T.C
NAMIK KEMAL ÜNİVERSİTESİ BİLİMSEL ARAŞTIRMA PROJELERİ KOORDİNASYON BİRİMİ (NKÜBAP)
BİLİMSEL ARAŞTIRMA PROJESİ SONUÇ RAPORU
NKUBAP.00.20.AR.12.03 nolu proje
FİBROMİYALJİ TANILI HASTALARDA COMT VE 5HT2A RESEPTÖR GEN POLİMORFİZMİNİN UYKU BOZUKLUĞU İLE İLİŞKİSİNİN ARAŞTIRILMASI
Yürütücü: Doç. Dr. Ayşe Banu SARIFAKIOĞLU
2016
ÖNSÖZ
Fibromiyalji sendromu, daha çok kadınlarda görülen, yaygın ağrı ve psikiyatrik semptomlarla karakterize bir hastalıktır. Uyku bozukluğu hastalığın ana
semptomlarından olup, diğer semptomları da olumsuz etkileyebilmektedir. Hastalığın etyolojisinde COMT ve 5HT2A gen polimorfizmlerinin rol alabileceği bildirilmektedir.
Ayrıca bu gen polimorfizmine sahip fibromiyalji hastalarında, hastalık semptomlarının daha kötü seyrettiğini bildiren çalışmalar da mevcuttur. Çalışmamızda COMT ve 5HT2A gen polimorfizmlerinin hastalığın en sık semptomu olan uyku bozukluğu ile ilişkisinin incelenmesini amaçlanmıştır.
Çalışmamız Namık Kemal Üniversitesi Tıp Fakültesi Fiziksel Tıp ve Rehabilitasyon Anabilim Dalı, Tıbbi Biokimya Anabilim Dalı ve Namık Kemal Üniversitesi Genetik Anabilim Dalı laboratuarında yapılmıştır. NKUBAP.00.20.AR.12.03 nolu ‘Fibromiyalji tanılı hastalarda COMT ve 5HT2A reseptör gen polimorfizminin uyku bozukluğu ile ilişkisinin araştırılması’isimli proje Namık Kemal Üniversitesi Bilimsel Araştırma Proje Birimi tarafından desteklenmiştir. Çalışmamızı bilimsel araştırma projesi olarak kabul edip destekleyen Namık Kemal Üniversitesi Rektörlüğü’ne en içten teşekkürlerimizi sunarız.
İÇİNDEKİLER
TABLO LİSTESİ 4
ÖZET 5
ABSTRACT 6
GİRİŞ 7
GEREÇ VE YÖNTEM 8
BULGULAR 11
TARTIŞMA 12
KAYNAKLAR 14
TABLOLAR 18
EKLER 21
TABLO LİSTESİ
Tablo 1. Fibromiyalji ve kontrol grubunun demografik verileri
Tablo 2. Fibromiyalji hastaları ve kontrol grubunda COMT, G102T ve 5HT2A gen allellerinin dağılımı
Tablo 3. Uyku bozukluğu olan FM ve kontrol grubunda COMT, G102T ve 5HT2A gen allellerinin dağılımı
ÖZET
Amaç: Fibromiyalji, yaygın ağrı ve hassasiyetle karakterize, genellikle somatik ve psikolojik semptomların da eşlik ettiği bir sendromdur. En sık görülen semptomlarından birisi uyku boukluğudur ve vakaların %95’inde görülür. Bazı çalışmalar FM hastalığının etyopatogenezinde bazı gen polimorfizmlerinin rol alabileceğini öngörmektedir. Bu çalışmanın amacı, FM hastalarında uyku bozukluğu ile COMT ve HT2 gen polimorfizmleri arasında ilişki olup olmadığını araştırmaktır.
Materyal Metod: çalışmaya 18-55 yaş arası tanısı alan kadın hastalar dahil edildi.
Yaş uyumlu sağlıklı gönüllüler kontrol grubunu oluşturdu. Tüm hasta ve kontrol grubunun demografik verileri kaydedildi. FM hastalarında ayrıca hassas noktalar, Türkçe geçerlilik ve güvenirliliği yapılmış Beck anksiyete ölçeği, Fibromiyalji etki anketi uygulandı. Uyku bozukluğunu değerlendirmek için FM ve kontrol grubuna Türkçe geçerlilik ve güvenirliliği yapılmış Pittsburgh uyku kalitesi indeksi (PUKİ) uygulandı. Hasta ve kontrol grubunun serotonin ve COMT gen polimorfizmleri incelendi ve PUKİ sonuçları ile karşılaştırıldı.
