinde olu an hasar mutasyona veya hücre ölümüne neden olmaktad r [25].
Kendili inden de imler sonucu olu an DNA hasar n nedenleri aras nda; DNA sentezi s ras nda bazlar n yanl e le mesi, pürin ve pirimidin bazlar n ketoenol tautomerizm ve deaminasyon (bir aminoasit ya da ba ka bir organik bile ikten bir -NH2
(amino) grubunun ayr lmas ) sonucu kimyasal yap nda geli en de imler, DNA yap nda bulunan pürin ve pirimidin bazlar n termal dayan kl na ba olarak hidrolitik baz kayb ve hücresel metabolizman n yan ürünü olarak üretilen serbest radikallerin neden oldu u DNA hasarlar önemli yer tutmakta olup çevresel hasar ise fiziksel ve kimyasal hasar olmak üzere iki grupta incelenmektedir. DNA’n n bütünlü ünü bozup ve farkl DNA hasarlar n olu mas na neden olan fiziksel etkenler aras nda ultraviyole ve X- nlar önemli yer tutmaktad r. DNA hasarlar n olu mas na neden olan kimyasal ajanlar içinde, çevresel mutajen ve karsenojenlerin en geni grubu olan ve çe itli g da maddelerinde, antitümöral ilaçlarda ve tütünde bulunan alkilleyici maddeler, foto aktive olmu psoralenler gibi çapraz ba lay lar ve ksenobiotikler gibi elektrofilik reaktanlara metabolize edilebilen kimyasallar yer almaktad r. Hücre, DNA hasarlar na farkl metabolik yollar ile cevap verir. A r DNA hasarlar hücrenin apoptoz yolunu (kanserle en hücrenin programl olarak öldürmesi) aktive ederek hücreyi ölüme götürür. DNA hasar replikasyon s ras nda tamir edilemezse mutasyona ve sonuç olarak genomik karars zl a neden olabilmektedir [26].
Fizikokimyasal etkile im ile hücresel DNA; tek zincir k klar (SSBs), çift zincir klar (DSBs), DNA–DNA ve DNA–protein çapraz ba lar , pürin ve pirimidin bazlar nda hasar veren çe itli primer lezyonlar üretir. Memeli hücreleri bu tür zararlar için etkili bir enzimatik tamir mekanizmas na sahiptir. Fakat radyasyon etkisiyle olu an çift zincir DNA k klar geri dönü ümsüzdür. Böylelikle ortaya ç kan çift zincir DNA klar önemli mutajenik ve kanserojen lezyonlar na sebep olur. Bu onar lamayan DNA, kromozomal delesyon ve düzensiz (translokasyon ve aralar nda delesyon) birle melere yol açarak çe itli kanserleri ortaya ç kar r. Her zaman DNA hasar n izlenmesi için h zl ve duyarl yöntemler geli tirilmesine ihtiyaç duyulmu tur. Y llar
içinde, kromozomal anomaliler, mikronukleus ve karde kromatit de imi gibi rutin sitogenetik bir tak m göstergeler, iyonize radyasyonun genotoksik etkilerini tespit etmek için uygulanm r. Son y llarda komet analizi ( tek hücre jel elektroforezi) iyonize radyasyon taraf ndan olu turulan DNA hasar ve DNA hasar na yol açan mutajen ve kanserojen etkilerini izlemek için kullan lm r. Moleküler epidemiyoloji çal malar nda, komet analiziyle DNA hasar de erlendirilmesi bir belirteç olarak kullan lmaktad r. Komet analiz testi; birincil DNA hasar tespitinde ve tek hücre düzeyinde tamir çal mas na izin verir. Di er genotoksisite testler kar la ld nda, komet analizi en az zaman al r. Bu yöntem hassas, çe itli alanlarda kullan labilecek (biyomedikal ara rma, genetik toksikoloji, radyasyon biyolojisi, klinik ve moleküler epidemiyoloji, kanser radyoterapi analizi gibi) çok yönlü bir tekniktir [27].
Son 20 y lda DNA hasarlar belirleyebilen yeni metotlar n ara lmas yla belli bir düzeye gelinmi tir [28]. DNA’daki hasar düzeyinin ölçülmesinde kullan lan en yayg n ölçme yöntemlerinden birisi olan “Tek Hücre Jel Elektroforezi” (Single Cell Gel Electrophoresis) hassas, basit ve h zl bir görsel flüoresans tekni idir [29]. Teknik, hücrelerde çe itli ajanlar n indükledi i DNA hasar ve onar m bozukluklar n tayini amac yla genetik toksikolojiden moleküler epidemiyolojiye kadar pek çok alanda kullan lmakta olup “Komet Analiz” ya da “Microgel Electrophoretic Tecnique” olarak da adland lmaktad r [28, 29].
Genel olarak, canl dokulardan izole edilen çekirdek içindeki DNA, ince bir agaroz jel içine fikse edilir ve elektroforetik ortamda yürütülür. E er çe itli genotoksik ajanlarla hasarlanan DNA’lar tamir mekanizmalar ile tamir edilememi , tek veya çift DNA zincirlerinde k lmalar olu mu ise k lan farkl molekül a rl klar na ve farkl elektrik yüküne sahip k lm DNA molekülleri elektroforetik ortamda farkl h zlarda göç ederler. DNA molekülleri ethidium bromide gibi DNA spesifik boyalarla boyan p floresan mikroskop alt nda incelendi inde hasar n derecesine göre DNA’lar dairesel formdan kuyruklu y ld za benzer forma kadar çe itli derecelerde görüntüler olu turduklar ndan yönteme ngilizce “kuyruklu y ld z” anlam na gelen “Comet Assay”
ad verilmi tir. Tek hücre jel elektroforez veya komet analiz yöntemi ilk kez Östling ve Johansson (1984) taraf ndan temelleri olu turulmu daha sonra çe itli ara rmac lar taraf ndan günümüze kadar modifiye edilmi ve yeni teknikler ile birlikte sunulmu tur [30]. Bu uygulamada agarozda süspanse edilen radyasyona maruz kalm hücreler lam üzerine yay larak, yüksek tuz ve deterjanla liz edilmi ve ard ndan elektroforeze tabi
tutulduktan sonra DNA ba lay floresan boya olan akridin oranjla boyanm lard r [31]. Sonuçta k k içeren DNA’lar n gev edi ini, k lm DNA fragmanlar nedeni ile elektrik yük kazand ve çekirdekten anota do ru göç ederek kuyruklu y ld z görünümünü vermesinden dolay hasarl hücreleri “komet” olarak adland rm lard r.
Yine kuyruk uzunlu u DNA hasar saptamak için ölçülmü ve kuyruk uzunlu unun radyasyon dozunun bir fonksiyonu oldu u belirlenmi tir [32].
DNA çift sarmal k lmalar n tespitine izin veren nötral artlar, tek sarmal lmalar n belirlenmesine izin vermemektedir. Oysa DNA'da hasar olu turan ço u ajan, DNA çift sarmal ndan çok, DNA tek sarmal nda hasar meydana getirmektedir.
