P C R
Reaksiyonda kullanılanlar:
I. Kalıp DNA
a) PCR degrade olmuş DNA ile de çalışma imkanı veren bir teknik olmakla beraber özellikle hedef amplikonun boyu arttıkça kullanılacak DNA’nın bütünlüğü önem kazanır.
b) Kullanılacak genomik DNA’nın A260/A280 oranının temizliğinin bir göstergesi olarak 1.7-1.9 arasında olması gerekir.
c) A260 Nükleik asitlerin maksimum absorbans, d) A280 Proteinlerin maksimum absorbans,
e) A230 ise fenolün maksimum absorbans verdiği dalga boyudur.
f) +4 (kısa-orta süreli) veya -20oC’de (uzun süreli) saklanmalı. Genomik DNA esas itibariyle oda ısısında da stabil olmakla beraber daha güvenilir olan ısı ayarlı soğuk ortamlarda saklanmalıdır.
P C R
Reaksiyonda kullanılanlar:
II. Düz primer ve ters primer: Tasarım kriterlerine uygun olarak seçilmiş primerler genellikle 18-24 bç arasında olan oligonükleotidlerdir. Primerler üreticilerinden 3 farklı yöntemden biri ile saflaştırılmış olarak alınır.
Tuzdan arındırma (desalting)- En ucuz yöntemdir, ancak özellikle primerler dizi analizi benzeri uygulamalarda kullanılacaksa bu yöntem tercih edilmemelidir.
Kolon bazlı saflaştırma (OPC/HPSF benzeri)- Çok temiz sonuç veren tuzdan arındırma yöntemine göre pahalı ancak HPLC’ye göre ekonomik olan bir seçimdir.
HPLC- En başarılı saflaştırma yöntemi olmakla beraber maliyeti en yüksek olan seçimdir.
Genellikle liyofilize halde gelen primerler steril ortamda 100 pmol/ul olacak şekilde sulandırıldıktan sonra bu stoktan 10 pmol/ul’lik bir dilüsyon hazırlanıp reaksiyonlarda kullanılabilir.
P C R
Reaksiyonda kullanılanlar:
III. dNTP: Eşit konsantrasyondaki dATP, dGTP, dCTP ve dTTP’nin karışımıdır.
Karışım halinde veya ayrı ayrı olarak satın alınabilir. Genellikle 100 mM konsantrasyonda satılan dNTP karışımlarının stok halinde 10 mM konsantrasyonda olması tercih edilir.
Herhangi bir kontaminasyon riskine karşı kullanıma açılan dNTP miktarı 200-300 ul üzerinde olmamalıdır. Bu amaçla dNTP hazır olarak geldiğinde veya laboratuvarda hazırlandığında küçük hacimlere bölünerek saklanmalıdır.
IV. MgCl2: Taq DNA polimeraz ile beraber gelen ve enzimin çalışması için gerekli kofaktör olarak görev alan Mg iyonunu sağlar. Genellikle 25 veya 50 mM stok konsantrasyonda gelir. Reaksiyondaki son konsantrasyonu 0.8-3 mM arasında değişir.
V. 10X buffer: Taq DNA polimeraz ile beraber gelen ve enzimin çalışması için gerekli stabil pH şartlarını sağlar. Reaksiyondaki son konsantrasyonu 1X olacak şekilde kullanılır.
P C R
Reaksiyonda kullanılanlar:
VI. Taq DNA Polimeraz: Thermus aquaticus adlı termofil bir bakteriden elde edilen ve PCR reaksiyonlarında kullanılan bu DNA polimerazların hata oranı 1x10-4’dir.
Enzimler protein oldukları için denatüre olma riski taşırlar, ayrıca ortam şartları aktiviteleri üzerine etki eder. Bu nedenle düşük ısıda saklanmaları gerekir.
Ancak düşük ısıda donacakları için denatüre olurlar. Bunu engellemek için enzim stokları gliserol içinde gelir ve -20oC’de saklanır. -80oC’de gliserol de donacağı için Taq pol’ın -80oC’de saklanması tercih edilmez.