Sonuçlar: Uyku bozukluğu FM hastalarında (89 hasta, %61.8), kontrol grubuna (42,
%38.2) göre daha yüksekti, fark istatistiksel olarak anlamlıydı (p˂0.001). Hasta ve kontrol grubunda 5-HT2A, G102T ve COMT genotipleri benzerdi. FM ve kontrol grubunda uyku bozukluğu olanlarda her üç gende polimorfim oranları daha yüksek saptandı.
Tartışma: Bu çalışma, uyku bozukluğu ile serotonin taşıyıcı protein genlerinin 5- HT2A, G102T ve COMT gen polimorfizmleri ile ilişkili olabileceğini göstermiştir. Uyku kalitesi FM hastalarında iki yönden önemlidir, FM uyku bozukluğu için majör risk faktörüdür, diğer yandan uyku bozukluğu hastalık ciddiyetini etkileyebilir ve hastalığın diğer semptomlarını şiddetlendirebilir. Uyku bozukluğu ile gen polimorfizmi ilişkisi gelecekte yeni tedavi seçenekleri açısından öncülük edebilir.
Anahtar kelimeler: fibromiyalji, uyku bozukluğu, gen polimorfizmi
ABSTRACT
Aim: Fibromyalgia (FM) is syndrome characterized by widespread pain and
tenderness, and usually accompanied with somatic and physiologic symptoms. One of the major symptoms of the FM is impaired sleep quality, which is seen 95% of patients. Some studies suggested that some gene polymorphisms play etiologic role on the pathogenesis of FM. The aim of this study was to present whether there were any relationships between COMT and HT2 gene polymorphism and sleep quality in FM.
Material-Methods: Patients who were between the age 18-55, and women and diagnosed with FM enrolled to the study. Age-matched healthy volunteers included to the study as a control group. All patients’ and controls’ ages, body-mass indexes (BMI), demographic characteristics were recorded. Also in FM patients, tender points, in a valid and reliable Turkish version of Beck anxiety inventory (BAI) and FM Impact Questionnaire (FIQ) were evaluated. To evaluate sleep disturbance, in a valid and reliable Turkish version of Pittsburgh sleep quality index (PSQI) were applied to the FM patients and control group. Patients’ and controls’ gene polymorphisms analyzed and PSQI scores were compared with COMT and 5-HT2 gene polymorphism results.
Results: Sleep disturbance is higher in FM group (89 of the FM patients, 61.8%) compared to control group (42 of the control group, 38.2%), and the difference was significant (p˂0.001). The genotypes of 5-HT2, G102T, and COMT of patients and controls were similar. The FM patients and the control group with sleep disturbance have heterozygote gene polymorphism all of the three genes.
Conclusion: This study showed that sleep disturbance may have a relationship with 5HT-2, G102T of serotonin transporter gene and COMT gene polymorphisms. Sleep quality has a great importance in the FM in two ways, FM is the major risk for sleep disturbance, and on the other hand sleep disturbance affects the disease severity and may exacerbate the other symptoms of the disease. The relationship between gene polymorphism and sleep disturbance has been set forth may be guidance for new treatment options in the future.
Keywords: fibromiyalgia, sleep disturbance, gene polymorphism
GİRİŞ
Fibromiyalji sendromu (FM), somatik ve psikolojik semptomların da eşlik ettiği yaygın ağrı ve hassasiyetle karakterize bir sendromdur (1). Hastalık toplumda %1-2
oranında görülürken kadınlar hastalıktan 9 kat daha fazla etkilenir (2-4). FM’ye eşlik eden en önemli semptomlardan birisi uyku bozukluğudur, %95 vakada görülür (5).
Uyku problemi çeşitli formlarda (uykuya dalmada güçlük, uykuyu devam ettirememe, dinlenmeden uyanma) görülebilir (6). Uyku problemi ile ağrı iki taraflı etkileşim
halindedir, uyku problemlerinin gün içindeki ağrıyı tetiklediği gösterilmiştir (7,8).
Sonuç olarak uyku bozukluğu ağrıyı arttırmakta, ağrı fonksiyonel kapasitede
azalmaya neden olmakta ve depresyona sebep olabilmektedir (8). FM hastalarında uyku problemlerinin çözülmesiyle ağrının azaldığı da gösterilmiştir (9). Uyku
bozukluğunun ana semptomlardan biri oluşu ve diğer semptomlarla da yakın ilişkisi nedeniyle 2010 yılı tanı kriterleri arasına girmesine neden olmuştur (10).