Bunun yan nda nötral artlarda proteinler tam olarak uzakla lamamaktad r. Bu nedenlerden dolay 1988'de Singh ve arkada lar taraf ndan alkali artlar alt nda (pH>13), DNA tek sarmal k lmalar n tespitine izin veren komet tekni i olu turulmu tur. Kullan lan daha güçlü lizis ko ullar , proteinlerin %95'inden fazlas yok edebilmektedir. Alkali elektroforez uygulamas ile alkali oynak bölgelerin ve tek zincir k klar n basit ve duyarl bir ekilde tan nmas sa lanm r. Pek çok genotoksik ajan n çift zincir k klar ndan çok tek zincir k klar ve/veya alkali oynak bölgeler olu turmas nedeniyle metodun bu versiyonu daha çok önerilir hale gelmi tir [33].
Ara rmalar sonucunda nötral deney artlar n denatürasyonu h zland rmad ve bunun sadece çift ba hasar n tan nmas na yol açt gözlenmi tir. Bu ise genotoksisite hakk nda daha az hassas sonuçlar elde edilmesine yol açm r. Bu nedenle konu üzerinde çal malar devam etmi ve yöntemin alkali versiyonu Singh taraf ndan 1988 y nda bulunmu tur. Klaude ve Collins kuyruk olu turman n alt nda yatan nedenin alkali artlarda iplikçiklerin gev emesi oldu unu bulmu lar ve yapt klar çal malarda nötral artlarda kuyruk k sm nda sadece gev ek iplikçikler varken DNA parçac klar n alkali ortamda bulundu unu göstermi lerdir. Zira alkali ortamda ba lar n çözülmesi ve DNA moleküllerinin denatürasyonu daha kolayd r. Bu DNA’da tek ba hasar na neden olur. Bu nedenle son y llarda tercih edilen yöntem alkali ortamda DNA hasar çal mak olmu tur [34].
Di er ara rmac lar n da katk ile komet uzunlu u ve komet kuyruk mesafeleri gibi görüntü analizi ve ek parametrelerin tan lmas yönünde bir iyile me sa lanm r.
Genellikle, komet testinin manuel analizi üç bölümden olu ur:
i. Seçilmi hücre çekirde i ölçülecek,
ii. Etkile imli e ikler ile görüntü segmentasyonu, iii. Komet miktar [35].
Metot öncelikle alkali ortamlarda uyguland için alkali komet analizi ya da alkali tek hücre jel elektroforez eklinde kullan lm r. Ancak son y llarda, N/N (Nötr gev eme/Nötr elektroforez) ve A/N (Alkali gev eme/Nötr elektroforez) eklinde de uygulanmaya ba lanm r. Metodun alkali versiyonu, A/A (Alkali gev eme/Alkali elektroforez, pH 13) DNA’n n çift ve tek sarmal yap da olan hasarlar ölçmek için kullan lmaktad r. Sadece genotoksik ve mutajenik maddeler de il, ayn zamanda oksidatif stres de DNA üzerinde hasar olu turdu undan, bu çal ma konular içinde de yer alabilecek önemli bir yöntemdir [30].
Elektroforez ve lizis a amalar n pH’s na ba olarak tekni in duyarl de ebildi inden nötral ve alkalin lizis solüsyonlar s ras yla çift ve tek sarmal
lmalar belirlemek için kullan lmaktad r (Tablo 1.1.).
Tablo 1.1. Komet yöntemiyle farkl pH’larda tayin edilebilen DNA hasar tipleri [22].
pH:7-8 pH: 10-12 pH>13
Çift sarmal k klar Çift sarmal k klar Çift sarmal k klar Çapraz ba lar Tek sarmal k klar Tek sarmal k klar
Eksizyon tamir bölgeleri Eksizyon tamir bölgeleri Çapraz ba lar Çapraz ba lar
Alkali ortamda aç a ç kan hasarlar
1.1. Kullan m Alanlar
Komet tekni i tek bir hücrede DNA hasar n direk tayininin yan s ra, bir popülasyondaki tüm hücrelerin ayn oranda hasara u ray p u ramad n tespitine, dolay yla da bir tedavi s ras nda hücrelerin cevab n özellikle radyoterapi ve kemoterapi rejimlerinde tümör cevab n saptanmas na yard mc olabilmekte, dirençli hücre popülasyonunun tan mlanmas sa lamaktad r. Komet tekni i pek çok deneysel
artlarda DNA hasar ve onar inceledi inden, son y llarda genotoksisite ve DNA onar m mekanizmalar n incelemesinde kullan artan bir yöntemdir. Yöntem tek hücre süspansiyonu eklinde elde edilebilen hemen hemen her ökaryot hücrede DNA hasar ve onar tespit etmektedir. Oldukça küçük hacimde örneklerle çal labilmekte, sonuçlar bir günde elde edilebilmektedir. Yöntem alkali elüsyon (kromatografi i lemi ile bir maddeyi, durgun ve hareketli s fazlar aras ndaki da lma fark na dayanarak ad m ad m yürüterek ba ka maddelerden ay rma i lemi) gibi di er uzun DNA analizleri kadar duyarl r [36].
Günümüzde komet tekni i insan popülasyonlar ndan al nan lenfosit örneklerinde oksidatif hasar, UV ve iyonize radyasyona duyarl klar n incelenmesi yönünden ba ar bir ekilde uygulanmaktad r. Özellikle izleme (görüntüleme sistemi) çal malar nda, meslekleri nedeniyle veya çevresel ya da kazayla çe itli kimyasal maddelere maruz kalan ki ilerde, DNA hasar n incelemesinde son y llarda ra bet gören bir tekniktir [36, 37].
Komet ölçümü insan çal malar nda kullan labilecek en uygun testlerdendir. Çünkü radyoaktif maddelerle i aretleme gibi zararl i lemleri içermez ve kolayl kla görünebilir hücrelere uygulanabilir [37].
1.2 Uygulama Protokolü
Tekni in uygulanmas nda tek tabakal jel ve sandviç jel olmak üzere iki tip jel modeli vard r. Daha yayg n olarak kullan lan, sandviç modeldir. Gömülen bu hücreler, lizis solüsyonunda bekletilir. En çok tercih edilen yöntem, en az bir saat süreyle, pH>10- 12'de, deterjanla ve yüksek tuz konsantrasyonunda hücrelerin bekletilmesi eklindedir ekil 1.1). Elektroforezden önce lamlar, alkali elektroforez solüsyonunda DNA sarmal n ayr lmas için bekletilir. Bu solüsyon pH>12 ve dü ük tuz konsantrasyonunda olmal r. Uygulanacak olan elektroforez süresi ve voltaj hücrelerdeki DNA göçünü etkiledi i için, her denemede standart seçilen bir tanesi kullan lmal r. Elektroforezi takiben lamlar n y kanmas için en çok tris tamponu tercih edilir. En son olarak DNA ba lay boyalarla (akridin oranj, ethidium bromide, propidyum iyodür, DAPI gibi) flüoresans renk olu turulur [29].
ekil 1.1. Alkali komet tekni inde kritik basamaklar n ematik gösterimi [38].