Amplifiye edilecek bölge klonlanacaksa hatasız olması istenir. Bu nedenle hata oranı daha az olan enzimler tercih edilir.
a. Pfu polimeraz Pyrococcus furiosus’tan izole edilmiştir hata oranı 1.5x10-6 b. Vent polimeraz Thermococcus litoralis’ten izole edilmiştir hata oranı Taq
ile Pfu arasında seyreder.
P C R
Örnek Reaksiyon (50 ul toplam hacim için)
Stok Konsantrasyon/Miktar Son Konsantrasyon
Kalıp DNA 25-100 ng genomik DNA 0.5-2 ng/µl
Düz Primer 10 mM;10pmol/µl 0.2 pmol/µl
Ters Primer 10 mM;10pmol/µl 0.2 pmol/µl
dNTP 10 mM 200 µM
MgCl2 25 mM 0.8-3 mM
10X buffer 10X 1X
Taq DNA Polymeraz 5 U/ µl 0.3 µl
Toplam 50 µl (steril deionize su ile hacim tamamlanır)
P C R
Neredeyse hiçbir zaman tek bir reaksiyon kurulmadığı için muhakkak bir reaksiyon karışımı hazırlayın.
Tampon, primerler, MgCl2, dNTP, Taq pol ve sudan oluşan
Pipetleme hatalarını engellemek üzere karışım olması gerekenin %10 fazlası olacak şekilde hazırlanır.
Negatif kontrol
Kalıp DNA olmayan bir tüp hazırlanır.
Örnekler arası kontaminasyonu kontrol etmek üzere
Pozitif kontrol
PCR’da kullanılan reaktiflerin dolayısıyla sistemin işlediğinden emin olmak için çalıştığı bilinen bir DNA ve primer seti ile pozitif kontrol reaksiyon setine dahil edilmelidir.
Genel Problemler
Bant yok veya zayıf.
Kontaminasyon var.
Primer dimer oluşumu var.
Özgün olmayan bant(lar) var.
Kontaminasyon
Pre ve post PCR alanları muhakkak birbirinden ayrılmalı.
Mümkünse PCR laminar akışlı kabin içinde kurulmalı.
Bütün reaksiyon setlerinde muhakkak negatif kontrol bulunmalı
Reaktifler küçük hacimlere bölünüp saklanmalı. Problem yaşandığı takdirde atılmaları mümkün olduğunca ekonomik olmalı.
Filtreli uç kullanılmalı ki pipetler kontamine olmasın.
Bant yoksa veya zayıf ise…
Reaksiyona koymanı gereken bütün reaktifleri ilave ettiniz mi?
Lab defterinizi kontrol edin.
Reaksiyonu tekrarlayın.
Reaktiflerin konsantrasyonları doğru mu?
Kalıp
Primer
Taq
MgCl2
Hatalı primerler
Dizileri kontrol edin.
Yeni sentez veya yeni tasarım deneyin.
Bant yoksa veya zayıf ise…
Kötü kalıp
Agaroz jelde kalıp DNA’yı kontrol edin. DNA fazla degrade olabilir.
Kalıp DNA PCR inhibitörü içeriyor olabilir (fazla tuz, fenol gibi).
Optimal olmayan PCR şartları
Bağlanma ısısını düşürün.
MgCl2 konsantrasyonunu arttırın.
Özgün olmayan amplifikasyon var ise…
Özgün olmayan amplifikasyonu saptamak için
Amplikonları agaroz jelde yürütün.
Ürünün hedeflenen boyda olup olmadığını kontrol edin.
Bunu saptamak için bir moleküler ağırlık standardı kullanın (100 bç, 1 kb merdiven, l/HindIII gibi)
Özgün olmayan amplifikasyonu ortadan kaldırmak için
Amplifikasyon şartlarını sıkılaştırın
Bağlanma ısısını arttırın
MgCl2 konsantrasyonunu düşürün
Termal döngü koşullarını değiştirin
Uzama sürelerini ayarlayın
Döngü sayısını azaltın
Farklı primerler deneyin
PCR optimize ederken…
PCR son derece hassas bir işlemdir.
Herbir primer çiftinin ayrı ayrı optimizasyonu gerekir.
Farklı PCR cihazlarının (marka ve/veya model) kullanımı PCR’ın sonucunu etkiler.