FM etyolojisinde genetik, moleküler ve ailesel faktörler yer almaktadır (11,12). Bazı çalışmalara göre gen polimorfizmlerinin; özellikle de serotoninerjik, katekolaminerjik ve dopaminerjik gen polimorfizmlerinin etyopatogenezde rol alabileceğini
düşündürtmektedir (13-17). Cateol –O-metiltransferaz (COMT) enzimi katekolaminleri ve kateol içeren bazı ilaçları inaktive eden bir enzimdir, 22q11’de lokalizededir (18).
COMT enziminin değişik tek-nükleotid gen polimorfizmlerinin enzim aktivitesini değiştirdiği ve FM ile ilişkili olabileceği bildirilmiştir (19-21). COMT enziminin en iyi bilinen polimorfizmi rs4680’dir (15). Serotonin (5-HT), santral sinir sisteminde anahtar role sahip olup birçok fonksiyonu etkilemektedir (18). Serotoninin en önemli santral sinir sistemi fonksiyonlarından birisi de uyku siklusunu düzenlemektir (18). 5-HT reseptör alt tipleri serotonin aktivitesini etkilemektedir (22). 13q14-21’de haritalanan 5-HT2A subtipinin nöropsikiyatrik hastalıklarla ilişkisi ortaya konmuştur (23). FM hastalarında serebrospinal sıvılarında serotonin düzeylerinin azaldığı bilinmektedir (24). Bazı çalışmalar serotonin transport gen polimorfizmlerinin FM ile ilişkili
olabileceğini öne sürse de ilişki henüz net değildir (14,25,26).
FM hastalarında tedavi ağrı odaklı yapılsa da hastalar halsizlik, uyku bozukluğu, zayıf konsantrasyon, katılık, dağınık düşünce, hassasiyet, depresyon, hafıza zayıflığı gibi semptomlardan daha çok rahatsız olabilmektedir. Tedavi rejimleri bu semptomlara da yönelik olmalıdır. Uyku bozukluğu, hem en sık karşılaşılan problemlerden olması nedeniyle, hem de diğer semptomları da etkileyebilmesinden dolayı öncelikle ele alınmalıdır. Bu çalışma ile FM’de uyku kalitesi ile COMT ve 5-HT2A gen
polimorfizmlerinin ilişkisinin olup olmadığının değerlendirilmesi amaçlanmıştır.
GEREÇ VE YÖNTEM
Çalışma, prospektif, kontrollü klinik çalışma olarak planlanmıştır. Etik kurul onayı Namık Kemal Üniversitesi etik kurulundan alınmıştır.
Hasta seçimi:
18-55 yaş arası, FM tanısı almış kadın hastalar çalışmaya dahil edildi. FM tanısı 2010 American Collage of Rheumatology (ACR) tanı kriterlerine göre kondu (10).
Nöropsikiyatrik hastalık tanısı olanlar, insomnia, uyku apnesi, narkolepsi gibi uyku bozukluğu blunanlar, inflamatuar romatizmal hastalığı bulunanlar, diabet,
hipo/hipertiroidi gibi endokrin hastalığı bulunanlar, kardiyopulmoner hastalığı bulunan hastalar ile antidepresan veya uyku ilacı kullanan hastalar çalışmadan dışlandı.
Yaş uyumlu sağlıklı gönüllüler kontrol grubu olarak çalışmaya alındı. Kontrol grubu hastaları, fizik tedavi polikliniğine bölgesel ağrı yakınmasıyla başvuran hastalar arasından seçildi. Aynı dışlama kriterleri kontrol grubu hastaları için de uygulandı.
Tüm hastaların ve kontrol grubunun medikal ve psikiyatrk değerlendirilmeleri aynı klinisyen tarafından yapıldı. Hastaların vücut kitle indeksleri (VKİ), demografik verileri kaydedildi. FM hastalarının ayrıca hassas nokta, Türkçe geçerlilik ve güvenirliliği yapılmış Beck anksiyete ölçeği (BAÖ) ve Fibromiyalji Etki anketi (FEA)
değerlendirmeleri yapıldı (27,28).
Uyku bozukluğunu değerlendirmek için Pittsburgh uyku kalite indeksinin (PUKİ) Türkçe versiyonu hasta ve kontrol grubuna uygulandı (22). PUKi sonuçları, COMT ve 5-HT2 gen polimorfizm sonuçları ile karşılaştırıldı.