Teknikte hasars z hücrelerin incelenmesinde yuvarlak, kenarlar daha az yo un olmak üzere ortas parlak bir k görünümüdür. Hücrelerin bu görünümü göç etmemi olarak de erlendirilir. E er DNA hasar olu maya ba lam ise göç uzunlu u fragmentlerin miktar na, DNA zincir k lmalar na ve alkali-labil bölgelerin seviyesine ba olarak de iklik gösterece inden, normalde düzgün kenarl olan görüntü DNA k klar n çekirdek d na göçmesi nedeniyle düzensiz kenarl bir görünüm al r. Hasar n iddetine göre merkezden kenara do ru uzama olu ur. Bu görünüme gerilmi ya da dü ük dereceli göç ad verilmektedir. Hasar artt kça hücreler kuyruklu y ld z (komet), yüksek dereceli göç eklini al r. Son a ama ise apoptozistir. Bu uzama hasar ile do ru orant r. Ayr ca kuyruktaki floresan yo unlu u da hasar n derecesine paraleldir. Fakat bu yakla m hasarl hücreler aras ndaki tahribat n büyüklü ü hakk nda bilgi vermekte yetersiz kalmaktad r. Bu nedenle hasarl hücreler, olu an hasar n derecesine göre DNA görüntüleri çe itli alt kategoride s fland larak puanland r. Hasar bulunmayan DNA’lar 0, hasar olan DNA’lar hasar n derecesine göre ekil 1.2.’de görüldü ü gibi 1 den 4’e kadar puanland r ve sonuçlar görsel skorlama (AU) ile de erlendirilir [26].
ekil 1.2. Görsel skorlama tekni i (AU) ile hücrelerin s fland lmas (0:hasars z DNA görüntüsü, 1-4: hasarl DNA’lar hasar n derecesine göre puanlanmas ) [26].
Belli bir bölgedeki DNA miktar , o bölgedeki floresan yo unlu u ile do ru orant r.
Bu özellikten yararlanarak dijital görüntü sistemlerinde ve analiz yaz m programlar ndaki ilerlemeye paralel olarak daha hassas ve do ru sonuç veren miktar tayini yöntemleri geli tirilmi tir. Hasarl hücrelerin ba uzunlu u, ba ve kuyruktaki DNA yüzdesi, kuyruk uzunlu u ve kuyruk moment gibi çe itli komet parametreleri ölçülebilmektedir [39].
Kuyruk uzunlu u, kuyruktaki DNA ve DNA da komet analizinde kullan lan temel parametrelerdir. Di er tüm ölçümler yukar da bahsedilen 3 veriden elde edilir. Bunlar aras nda kuyruk momenti ve kuyruk uzunlu u en s k kullan lanlar olmas na ra men, önerilen ve kullan gittikçe artan ölçüm parametresi kuyruk DNA yüzdesidir. Çünkü bu parametre kometlerin görünür k sm r ve DNA k k frekans ile do ru orant r.
Kuyruk momenti; kuyruk uzunlu u ve kuyruk içindeki toplam DNA oran n çarp olarak tan mlanmaktad r. Ara rmac hangi ölçüm parametresini kullan rsa kullans n, parametreler çal malarda aç kça not edilmelidir [40].
Geli mi laboratuarlarda ise genellikle görüntüleme analizlerinden yararlan lmaktad r.
Son y llarda ise ölçümler LSM (Laser-scanning microscopy) teknolojisiyle geli tirilmi tir. Böylece sarmal k lmalar ndaki farkl klar kolayl kla belirlenebilmektedir [41].
Deney hücre düzeyindeki DNA zarar ölçme esas na dayanmaktad r. DNA’s zarara ram hücre, kafa ve kuyruk diye 2 k mdan meydana gelmi tir. ekil 1.3.’de “Kafa”
bölgesi çekirdek d na göç etmeyen, “kuyruk” ise parçalanmaya ve yap sal kayba ba olarak çekirdek d na göç etmi DNA’y belirtir. [34].
ekil 1.3. Görüntü analizinin ematik ekli [34].
1.3. Komet Tekni ini Etkileyen Faktörler
Komet tekni inin farkl uygulanmas sonuçlar etkilemektedir. Örne in, elektroforez artlar (süre, uygulanan voltaj), lizis solüsyonu artlar (tuz konsantrasyonu, süre ve pH), metodun hassasiyetini etkilemektedir. Bu nedenle deneylerde artlar standart tutulmal r [39].
1.4. Komet Tekni inin Avantajlar
Yöntem in vivo (canl içerisinde) modellerde herhangi bir dokuya da uyarlanabildi inden, sadece h zl prolifere (ço alan) olan hücrelerde uygulanabilir olan di er genotoksisite testlerinden daha üstündür. Ayn zamanda tek bir doku hasar belirlemek de mümkündür. Komet tekni inin avantajlar a da özetlenmi tir.
Az say da hücre gerektirir
De ik hücre ve doku gruplar na uygulanabilir Kolay uygulanabilir
Hassast r zl r Ekonomiktir Güvenilirdir
Çe itli türlerde DNA hasarlar tespit edebilir Tek hücre seviyesinde bilgi edinilebilir
Endüstriyel, çevresel ve genetik toksikoloji alan ndaki çal malarda kullan labilmektedir [39].
Komet yöntemi kolay olmas na ra men baz önemli dezavantajlar da vard r. Deneyimli bir personele ihtiyaç vard r. Farkl ara rmac lar n de ken becerileri, zor verileri do rudan bir kar la rma yapmas sa larken; ara rmac lar n yorgun olmas ve konsantrasyon bozuklu u yanl verilerin al nmas na sebep olabilir. Görüntü analizi iki bölüme ayr lm r:
1) Otomatik hücre tan ma ve komet s fland rma 2) Komet parametrelerin ölçülmesi eklindedir.
Deney a amas tamamland ktan sonra çekilen görüntülerin analizlerinin yap labilmesi için algoritmalara dayal matematiksel hesaplamalar geli tirilmi tir [35].
2.BÖLÜM
GEREÇ VE YÖNTEM
2.1. Böce in Yeti tirilmesi
2.1.1. Ephestia kuehniella (Zeller, 1879) (Lepidoptera: Pyralidae) Sistematikteki yeri:
Tak m: Lepidoptera Familya: Pyralidae
Cins: Ephestia
Tür: Ephestia kuehniella Zeller
ekil 2.1. E. kuehniella ergini
ekil 2.2. E. kuehniella larvas
ekil 2.3. E. kuehniella pupas
Besin ortam nda istenmeyen zararl lar n elimine edilmesi için sterilizasyon i lemi gereklidir. Bunun için besi yeri haz rlamada kullan lan un 65°C’ye ayarl etüvde 10 saat süreyle bekletilmi ve steril edilen besi yeri polietilen torbalarda saklanm r. ekil 2.3.’de E. kuehniella için besi yerinin 1 kg un içerisinde %5 bira mayas ve 30 gr bu day tohumu ilave edilerek haz rlanmas belirtilmekte iken besi yeri modifiye edilerek 2 k m bu day unu, 1 k m m r unu ve 1 k m kepek kar kullan lm r.