Optimize edilmesi gerekenler:
Konsantrasyonlar
MgCl2 konsantrasyonu
Primer ve kalıp DNA konsantrasyonu
Fazla kalıp PCR’ı engelleyebilir. Kalıp gerekiyorsa seyreltilip kullanılmalıdır.
Termal döngü şartları
Bağlanma ısısı
Primer çiftinin Tmderecesine göre ayarlanır.
Uzama süreleri
Amplikonun uzunluğu dikkate alınır.
PCR optimize ederken…
Gradient PCR cihazları optimizasyon sürecini kolaylaştırır ve kısaltır
Bu tip cihazlarda 96’lık veya 48’lik bloğun herbir 8’lik
kolonuna farklı bağlanma ısıları uygulamak mümkündür.
PCR optimize ederken…
Touch-down (İnen) PCR
Özgün olmayan amplikasyondan yalnızca bağlanma ısısının arttırılması ve MgCl2 konsantrasyonunun düşürülmesi ile kurtulunamıyorsa:
Touch-down PCR denenir.
Yüksek bağlanma ısısı ile başlanır. (mesela 70oC)
Az sayıda da olsa hedef dizinin amplifiye olması beklenir.
Bağlanma ısısı döngü sayısı ilerledikçe düşürülür.
Amplifiye olmaya başlayan hedef dizinin kalıp popülasyondaki oranı arttığı için düşen ısıda artık yalnızca hedef dizi çoğalacaktır.
PCR Destek Kuvvetler…
DMSO %2-10 Fazlası Taq aktivitesini düşürür. Kalıp DNA’nın oluşturduğu ikincil yapıları çözer. Özellikle GC oranı yüksek hedef bölgelerin çoğaltılması için kullanılabilir.
Betain 1-1.7 M DMSO ile aynı amaçla kullanılabilir.
Formamid %1-5 Mümkün olduğunca az kullanılmalı.
İkincil yapıların önlenmesinde kullanılabilir.
Non iyonik deterjanlar (Tween 20-NonIdet P40- TritonX)
%0.1-1 arası kullanılabilir. %0.1 Taq’ı stabilize eder ancak
özgün olmayan amplifikasyonu teşvik edebilir. %0.5 kullanımı
daha garantilidir.
PCR optimize ederken…
7 deaza-2 deoksi guanozin. Stabil ikincil yapı oluşturan GC oranı çok yüksek hedef bölgelerde amplifikasyonu dGTP ile 1:3 oranında ilave edilmek suretiyle verimli bir şekilde sağlar.
BSA (bovine serum albumin) Eski DNA materyellerinden yapılan
amplifikasyonlarında kullanılabilir. PCR inhibitörlerinin etkisini
azaltır.
Hücre ve Mikroorganizmalara DNA Aktarımı
Prokaryotik hücreler:
Bu tip aktarımlar yani transformasyon klonlanmış DNA’nın amplifikasyonunu sağlar.
Transforme edilen gen ekspresyon vektörünün içinde ise ilgili genin ürününü elde etmekte kullanılır.
İki türlü yolu vardır:
Yüksek konsantrasyondaki Ca
2+içinde inkübasyon. Membran permeabilitesini arttırır bu yöntem.
Elektroporasyon: Özel cihazlar gerekir. Daha verimli transfer
sağlar ancak her tür/suş için farklı şartlar gerekir.
Kompetent hücre
Hem Ca
2+hem de elektroporasyon yönteminde öncelikli olarak hücrenin kompetent hale getirilmesi gerekmektedir.
Bu amaçla belli bir yoğunlukta üretilip toplanması ve tuzla yıkanması
gerekmektedir.
Ökaryotik hücreler
Ökaryotik hücrelere gen transferinde kullanılan birkaç çeşit yöntem bulunmaktadır.
Transfeksiyon transformasyon ile enfeksiyonun bir nevi karışımıdır.
Kalıcı (stable) transfeksiyonda DNA’yı alan hücreler raportör geni ifade etmeleri ile seçilirler (raportör gen higromisin veya neomisin gibi bir antibiyotik direnç geni olabileceği gibi yeşil fluoresan protein geni de olabilir.).
Bu tip hücrelerin klonlarından hücre hatları oluşturulabilir.