Moleküler analiz:
Periferal Kan Dokularından DNA'nın İzolasyonu:
Çalışmaya katılan bireylerden 1/100 hacimde 0.5mmol / L sodyum EDTA içeren tüplere 2 ml kan alındı. Lökosit hücrelerinden genomic DNA ekstraksiyonu standart Fenol-kloroform yöntemi kullanılarak gerçekleştirildi(1). Bu amaçla tam kan alınan örneğin hacmi Solüsyon 1 kullanılarak 10 ml’ ye tamamlandı. Buna ilaveten 120 µltnonidetP40 hücrelerinlizis’i için ortama eklendi. Tüp birkaç defa tersyüz çevirilerek iyi bir şekilde karıştırıldı. Nükleer peleti çöktürmek için 2000 rpm’de 10 dakika çevirildi. Pelet oynatılmaksızın süpernatant döküldü. Pelet 800 µlt solüsyon 2 ile hafif bir biçimde süspanse edildi. 1.5 ml’lik Eppendorf tüpüne aktarıldı. 400 µltdistile fenol ilave edilerek 12000 rpm’ de 1 dakika santrifüj edildi. Üst faz temiz bir Eppendorf tüpüne aktarıldı ve üzerine 400 µlt eş hacimde fenol / kloroform / izoamilalkol ( 25:24:1) eklenerek iyice karıştırıldı. 12000 rpm’de 1 dakika santrifüj edildi. Üst faz temiz bir Eppendorf tüpüne aktarıldı. Üzerine 700 µlt kloroform / izoamilalkol ( 24:1 ) eklenerek tersyüz edilip karıştırıldı. Tekrar 12000 rpm’desantrifüj edildikten sonra üst faz temiz bir eppendorf tüpüne aktarıldı. İki hacim % 100 etanol ilave edilerek tüp tersyüz edildi. ( Bu aşamada DNA görünür hale gelmektedir ). Elde edilen DNA Pasteur pipetinin kapatılmış bir yüzeyi ile 1 ml % 70 etanol içeren bir Eppendorf tüpüne transfer edildi. İyice yıkanması sağlandı. Tüpler 15000 rpm’de 5 dakika santrifüj edilerek DNA’nın çökmesi sağlandı. Etanol ortamdan uzaklaştırıldı. Örnekler 37 oC’lık etüvde birkaç dakika bekletilerek kurutuldu. Ardından DNA TE tamponda çözüldü (30).
5-HT2A Reseptör Gen Polimorfizmleri (rs6313 and 6311) ve COMTGen Polymorfizmlerinin (rs4680) PZR-RFLP ile İncelenmesi:
Polimeraz Zincir Reaksiyonu (PZR):
PZR yöntemi ile5-HT2Areseptör geni promoter bölgesinde yeralan-1438G/A (rs6311)polimorfizmini içeren gen bölgesi içeren ilgili gen bölgesinin amplifikasyonu amaçlandı. Bunun için PZR reaksiyon karışımları hazırlandı.
25µl'lik bir reaksiyon karışımı
• 0,1-1 µg kalıp DNA,
• 10XPZR tamponu,
• 10 pmol (ileri) ve (geri) primerlerini
• 200 µM dNTP karışımı,
• 1,5 mM MgCl2,
• 1 ünite Taqpolimeraz enzimi,
• dH2O içermektedir.
Bu işlem 0.2 ml'lik Eppendorf tüplerinde ve buz üzerinde gerçekleştirildi. Tüpler ısı döngü cihazına yerleştirilerek belirlenen program uygulandı.
5-HT2 A reseptör -1438G/A (rs6311) polimorfizmini için PZR döngü programı olarak:
95oC’de 2 dakika ön denaturasyon
95oC’de 30 saniye...(denatürasyon)
60oC’de 30 saniye...(eşleşme) 35 döngü 72 oC’de 30 saniye...(sentez)
72oC’ de 10dakika final uzaması olarak uygulandı (15,30-32).
5-HT2 A reseptör geni102T/C (rs6313)polimorfizmini içeren gen bölgesinin amplifikasyonu da yukarıda belirtildiği üzere gerçekleştirildi ancak ön denatürasyon koşulları 95 oC’de3 dakika olarak gerçekleştirildi.
Yine, COMT rs4680 polimorfizmini içeren gen bölgesi aynı şekilde fakat ön denatürasyon koşulları 94oC’de 3 dakika uygulanarak amplifiye edildi.