E. kuehniella stok kültürü haz rlan rken sert beyaz küvetler içerisine besin konulmu ve içerisine hassas terazide tart lan 100 mg yumurta homojen olarak kar lm r.
ekil 2.4. E. kuehniella’ n yeti me kaplar
Larvalar n hava almas ve d ar kaçmalar n engellenmesi için küvet kapa n ortas nda 5 cm. çap nda bir daire kesilerek ç kar lm ve bo lu a gergin tülbent bez yap lm r. Kültür, 27 ± 1°C ve %70 ± 5 nispi neme ve 16: 8 (Ayd nl k: Karanl k) saatlik nlama süresine (fotoperyot) ayarlanan yeti tirme odas nda üretilmi tir.
Bir litrelik plastik kavanozun alt k sm kesilerek yumurtalar n geçebilece i geni likte tül elek yerle tirilmi ; kavanozun kapa nda ise 5 cm çap nda bir daire kesilerek ç kar lm ve gergin bir tülbent bez yap lm r. Bu ekilde haz rlanan yumurtlatma kaplar içerisine aspiratörle ekil 2.4. toplanan erginler konmu ve yumurtlamalar sa lanm r.
24 saat sonra elekten a ya dökülen yumurtalar beyaz kâ da al nm , ka tlar aras nda aktar larak böcek pulu ve di er vücut parçalar ndan ar nd lm ve petri kaplar na konarak 4°C’de saklanm r.
ekil 2.5. E. kuehniella ergin toplama aspiratörü
2.1.2. Ergin, Larva ve Pupalar n Toplanmas
Cam tüplerin her birine 0, 50, 100, 150 ve 200 Gy kalemle yaz lm ve içerisine E.
kuehniella ergin (1 günlük) ve olgun larva (22 günlük) ve pupalar (1 günlük) her tüpün içinde 10 birey olacak ekilde konmu tur. ekil 2.5.’deki gibi tüplerin a pamukla kapat lm r.
ekil 2.6. E. kuehniella erginlerinin tüplere al nmas ve nlanma için haz rlanmas
2.1.3. E. kuehniella Ergin, Larva ve Pupalar n I nlanmas
Ergin, larva ve pupalar nlama merkezinde (60Co-499 sn) 0, 50, 100, 150 ve 200 Gy dozlar nda nlanm r. Tüpler nlamadan sonra deney yap a amas na kadar buz kal plar n aras nda muhafaza edilmi tir.
2.2. Tek Hücre Süspansiyonlar n Haz rlanmas 2.2.1. Lamlar n Kaplanmas
0, 50, 100, 150 ve 200 Gy dozlar nda nlanm ergin ve larvalar beherlere aktar lm ve beher içindeki bireyler cam baget yard yla hafifçe ezilmi tir. Beherin içine 1,5 ml FTT (fosfatla tamponlanm tuz çözeltisi) pH: 7,4 ilave edilmi ve kar da 500 devirde 1 dk süreyle kar lm r ( ekil 2.6.). Beher içindeki hücre süspansiyonu süzülerek ependorf tüplerine aktar lm ve (+4 C) buzdolab nda 20 dakika dinlendirilmi tir.
ekil 2.7. Hücre süspansiyonunun kar lma a amas
Hücrelerin lama daha iyi tutunmas sa lamak için lam önceden ince bir agaroz (dam k suda %0,5lik agaroz) tabakas yla kaplanm ve 50 C’lik etüvde kurumaya rak lm r. 100 µl hücre süspansiyonu 1 ml döküm jel çözeltisi (FTT’de %0,8’lik agaroz) ile kar lm r. Bu kar n 100 µl’si önceden kaplanm lam üzerine aktar p pipet ucu ile kabaca yay lm r ( ekil 2.7.). Lamlar n üzeri hava kabarc klar önlenecek ekilde kapama lameli ile kapat lm r.
ekil 2.8. Hücre süspansiyonunun lama yay lmas
Hücre süspansiyonlar yayd z lamlar agaroz jelin kat la mas için 20 dk süre ile buz üzerinde bekletilmi tir. Kapama lameli bistürü ucu ile kenar çekilmi ve alttaki agaroz kapl lam dikkatlice kayd larak kaplama lamelinden ayr lm r.
2.2.2. Lizis
Lamellerden ayr lan lamlar dald rma sepetine dizilmi tir. ekil 2.8.’deki gibi lizis çözeltisinde (%1.25’lik) boyama kavanozunun sepeti kapatacak ekilde konulmu ve 2 dakika bekletilmi tir. Buradan al nan preparatlar 1 dk elektroforez çözeltisinde ( TBE:
0,045M ve SDS pH: 8,4) bekletilmi tir.
ekil 2.9. Preparatlar n lizis a amas
2.2.3 Elektroforez
Al nan preparatlar elektroforez tank na dizilmi tir ( ekil 2.9.). Lamlar elektroforez tank na t ra k mlar katota bakacak ekilde, lamlar aras nda herhangi bir bo luk rak lmadan dizilmi tir. Ak m kesildikten sonra lamlar tanktan dikkatlice ç kar lm r.
26 V ve 10 dk süreyle ak m uygulanm r. Elektroforezden al nan lamlar sepete al nm ve so uk suda 1 dakika bekletilerek nötralizasyonu sa lanm r. Ard ndan 50 C’lik etüvde 1 saat kurumaya b rak lm r.
ekil 2.10. Elektroforez tank
2.2.4. Boyama A amas
Boyama çözeltisi haz rlarken 100 mg ethidium bromide 100 ml balon jojede suyla eritilerek stok çözeltisi haz rlanm r. Buzdolab nda yakla k 1 hafta kadar k almayan cam kaplarda bekletilmi tir. Boyama i leminde stok çözeltisinden 2 ml ethidium bromide al nm ve boyama kavanozunda ( ekil 2.10.) boyama i lemi yap lm r.
Preparatlar 2 dk floresan boyaya (ethidium bromide) dald lm ve ard ndan boyama kavanozundan ç kart p saf suda 1 dk bekletilmi tir. Lamlar kurutulmadan hemen lamellerle kapat lm , mikroskop görüntüsü için haz r hale getirilmi tir.
ekil 2.11. Ethidium bromide ile preparatlar n boyama a amas 2.3. Mikroskopta Foto raf Çekme
Foto raf çekme i lemi, Olympus marka BX51 floresan mikroskobunda 1000 büyütmede yap lm r. Çekilen ergin, larva ve pupa görüntüleri kaydedilmi tir.
ekil 2.12. Floresan mikroskobu ve görüntü çekimi
2.4. Veri Analizi
DNA hasar n ölçülmesinde Comet Assay IV program ile hücre skorlamalar yap lm r. Bu skorlamalarda her bir grup için ba , kuyruk uzunlu u, kuyruk momenti, kuyruktaki DNA yüzdeleri hesaplanm r.
ekil 2.13. Numunelerin görüntü analizindeki kafa ve kuyruk görüntüleri
3.BÖLÜM BULGULAR
3.1. E. kuehniella Erginlerine Radyasyon Etkisi
0, 50 Gy, 100 Gy, 150 Gy, 200 Gy’den al nan görüntülerin (50 veri analizi) ortalamalar al narak de erlendirmeleri yap lm r. Bu sonuçlar do rultusunda E. kuehniella erginin kontrol grubunda kuyruk uzunlu u ortalama de eri 27.51 ( m) iken 50 Gy’de 94.87 ( m); 100 Gy’de 111.05 ( m); 150 Gy’de 166.00 ( m); 200 Gy’de 183.57 ( m) bulunmu tur (Tablo 3.1.). I nlama dozu artt kça kuyruk uzunlu u artarken kuyruk momentinde de art görülmü tür. Bu art lar kontrolde 5.12 ( m); 50 Gy’de 29.75 ( m); 100 Gy’de 65.82 ( m); 150 Gy’de 91.90 ( m); 200 Gy’de 111.92 ( m) olarak tespit edilmi tir.