Geçici (transient) transfeksiyon aktarılan DNA’nın etkisini hemen görebilmek için seçilen bir yoldur. Sınırlı uygulaması vardır zira ilgilenilen geni taşıyan hücre sayısı değişkendir (kesin sayı transfeksiyonun verimine bağlıdır). Ayrıca aktarılan DNA’yı taşıyan hücrelerde bu DNA’nın kopya sayısı da değişkendir.
Ökaryotik hücreler
Transfeksiyon yolları:
Kalsiyum fosfat ko-presipitasyonu
DEAE-Dekstan aracılı transfeksiyon
Lipid aracılı transfeksiyon
Elektroporasyon
Mikroenjeksiyon
Virus aracılı transfer. Bu amaçla adenovirus, retrovirus veya SV40 kullanılabilir.
Ökaryotik hücreler
DNA transferinin verimini hücre tipine sıkı sıkıya bağlı olduğu için bir sürü emek ve zaman harcamadan önce kendi hücreleriniz için uygun olan protokolü iyice araştırın.
Literatür, Google ve bu işi bilenlere sorun/danışın.
Labınızda veya yardım alabileceğiniz bir labda kullanabileceğiniz bir elektroporatör olup olmadığından emin olun.
Birçok elektroporatörle bakteri, maya, memeli hücreye DNA aktarımı yapabilirsiniz.
Memeli hücre aktarımı için bazı model elektroporatörlere ilave aksesuar takılması gerekebilir.
Transformasyon ve transfeksiyonda kullanılan vektör hayati önem taşır.
İndüklenebilen vektörlerin yanısıra hem ökaryotlarda hem bakterilerde çalışan vektörler mevcuttur. Sorun öğrenin.
RNA
Son derece “çıtkırıldım” bir moleküldür.
Azami itina ile çalışılmasını gerektirir.
RNA çalışmaları için kullanacağınız cam/plastik eşyayı diğer malzemelerden ayrı bir dolap/rafa yerleştirin. Bunları DEPC’li sudan geçirdikten sonra steril edin.
RNA çalışmaları için kullanacağınız suyu %0.1 konsantrasyonda DEPC’li olarak hazırlayın. Bunun için 1 lt suya 1 ml DEPC ilave edip geceboyu çeker ocak altında manyetik karıştırıcıda karıştırdıktan sonra ertesi gün otoklavlayın.
Tris’li tampon çözeltileri DEPC’li su ile hazırlamayın.
DEPC Tris tamponları içinde etanol ve CO2’e ayrışır. Tris tamponun tamponlama özelliğini ortadan kaldırır.
RNA
RNA çalışmalarında kullandığınız kimyasalları ayrı bir raf/dolaba koyup üzerlerine yalnızca RNA çalışmaları için kullanılacağı ibaresini yazın.
Bu kimyasalların içine steril spatül ile girin.
RNA çalışmalarında kullandığınız tampon çözeltileri de ayrı bir köşede tutun ve üzerlerine yalnızca RNA çalışmaları için kullanılacağı ibaresini yazın.
RNazOFF, RNAZap, RNazAWAY benzeri ticari kimyasallar ortamdan Rnaz’ları uzaklaştıran kuvvetli deterjanlardır.
RNA elektroforezi için bir horizontal elektroforezi ayırmanızda fayda vardır.
Bu elektroforez kabin, tepsi ve taraklarını bu deterjanlarla yıkayıp, DEPC’li sudan geçirdikten sonra kullanın.
RNA İzolasyonu
Klasik metodda guanidium izotiyosiyanat kullanılır. Bu kimyasal hücrelerin parçalanması ile gerçekleşecek olan RNA degradasyonunu engeller.
Bu metoda dayanan izolasyon için ticari olarak Trizol, Tritidy, Tri reagent vb kimyasal ajanlar değişik firmalarca satılmaktadır.
Ayrıca kolon bazlı saflaştırma kitleri de birçok firma tarafından pazarlanmaktadır.
Özellikle kas gibi fibrotik dokulardan RNA izole etmek bir hayli zordur. Bu tip dokular için özel olarak üretilmiş kitler piyasada mevcuttur.
mRNA izolasyonu oligo dT rezinler kullanılarak gerçekleştirilir.