Agaroz Jel Elektroforezi:
Yapılan bu çalışmada PZR ile amplifiye edilen ürünlerin doğruluğunun ve kalitesinin belirlenmesi için agaroz jel elektroforezi uygulandı. Elde edilen büyüklükteki ürünleri tanımlayabilmek için %2’ lik jel kullanıldı. Kullanılan elektroforez düzeneğine uygun 40 ml’lik hacim; toz halindeki agarozun0.5 X TBE tamponunda kaynatılarak çözülmesi ile oluşturuldu. Ardından kaynamış çözelti 55 - 60 oC’ye soğutularak 0.25 µg / ml EtBr ilave edildi. Kuyuları oluşturacak olan tarak, tabağına yerleştirildikten sonra, hazırlanan jel, hava kabarcığı kalmayacak şekilde buraya döküldü. Jelin polimerizasyonu sonrası tarak dikkatlice çıkarılarak jel platformu 0.5 X TBE tamponu ile dolu olan elektroforez tankına yerleştirildi. Bu tampondan jelin, üzerini 1 - 2 mm geçecek kadar eklendi. Oluşan kuyulara örnekler ve belirteç DNA, tanka 6X yükleme boyası ile 5:1 oranında karıştırılarak yüklendi. Güç kaynağı açılarak 5 - 10 V / cm olacak şekilde 80 V’ a ayarlandı. Yaklaşık bir saat sonra güç kaynağı kapatıldı. Jel UV ışını altında incelendikten sonra fotoğrafı çekildi.
PZR Ürünlerinin RFLP Yöntemi ile Kesimi:
5-HT2A Reseptör -1436 G/A polimorfizm tayini:
Özgül primerler kullanılarak çoğaltılan 448bç’lik 5-HT2A reseptörpromoter gen bölgesibir kesim yüzeyi içermektedir. Bu bölgede meydana gelen nokta mutasyonu sonucu bu kesim yüzeyi kaybolmaktadır. Yabanıl tip 5-HT2A reseptör - 1438GallelindeMspI enzimi bu bölgeyi 224’erbç’ lik iki bölgeye ayırırken;
polimorfikallel-1438A (rs6311) kesim yüzeyi içermediğinden 448’lik PZR ürününe sahiptir (31).
Yapılan bu çalışmada RFLP yöntemi ile PZR sonrası enzim kesimi yapılmıştır. Her bir kesim için reaksiyon tüpüne;
• 10 µl PZR ürünü
• 3 µl 10 X tampon
• 10uniteMsp I enzimi
konularak karışım dH2O ile 30 µl’ye tamamlandı. Örnekler 37 oC’de ısı-döngü cihazında kesim için gece boyu bekletildi. 16 saat sonra örnekler - 20oC' ye derin dondurucuya konuldu. RFLP kesim ürünlerinin belirlenmesi için örnekler %3’lük agaroz jel elektroforezinde yürütüldü ve Jel UV ışını altında incelendi.-1438GG genotipinde 224bç’lik bir bant gözlenirken,-1438GAgenotipi448, 224 bç’lik iki bant ve -1438AA genotipinde ise 448 bç’lik bir bant gözlendi (31).
5-HT2A Reseptör 102T/C (rs6313) polimorfizm tayini:
Özgül primerler kullanılarak çoğaltılan 342bç’lik 5-HT2A reseptör 102T/C (rs6313) polimorfizmini içeren gen bölgesi herhangi bir MspI kesim yüzeyi içermemektedir. Bu bölgede meydana gelen nokta mutasyonu sonucu bu kesim yüzeyi oluşmaktadır.
Yabanıl tip 5-HT2A reseptör 102T allelindekesim yüzeyi bulunmadığı için 342bç’
likPZR ürününe sahip iken; polimorfik allel 102C (rs6313) bir kesim yüzeyi içerdiğinden 215 ve 126 bç’likkesim ürünlerine sahiptir (32).
Yapılan bu çalışmada RFLP yöntemi ile PZR sonrası enzim kesimi yapılmıştır. Her bir kesim için reaksiyon tüpüne;
• 10 µl PZR ürünü
• 3 µl 10 X tampon
• 10 uniteMsp I enzimi
konularak karışım dH2O ile 30 µl’ye tamamlandı. Örnekler 37oC’de ısı-döngü cihazında kesim için gece boyu bekletildi. 16 saat sonra örnekler - 20oC' ye derin dondurucuya konuldu. RFLP kesim ürünlerinin belirlenmesi için örnekler %3’lük agaroz jel elektroforezinde yürütüldü ve Jel UV ışını altında incelendi. 102TT genotipinde 342bç’lik bir bant gözlenirken, 102T genotipinde342, 215 ve 126bç’lik üç bant ve 102CC genotipinde ise 215 ve 126 bç’likiki bant gözlendi (32).
COMT rs4680 polimorfizm tayini:
Özgül primerler kullanılarak çoğaltılan 185bç’lik COMT rs4680 polimorfizmini içeren gen bölgesi iki adet HSp92IIkesim yüzeyi içermektedir. Bu bölgede meydana gelen nokta mutasyonu sonucu 3 adet kesim yüzeyi oluşmaktadır. Yabanıl tip COMT
sahip iken; polimorfikallelrs4680 A üçkesim yüzeyi içerdiğinden 96, 36, 35 ve 18 bç’likkesim ürünlerine sahiptir (32).