Tablo 3.1. E. kuehniella erginlerin komet parametlerinin veri analizleri Komet parametleri
Doz (Gy) Kuyruk uzunlu u ( m) Kuyruk momenti ( m)
Ortalama de er Sapma aral Ortalama de er Standart sapma
Kontrol 27.51 3-75 5.12 0-32
50 Gy 94.87 4-250 29.75 0-148
100 Gy 111.05 76-169 65.82 24-121
150 Gy 166.00 98-244 91.90 37-177
200 Gy 183.57 131-278 111.92 51-252
ekil 3.1. E. kuehniella ergin kontrol (1) ekil 3.2. E. kuehniella ergin kontrol (2) ekil 3.1.’de sar kutu içine al nan kontrol (1) komet görüntüsünün analiz verileri kuyruk uzunlu u= 26.00 ( m), kuyruktaki DNA yüzdesi= 12.04, kafa uzunlu u= 67.00, kuyruk momenti= 3.13 ( m) olarak ölçülmü tür. ekil 3.2.’de sar kutu içine al nan kontrol (2) komet görüntüsünün analiz verileri kuyruk uzunlu u= 27.00 ( m), kuyruktaki DNA yüzdesi= 19.23, kafa uzunlu u= 61.00, kuyruk momenti= 5.19 ( m) olarak ölçülmü tür.
ekil 3.3. 50 Gy ile nlanm E. kuehniella erginlerinden elde edilen komet görüntüleri.
nün analiz verileri kuyruk uzunlu u= 81.00 ( m), kuyruktaki DNA yüzdesi= 30.34, kafa uzunlu u= 95.00, kuyruk momenti= 24.58 ( m) olarak ölçülmü tür. ekil 3.4.’te sar kutu içine al nan 50 Gy (2) komet görüntüsünün analiz verileri kuyruk uzunlu u=
41.00 ( m), kuyruktaki DNA yüzdesi= 12.13, kafa uzunlu u= 85.00, kuyruk momenti=
4.97 ( m) olarak ölçülmü tür.
ekil 3.5. E. kuehniella ergin100 Gy (1) ekil 3.6. E. kuehniella ergin 100 Gy (2) ekil 3.5.’te sar kutu içine al nan 100 Gy (1) komet görüntüsünün analiz verileri kuyruk uzunlu u= 169.00 ( m), kuyruktaki DNA yüzdesi= 51.34, kafa uzunlu u=
99.00, kuyruk momenti= 86.77 ( m) olarak ölçülmü tür. ekil 3.5.’te sar kutu içine al nan 100 Gy (2) komet görüntüsünün analiz verileri kuyruk uzunlu u= 100.00 ( m), kuyruktaki DNA yüzdesi= 43.09, kafa uzunlu u= 99.00, kuyruk momenti= 43.09 ( m) olarak ölçülmü tür.
ekil 3.7. E. kuehniella ergin 150 Gy (1) ekil 3.8. E. kuehniella ergin 150 Gy (2) ekil 3.7.’de sar kutu içine al nan 150 Gy (1) komet görüntüsünün analiz verileri kuyruk uzunlu u= 156.00 ( m), kuyruktaki DNA yüzdesi= 44.75, kafa uzunlu u=
127.00, kuyruk momenti= 69.82 ( m) olarak ölçülmü tür. ekil 3.8.’de sar kutu içine
al nan150 Gy (2) komet görüntüsünün analiz verileri kuyruk uzunlu u= 156.00 ( m), kuyruktaki DNA yüzdesi= 49.89, kafa uzunlu u= 111.00, kuyruk momenti= 77.82 ( m) olarak ölçülmü tür.
ekil 3.9. E. kuehniella ergin 200 Gy (1) ekil 3.10. E. kuehniella ergin 200 Gy (2) ekil 3.9.’da sar kutu içine al nan 200 Gy (1) komet görüntüsünün analiz verileri kuyruk uzunlu u= 175.00 ( m), kuyruktaki DNA yüzdesi= 46.65, kafa uzunlu u=
97.00, kuyruk momenti= 81.64 ( m) olarak ölçülmü tür. ekil 3.10.’da sar kutu içine al nan 200 Gy (2) komet görüntüsünün analiz verileri kuyruk uzunlu u= 170.00 ( m), kuyruktaki DNA yüzdesi= 50.77, kafa uzunlu u= 91.00, kuyruk momenti= 86.32 ( m) olarak ölçülmü tür.
3.2. E. kuehniella Larvalar na Radyasyon Etkisi
Deney sonucunda, larva safhas ndaki kontrol ve nlanm gruplar n görüntüleri çekilmi tir. Fakat her denemede farkl sonuçlar al nd için analizleri yap lamam r.
ekil 3.11. E. kuehniella larvas nda tek hücre jel elektroforez yöntemi ile radyasyon sonucu hasara u ram hücrelerdeki DNA görüntüleri. (I: 0 Gy (kontrol), II: 50 Gy, III: 100 Gy, IV: 150 Gy, V: 200 Gy).
0 Gy (kontrol), 50 Gy, 100 Gy, 150 Gy ve 200 Gy nlanm E. kuehniella larvalar n floresan mikroskobuyla yukar daki görüntüleri çekilmi tir. Bu görüntülerin nlama veya deney a amas ndan kaynaklanan sebeplerden dolay baz DNA parçalanmalar n olabilece i sonucuna var lm r.
3.3. E. kuehniella Pupalar na Radyasyon Etkisi
Deney sonucunda pupada görüntüler çekilmi tir. Çekilen görüntülerde kontrolde kuyruk olu umu görülmü , nlanm hücrelerde ise yuvarlak görüntüler tespit edilmi tir.
ekil 3.12. E. kuehniella pupas nda (a ve b) kontrol grubu
E. kuehniella larvas nda tek hücre jel elektroforez yöntemi ile radyasyon sonucu hasara ram hücrelerdeki DNA görüntüleri
ekil 3.13. E. kuehniella pupas nda (a ve b) 100 Gy
E. kuehniella larvas nda tek hücre jel elektroforez yöntemi ile radyasyon sonucu hasara ram hücrelerdeki DNA görüntüleri
4. BÖLÜM
TARTI MA, SONUÇ VE ÖNER LER
4.1. Tart ma
Çal mam zda E. kuehniella üzerine radyasyonun tek hücre jel elektroforez tekni i (komet tekni i) ile DNA üzerindeki etkisi ara lm r. Bu çal mam zda erginde doz artt kça DNA k klar n da artt komet tekni i ile gösterilmi ve bu bulgular n literatürle uyumlu oldu u görülmü tür.
yonize radyasyon, DNA baz bozukluklar , DNA-DNA çapraz ba lar , tek ve çift zincir lmalar gibi DNA lezyonlar meydana getirir. Kromatit zincirler ve kromozomlar içinde bo luk ve k lmalar en s k gözlenen radyasyona ba kromozomal lezyonlard r [42]. yonize radyasyon serbest radikaller vas tas yla hücresel DNA’da direkt ya da indirekt etkiye sahip bir ajand r. I nlama dozu artt kça hücrede döngü bozukluklar , anormal mitoz ya da hücre ölümlerinde de art olabilir. Radyasyon hasar n ilk hedefi çekirdekten ba layarak DNA’d r. Radyobiyolojide DNA hasar n de erlendirilmesinde zl ve daha hassas metotlara her zaman ihtiyaç vard r [43]. Son on y l içerisinde, DNA hasar seviyesinin tespitinde DNA komet yöntemi kullan nda art olmu tur. Komet tekni i; kimyasal genotoksititede (bir maddenin, hücredeki genetik materyal üzerindeki etkisi), insan görüntüleme sisteminde, moleküler epidemiyolojide (hastal klar popülasyon düzeyinde inceleyen bilim dal ), temel ara rmalarda kullan lan bir uygulamad r [44]. DNA komet yöntemi serbest radikaller taraf ndan meydana gelen hücre hasarlar n bulunmas nda daha fazla destek sa lamaktad r [22].
Bhalli ve ark., pestisitlerin insan sa ndaki etkisini bulmak için pesitisit üreten Pakistan’daki bir fabrikada çal an benzer ya larda 35 ki iyle bir deney yapm r. Bu deneyde DNA hasar ölçmek için komet test tekni ini kullanm lard r. Kontrol grubuna göre komet kuyruk uzunlu unda (ortalama standart sapma( m)) 19.98 2.87 vs. 7.38 1.48, P < 0.001) önemli bir art oldu u sonucuna varm lard r [45].
Hasan ve ark., depo zararl olan Rhyzopertha dominica (Coleoptera: Bostrichidae)’da yapt klar bir çal mada gama radyasyonunun DNA üzerindeki etkisini komet yöntemi ile analiz etmi lerdir. Bu analizlere göre kontrol grubuyla kar la rd klar nda, 40 ve 160 Gy dozlar aras nda kuyruktaki DNA yüzdesinde %15-30 aras nda art oldu unu
gözlemlemi lerdir. Dayan kl bireylerde kuyruktaki DNA% 0 Gy’de (konrol)= 14.62 1.08; 40 Gy’de= 30.12 5.17; 60 Gy= 44.57 7.64 olarak ölçmü lerdir. Kuyruk uzunlu unu ise 0 Gy’de (konrol)= 34.46 3.52 ( m); 40 Gy’de= 54.36 7.92 ( m); 60 Gy= 101.00 14.08 ( m) olarak ölçmü lerdir [46]. Yap lan ara rmalar gösteriyor ki her böce in geli im a amas ndaki radyasyona duyarl farkl k göstermektedir [47].
Bizim çal mam zda ise kuyruk uzunlu u 0 Gy’de (konrol) 27.51 ( m) ölçülürken 50 Gy’de 94.87 ( m) olarak ölçülmü tür.
Todoriki ve ark., kestane böce i olan Curculio sikkimensis (Heller) (Coleoptera:
Curculionidae) larvas nda radyasyon sonucu olu an DNA hasar komet yöntemi kullanarak bir çal ma yapm lard r. Bu çal malarda 1 ve 4 kGy dozlar kullanm lard r. 1 ve 4 kGy radyasyon aral nda DNA hasarlar n artt gözlemlemi lerdir. Hücre kar la lmalar sonucunda C. sikkimensis larvas nda de ik DNA fragmentleriyle birçok DNA hasar tespit etmi lerdir. Bu yöntemi kullanarak; kuyruk uzunlu u, kuyruk momenti ve kuyruktaki DNA yüzdesinde nlama dozu artt kça bu parametlerin de artt görmü lerdir [48]. Bizim çal mam zda ise larva evresindeki böceklere uygulanan 50, 100, 150 ve 200 Gy dozlar n DNA’ya verdi i zararlar gözlemlenememi tir.
Yine Hasan ve arkada lar n yapm oldu u ba ka bir çal mada m r böce i olarak da bilinen Sitophilus zeamais Motschulsky (Coleoptera: Curculionidae) geli me evrelerinde (larva, pupa ve ergin) gama radyasyonu etkisini (0.5 kGy ve1 kGy dozlar nda) komet yöntemi ile tespit etmi lerdir. Komet yöntemi ile S. zeamais’ n bütün geli me evrelerinde kuyruk uzunlu u ve kuyruktaki DNA yüzde verilerini ortaya koymu lard r. Gama radyasyonunun (Doz: Varyans oran (F)= 9.74; Olas k düzeyi (P)= 50.01; Evre: F= 12.26, p 0.01) büyük ölçüde DNA göçlerine sebep oldu unu görmü lerdir. S. zeamais larva, pupa ve ergininde, kontrol grubuyla kar la rd klar nda 0.5 kGy dozda %60-70 hasar olu urken 1kGy’de %100’lük bir hasar olu tu unu görmü lerdir. Erginde kuyruktaki DNA yüzdesini 0 kGy’de (kontrol)= 8.43 2.20 (ortalama standart sapma (%)); 0.5 kGy’de= 16.62 3.66; 1.0 kGy’de= 32.83 3.46 olarak ölçmü lerdir. Kuyruk uzunlu unu ise 0 kGy’de (kontrol)=19.67 4.94 (ortalama standart sapma( m)); 0.5 kGy’de= 68.28 10.14; 1.0 kGy’de= 85.48 7.87 olarak ölçmü lerdir. Yapt klar çal mada S. zeamais’ n pupa a amas n larva ve ergin amalar ndan daha hassas oldu unu gözlemlemi lerdir. [22]. Bizim çal mam zda ise
pupada yapt z denemelerde görüntüler al nm fakat görüntülerin analizleri yap lamam r.
Shahidi ve ark., prostat kanseri hastalar nda yapt klar bir çal mada gama n (60Co) kontrol grubuna göre kanserli lökosit hücrelerinde daha fazla DNA hasar oldu u gözlemlemi lerdir. Farkl gruplara ayn doz n uygulam lard r. 24 saat içinde (tamir mekanizmas ndan sonra) prostat kanseri olan hastan n lökosit hücrelerinde sa kl bireye göre %20 daha fazla DNA hasar oldu unu görmü lerdir [49].
4.2. Sonuç ve Öneriler
Deney sonuçlar na göre istatiksel veriler ortaya konulmu tur. Bu veriler sonuçlar na göre tablo olu turulmu ve görüntü analizleri yap lm r. E. kuehniella ergin, larva ve pupa evreleri nlanarak deneyler yap lm fakat bu deneylerin sonucunda larva ve pupa evrelerinden sonuç al namazken erginde sonuç al nm r.