Yapılan bu çalışmada RFLP yöntemi ile PZR sonrası enzim kesimi yapılmıştır. Her bir kesim için reaksiyon tüpüne;
• 10 µl PZR ürünü
• 3 µl 10 X tampon
• 5uniteHsp92II enzimi
konularak karışım dH2O ile 30 µl’ye tamamlandı. Örnekler 37 oC’de ısı-döngü cihazında kesim için gece boyu bekletildi. 16 saat sonra örnekler - 20oC' ye derin dondurucuya konuldu. RFLP kesim ürünlerinin belirlenmesi için örnekler %4’lük agaroz jel elektroforezinde yürütüldü ve Jel UV ışını altında incelendi. COMT rs4680 GGgenotipinde114, 36 ve35 bç’ liküç bant gözlenirken,COMTrs4680 AGgenotipinde114, 96, 36, 35 ve18bç’ lik beş bant ve rs4680 AAgenotipindeise 96, 36, 35 ve 18bç’ likdört bant gözlendi (32).
İstatistiksel analiz:
İstatistiksel analizler SPSS Windows 17 programı kullanılarak yapılmıştır. Kategorikal data için ki-kare test kullanılmış, sonuçlar sayı veya yüzde olarak verilmiştir. Verilerin normal dağılıp dağılmadığı Kolmogorov-Smirnov testi ile değerlendirilmiştir. Normal dağılan veriler t-test ile, normal dağılmayan veriler Mann-Whitney U test ile değerlendirilmiştir. Devamlı değişkenler için sonuçlar ortalama±standart sapma olarak verilmiştir. P değeri 0.05’den küçük olan değerler istatsitiksel olarak anlamlı kabul edilmiştir.
Sonuçlar:
Toplamda 105 FM hastası ile 110 kontrol vaka çalışmaya dahil edildi. İki grup arasında yaş ve beden kitle indeksi (BKİ) açısından anlamlı fark yoktu. Hasta ve kontrol grubunun demografik verileri Tablo 1’de özetlenmiştir.
FM grubunda (89 hasta, %61.8) uyku bozukluğu oranı, kontrol grubuna (42 kontrol,
%38.2) göre daha yüksek saptandı, fark istatistiksel olarak anlamlı idi (p˂0.001).
5-HT2, G102T, ve COMT genotipleri hasta ve kontrol grubunda benzerdi. Uyku bozukluğu bulunan FM ve kontrol grubu vakalarında her üç gende de heterozigot gen polimorfizmi saptandı. Sonuçlar Tablo 2 ve 3’de özetlenmiştir.
BAÖ ve FEA arasında, PUKİ ile semptom şiddet skalası arasında pozitif korelasyon saptandı (sırasıyla; p=˂0.001, r=0.669; p=˂0.001, r=0.708; p=0.013, r=0.241). FEA ile PUKİ ve yaygın ağrı indeksi arasında pozitif korelasyon saptandı (sırasıyla;
p=˂0.001, r=0.607; p=0.016, r=0.235). PUKİ ile semptom şiddet skalası arasında pozitif korelasyon saptandı (p=0.028, r=0.215).
Tartışma:
Bu çalışma iki bölümden oluşmaktaydı, birinci kısımda FM hastaları ile yaş uyumlu kontrol grubu vakalarında 5-HT2A ve COMT gen polimorfizmi sıklığı incelendi.
İncelenen bu iki genin 3 allelinin polimorfizmlerinde bir fark saptanamadı. İkinci kısımda gen polimorfizmi ile uyku bozukluğu arasındaki olası ilişki incelendi. Uyku bozukluğu saptanan FM ve kontrol grubunda 3 allelde gen polimorfizmi daha yüksek olarak tespit edildi.
FM hastalığının etyopatogenezindeki ve patofizyolojisindeki kompleksite, hastalığı romatizmal hastalıklar arasında dikkat çekici kılmaktadır. FM’deki etyololojik mekanizmaları ortaya koymak için birçok çalışma yapılmıştır. Son çalışmalar, FM’deki gen polimorfizmi üzerine yoğunlaşmaktadır. FM hastalığında sempatik sistem disfonksiyonu ortaya konduğundan COMT geni patofizyolojiyi açıklamak için hedef haline gelmiştir. COMT valin158metionin (Val158Met) gen polimorfizminde COMT poroteininde 158. Kodonuna metionin yerine valin yerleşmiştir (33). Bu değişiklik sonucu enzim aktivitesi yaklaşık 3-4 kat azalmaktadır (33). COMT gen polimorfizmi ile ilgili yapılan çalışmalarda çelişkili sonuçlar elde edilmiştir. Gürsoy ve arkadaşları 61 FM hastası ile yaptıkları çalışmada bu polimorfizmi saptamışlardır (15). Garcia-Fructuoso ve arkadaşları, 110 FM hastası ile yaptıkları çalışma ile bu gen polimorfizmi olan kişilerde hastalığın daha ciddi seyrettiğini göstermişlerdir (34).