E. kuehniella ergininde yap lan çal ma sonucunda elde edilen verilerin analizleri yap lm r. Bu analizlerden nlama dozu artt kça DNA’n n kuyruk olu turma yüzdesinin de artt sonucuna var lm r. Kontrolde kuyruk uzunlu u 27.514 ( m) iken 50 Gy’ de 94.875 ( m) olarak ölçülmü tür.
Bu deneylerin sadece E. kuehniella populasyonunda de il farkl böcek populasyonlar nda da denenebilece i sonucuna var lm r. Çal malar n ilerletilip böceklere göre doz ayarlamalar yap larak baz zararl etkilerinin giderilebilece i dü ünülmü tür. Böylelikle bu yöntemin, böceklerde yap lan radyasyon çal malar na alternatif olabilece i sonucuna var lm r.
Komet yöntemi; kolay uygulanabilen, güvenilir ve ucuz bir metot olarak biyolojik mücadelede yararl bir araç olacakt r. En küçük dozda olu an DNA hasarlar n tespitinde bile bu yöntem fayda sa layacakt r.
KAYNAKLAR
1. Karabörklü, S., 2008. Çe itli Bitkilerden Elde Edilen Uçucu Ya lar n Depolanm Ürün Zararl Böcekler Üzerindeki Öldürücü Etkilerinin Ara lmas , Erciyes Üniversitesi, Fen Bilimleri Enstitüsü, Yüksek Lisans Tezi, Kayseri, 99 s.
2. Tuncbilek, A.S., Canpolat, U., Ayvaz, A., 2009. Effects of gamma radiation on suitability of stored cereal pest eggs and the reproductive capability of the egg parasitoid Trichogramma evanescens (Trichogrammatidae:
Hymenoptera). Biocontrol Science and Technology, 19 (1): 179-191.
3. Lee, R.F., Steinert, S., 2003. Use of the single cell gel electrophoresis/comet assay for detecting DNA damage in aquatic (marine and freshwater) animals.
Mutat. Res., 544: 43-64.
4. Olive, P.L., 2007. Impact of the comet assay in radiobiology. Mutation Research- Reviews in Mutation Research, 3 pp.
5. WHO, 2009. The WHO Recommended Classification of Pesticides by Hazard and Guidelines to the Classification 2009. World Health Organisation, Geneva, 81 pp.
6. Kocyigit, A., Keles, H., Selek, S., Guzel, S., Celik, H. ve Erel, O., 2005. Increased DNA damage and oxidative stress in patients with Cutaneous leishmaniasis.
Mutation Research, 585 (1-2): 71-78.
7. Ak , N., 2008. Sigara Duman na Maruz Kalan Pasif çici Durumundaki Çocuklarda DNA Hasar n Ara lmas . Sa k Bakanl Haydarpa a Numune E itim ve Ara rma Hastanesi Çocuk Sa ve Hastal klar Klini i, Uzmanl k tezi, 70 s.
8. Vandghanooni, S., Eskandani, M., 2011. Comet assay: a method to evaluate genotoxicity of nano-drug delivery system. Research Center for Pharmaceutical Nanotechnology, Student Research Committee, Tabriz University of Medical Sciences, Tabriz, Iran. BioImpacts, 1 (2): 87-97.
9. Hovhannisyan, G.G., 2010. Fluorescence in situ hybridization in combination with the comet assay and micronucleus test in genetic toxicology. Molecular Cytogenetics, 3 (17): 1-11.
10. Singh, R.K., et all., 2010. Assessment of DNA damage by comet assay in Lymphocytes of workers cccupationally exposed to petroleum fumes.
International Journal of Genetics, 2 (1): 18-22.
11. Kansu, A., 1961. Böcek biyoloji ve ökolojisine ait ara rmalarda radyoizotoplar ndan istifade. A. Ü. Ziraat Fakültesi Bitki Koruma Kürsüsü Çal malar ndan, 2 (7): 24.
12. Driesche, V.G.R., Bellows, S.T., 1996. Biological Control. Section 1, Chapter 2, Kinds of Biological Control Targets, Agents and Methods, 21-23.
13. Esin, T., 1971. Hububat ve bakliyat ambar zararl lar mücadele talimat . T. C.
Tar m Bakanl Zirai Mücadele ve Zirai Karantina Genel Müdürlü ü, 21- 24.
14. Dabbalo lu, S., 2004. Parazitoit Bracon hebetor Say.(Hymenoptera: Braconidae) le Konukçular Plodia interpunctella Hübner (Lepidoptera: Pyralidae) ve Ephestia kuehiella Zeller (Lepidoptera: Pyralidae) Aras ndaki Biyolojik li kiler Üzerine Ara rmalar. Ankara Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü, Doktora Tezi, Ankara, 134 s.
15. Emekçi, M., Ferizli, A.G., 2000. Current status of stored product protection in Turkey. IOBC/WPRS Study Group Integrated Protection of Stored Products, Berlin, IOBC wprs Bulletin, 23 (10): 39-45.
16. Arthur, F.H., 1996. Grain protectants: current status and prospect for the future. J.
Stored Prod. Res., 32 (4): 293-302.
17. Driesche, V.G.R., Bellows S.T., 1996. Biological control, section 1, chapter 1, pest origins, pesticides and the history of biological control. 3-20.
18. Ferizli, A.G., Emekçi, M., 2003. Depolanm Ürün Zararl lar yla Sava m, Sorunlar ve Çözüm Yollar . A. Ü. Ziraat Fakültesi Bitki Koruma, 5-6.
19. Josephson, E.S., Peterson, M.S., 1983. Preservation of Food by Ionizing Radiation.
CRC Press. Boco Raton, FL, 1054 pp.
20. Koppen, G., Cerda, H., 1997. Identification of low-dose irradiated seeds using the neutral comet assay. Lebensm.-Wiss. U.-Technol., 30 (5): 452-457.
21. Rahman, R., Haque, A.K.M.M., and Sumar, S., 1995. Chemical and biological methods for the identification of irradiated foodstuffs. Nutrition & Food Science, (1): 4–11.
22. Hasan, M.M., et al., 2008. Detection of gamma radiation-induced DNA damage in maize weevil, Sitophilus zeamais Motschulsky (Coleoptera: Curculionidae) assessed using the comet assay. Int. J. Radiat. Biol., 84 (10): 815–820.
23. Sözbilir , N. B., 2007. Biyokimya. 1. Bask . Ankara: Güne T p Kitabevi, 632 s.
24. Fidan, A.F., 2007. Deneysel Diyabet Olu turulmu Ratlarda Diyete Kat lan Farkl Yap lardaki Saponin çerikli Bitkilerin DNA Hasar , Protein Oksidasyonu ve Lipid Peroksidasyonu ile Baz Biyokimyasal Parametrelere Etkilerinin Ara lmas . Afyon Kocatepe Üniversitesi, Sa k Bilimleri Enstitüsü, Doktora Tezi, Afyonkarahisar, 138 s.
25. Dinçer, Y, Akçay, T., 2000. DNA Hasar . Türk Biyokimya Dergisi, 25 (2): 73-79.
26. Yeni, D., Fidan, A.F., Gündo an, M., 2010. Spermatozoon’da tek hücre jel elektroforezi (SCGE) ile DNA hasar tespiti. F.Ü. Sa . Bil. Vet. Derg., 24 (3): 167- 173.
27. Garaj-Vrhovac, V. et al., 2002. Application of the alkaline comet assay in biodosimetry: assessment of in vivo DNA damage in human leukocytes after a radiation incident. Radiation Protection Dosimetry NuClear Techonology Publishing. 98 (4): 407–416.
28. Rojas, E., Lopez, M.C., Valverde, M., 1999. Single cell gel electrophoresis assay:
methodology and applications. J. Chromatogr B. Biomed Sci. Appl., 277 (1-2): 225-254.
29. Fairbain, D.W., Olive, P.L., O’Neill, K.L., 1995. The comet assay: A comprehensive review. Muation. Res., 339 (1): 37-59.
30. Dikilita , M., Koçyi it, A., 2010. Canl larda “tek hücre jel elektroforez” yöntemi ile DNA hasar analizi (teknik not): comet analiz yöntemi. HR. Ü. Z. F.
Dergisi, 14 (2): 77- 89.
31. Ostling, O., Johanson, K.J., 1984. Microelectrophoretic study of radiation-induced DNA damage in individual mammalian cells. Biochemical and Biophysical Research Communications, 123 (1): 291-298.
32. Ertürk, ., 2001. Sevofuloran n DNA Hasar Üzerine Etkilerinin Bening ve Maling Olgularda Comet Assay Yöntemi le De erlendirilmesi. Ankara Üniversitesi p Fakültesi Anesteziyoloji ve Reaminasyon Anabilim Dal , Uzmanl k Tezi, Ankara.
33. Fidan, A.F., 2008. DNA Hasar Tespitinde Tek Hücre Jel Elektroforezi. AKÜ-Fen Bilimleri Dergisi, 8 (1): 41-52.
34. Ba aran, A.A., 2004. Farmakognozide tek hücre jel elektroforezi uygulamalar . 14.
Bitkisel laç Hammaddeleri Toplant , Bildiriler, 29-31 May s 2002, Eski ehir, 4 s.
35. Böcker W., et al., 1999. Automated comet assay analysis. Wiley-Liss, Inc.
Cytometry, 35 (2): 134–144.
36. Faust, F., Kassie, F., Knasmuller, S., et al., 2004. The use of the alkaline comet assay with lymphocytes in human biomonitoring studies. Mutat. Res., 566 (3): 209-29.
37. Collins, A., Dusinska, M., Franklin, M et al., 1997. Comet assay in human biomonitoring studies: reliability, validation, and applications. Environ Mol Mutagen, 30 (2): 139-46.
38. Tice, R.R., Agurell, E., Anderson, D., et al., 2000. Single cell gel/comet assay:
guidelines for in vitro and in vivo genetic toxicology testing. Environ Mol Mutagen, 35: 206-21.
39. Karakükcü, Ç., 2008. Sar kl Yeni Do anlarda Bilirubin Ve Fototerapiden Kaynaklanabilecek Genotoksik Etkilerin Alkali Comet Tekni i le De erlendirilmesi. Erciyes Üniversitesi T p Fakültesi Biyokimya Anabilim Dal , Yay nla T pta Uzmanl k Tezi, Kayseri, 89 s.
40. Tice, R.R., et al., 2000. Single cell gel/comet assay: guidelines for in vitro and in vivo genetic toxicology testing. Environmental and Molecular Mutagenesis, 35: 206-221.
41. O'Neill, K.L., Fairbairn, D.W., Standing, M.D., 1993. Analysis of single-cell gel electrophoresis using laser-scanning microscopy. Mutation Research/Genetic Toxicology, 319 (2): 129-34.
42. Akpolat, M., 2007. Gamma Radyasyonun leum Kadehsi Hücrelerinde Olu turdu u Hasarlara Kar Curcumin ve C Vitamininin Koruyucu Etkilerinin I k ve Elektron Mikroskobik Düzeylerde ncelenmesi. Trakya Üniversitesi Sa k Bilimleri Enstitüsü Morfoloji Anabilim Dal Histoloji ve Embriyoloji Bilim Dal , Doktora Tezi, 96 s.
43. Jagetia, G.C., Rao, S.K., 2011. Assessment of radiation-induced DNA damage by comet assay in cultured HeLa cells treated with guduchi (Tinospora cordifolia Miers) before exposure to different doses of -radiation.
Research In Pharmaceutical Biotechnology, 3 (7): 93-103.
44. Muid K.A., et al., 2012. Zinc phosphide induced DNA damage in the blood cells of Gallus sp. using comet DNA assay. American Journal of Agricultural and Biological Sciences, 7 (1): 82-87.
45. Bhalli, J.A., et al., 2006. DNA damage in Pakistani pesticide-manufacturing workers assayed using the comet assay. Environmental and Molecular Mutagenesis, 47 (8): 587–593.
46. Hasan, M.M., et al., 2006. Soft-electron beam and gamma-radiation sensitivity and DNA damage in phosphine-resistant and -susceptible strains of Rhyzopertha dominica. J. Econ. Entomol., 99 (5): 1912-1919.
47. Willard, W.K., Cherry, D.S., 1975. Comparative radiosensitivity in the class.
Insecta. Journal of Theoretical Biology, 52 (1): 149–158.
48. Todoriki, S., et al., 2006. Assessment of electron beam-induced DNA damage in larvae of chestnut weevil, Curculio sikkimensis (Heller) (Coleoptera:
Curculionidae) using comet assay. Radiation Physics and Chemistry, 75 (2): 292–296.
49. Shahidi, M., et al., 2010. Radiosensitivity and repair kinetics of gamma-irradiated leukocytes from sporadic prostate cancer patients and healthy individuals assessed by alkaline comet assay.
Iranian Biomedical Journal, 14 (3): 67-75.
ÖZGEÇM SEL B LG LER
Ad , Soyad : Handan KILIÇO LU Uyru u: Türkiye (TC)
Do um Tarihi ve Yeri: 10 Mart 1986, Antalya Medeni Durumu: Bekâr
Tel: +90 312 378 43 65
email:handankilic1986@hotmail.com M
Derece Kurum Mezuniyet Tarihi
Lisans Ni de Üniversitesi 2009
Lise Kanuni Lisesi 2004
YABANCI D L ngilizce
YAYINLAR
1. Tuncbilek, A.S., Kilicoglu H., Yazici, N., Ozcan, S., Erel, Y., Canpolat U.,Yay, A., Bakir, S., 2011. Detection of DNA damage in Ephestia kuehniella by single cell gel elektrophoresis after exposure to gamma radiation. Analele Universit ii din Craiova, seria Agricultur – Montanologie – Cadastru, 41 (2).
2. Tuncbilek, A. ., coglu, H., Yaz , N., Ozcan, S., Erel, Y., Canpolat U., Yay, A., Bak r, S., 2011. Detection of DNA damage in Ephestia kuehniella by single cell gel electrophoresis after exposure to gamma radiation. The XXXXth ESNA meeting, 7-10 September 2011, in Craiova, Romania, Book of Abstracts,. 109 p.