Barbosa ve arkadaşları 112 Brezilyalı FM hastası ile yaptıkları çalışmada, SNPs rs4680 and rs4818 gen polimorfizmlerini incelemişler ve FM hastalarında mutant CC genotipini %73.21 oranında saptarken, kontrol grubunda bu oranı % 39.09 olarak bulmuşlardır (35). Vargas-AlarcÓn ve arkadaşları, 78 İspanyol FM hastasında ağrı ile SNPlerin (rs6269, rs4818, and rs4680) ilişkisini ortaya koyarken aynı ilişki Meksikalı hastalarda saptanamamıştır (36). Tam tersine Tander ve arkadaşları 80 FM ve 91 sağlıklı kontrol ile yaptıkları çalışmada COMT gen (rs4680) polimorfizmi açısından bir fark olmadığını söylemişlerdir (18). Hagen K ve arkadaşları, 3017 rastgele hasta üzerinde yaptıkları çalışmada, kas iskelet sistemi ile COMT gen polimorfizmi ilişkisini incelemişler ve bir ilişki saptayamamışlardır (37). Biz de çalışmamızda, 105 FM ve 110 sağlıklı kişide COMT gen polymorfizmi (rs4680) açısından bir fark saptayamadık.
Serotoninin santral sinir siteminde önemli görevleri mevcuttur, uyku siklusunu, ağrı yanıtını, duygu-durum değişimlerini, vazokonstrüksiyonu düzenler (22). Serotonin etkisini 5-HT reseptörleri aracılığıyla gösterir (16), bu reseptörlerdeki gen
polimorfizmler serotonin fonksiyonunu bozabilir. FM etyolojisinde serotonin disfonksiyonu suçlanmaktadır (14,15). Otörler, FM ile serotonin reseptör geni arasında bir ilişki olabileceğini öngörmektedir (14,25,26). Ayrıca, serotonin gen reseptör polimorfizmi FM’de semptom ciddiyetini de etkileyebilmektedir (14). Gürsoy ve arkadaşları yaptıkları çalışmada, 58 FM tanılı ve 58 sağlıklı kontrol grubunda 5- HT2A gen polimorfizmini benzer oranda bulmuşlar, ancak T/T genotipine sahip olan bireylerde psikiyatrik semptomların daha yüksek oranda görüldüğünü saptamışlardır (39). Matsuda ve arkadaşları ise 51 hasta ve 51 kontrol ile yaptıkları çalışmada bu gen polimorfizmi açısından iki grup arasında bir fark bulamamışlardır (13). Benzer şekilde, Tander ve arkadaşları da FM ve sağlıklı kontrol arasında bir fark olmadığını göstermişlerdir (18). Bunların aksine, Mergener ve arkadaşları FM hastalarında sağlıklı kontrollere kıyasla T102C varyantının daha yüksek olduğunu bulmuşlardır (40). Bondy ve arkadaşları, 168 FM hastasında T/C ve C/C genotiplerinin 115 sağlıklı kontrole göre yüksek olduğunu, ayrıca T/T genotipine sahip kişilerin daha yoğun ağrı
arasında 5-HT2A gen polimorfizmi açısından bir fark olmadığını saptadık. Tüm bu uyumsuz verilerin sebebi etnik kökenle ilişkili olabilir.
Uyku bozukluğu FM hastalığında anahtar role sahiptir, ayrıca diğer semptomların ciddiyetini de etkilemektedir. Uyku bozukluğu ile FM birbiri içine geçmiş durumdadır.
Uyku bozukluğunu tedavi etmek, hastalığın diğer semptomlarında da düzelme sağlayabilmektedir. O nedenle uyku bozukluğu bu hastalıkta önemli hedeflerden birisidir. Uyku ve bozuklukları, çeşitli genler, gen etkileşimleri ve çevresel faktörler ile düzenlenmektedir (41,42). Monoamin nörotransmitterleri üreten genler, normal ve patolojik durumlarda uyku-uyanıklık regülasyonunu etkilemektedir (41,42). COMT enzimi, prefrontal kortekste kortikal katekolaminleri yıkmaktadır ve sağlıklı kişilerde Val158Met polimorfizminin uyku fizyolojisi ile ilişkisi olabileceği öngörülmektedir(33).
Bir çalışmada, Val/Val alleli taşıyanların, uyanıklılık, REM ve NREM uykuda daha düşük EEG sinyali ürettiği gösterilmiştir (43). Bir diğer çalışmada, Met/Met
taşıyıcılarının Val/Met ve Met/Met taşıyıcılarına göre yavaş-dalga EEG’sinde daha büyük enerji azalması gösterdikleri saptanmıştır (33). Yüksek saptanan yavaş dalga EEG’si NREM uyku için tipiktir ve uyku denge markerı olarak kabul edilmektedir (44,45). Biz de bu çalışma ile gen polimorfizmleri ile uyku bozukluğu arasında bir ilişki olup olmadığını araştırmayı amaçladık ve her iki grupta da uyku bozukluğu olanlarda Val/Met gen polimorfizminin daha yüksek olduğunu gösterdik. Hayvan modelleri ve insan çalışmaları serotoninin uyanıklılık ile ilişkisini doğrulamaktadır (46). Serotonin Pons merkezinde 5-HT2 A reseptörleri aracılığıyla yavaş dalga uykuyu azaltmaktadır (47). Bu çalışmada hasta ve sağlıklı grupta uyku bozukluğu olanlarda serotoninin 5- HT2A’da G/A genotipinin ve G102T allelinde C/T genotipinin daha yüksek olduğunu göstermiştir. Bu veriler, primer hastalıktan bağımsız olarak uyku bozukluğunda bu gen polimorfizmlerinin etkisi olabileceğini desteklemektedir.
Sonuç olarak, bu çalışma uyku bozukluğu ile 5-HT2, serotonin taşıyıcı gen G102T ve COMT gen polimorfizmleri ile ilişki olabileceğini ortaya koymuştur. FM hastalarında uyku kalitesinin iki yönde önemli etkisi mevcuttur; FM hastalığı uyku bozukluğu için majör risk faktörüdür, diğer yandan uyku bozukluğu hastalık ciddiyetini arttırmakta ve diğer semptomları şiddetlendirmektedir. Gen polimorfizmi ve uyku bozukluğu
ilişkisinin ortaya konması ilerideki tedavi seçenekleri açısından önem teşkil edebilir.
KAYNAKLAR
1. Goldenberg Dl. Fibromyalgia syndrome a decade later. What have we learned?
Arch Intern Med 1999;159:777–785
2. Nugraha B, Karst M, Engeli S, Gutenbrunner C. Brain-derived neurotrophic factor and exercise in fibromyalgia syndrome patients: a mini review. Rhematol Int 2012;32:2593-2599.
3. White KP, Speechley M, Harth M, Ostbye T. The London fibromyalgia
epidemiology study: comparind demographic and clinical characteristics in 100 random community cases of fibromyalgia versus controls. J Rheumatol
1999;26:1577-85.
4. Wolfe F, Ross K,Anderson J, Russell IJ, Hebert L. The prevalence and characteristics of fibromyalgia in the general population. Arthritis Rheum 1995;38:19-28.
5. Mease PJ, Arnold LM, Crofford LJ, Williams DA, Russell IJ, Humphrey L, Abetz L, Martin SA. Identifying the clinical domains of fibromyalgia: contributions from clinician and patient Delphi exercises. Arthritis Rheum. 2008 Jul 15;59(7):952- 60. doi: 10.1002/art.23826.
6. Moldofsky H. The significance of dysfunctions of the sleeping/waking brain to the pathogenesis and treatment of fibromyalgia syndrome. Rheum Dis Clin North Am 2009;35:359-72.
7. Affleck G, Urrows S, Tennen H, Higgins P, Abeles M. Sequential Daily relations of sleep, pain intensity, and attention to pain among women with fibromyalgia.
Pain 1999;68:363-8.
8. Bigatti SM, Hernandez AM, Cronan TA, Rand KL.slepp disturbances in
fibromyalgia syndrome: relationship to pain and depression. Arthritis Rheum 2008;59:961-7.
9. Roth T, Lankford DA, Bhadra P, Whalen E, Resnick EM.Effect of pregabalin on sleep in patients with fibromyalgia and sleep maintenance disturbance: a randomized, placebo-controlled, 2-way crossover polysomnography study.
Arthritis Care Res (Hoboken). 2012;64(4):597-606. doi: 10.1002/acr.21595.
10. Wolfe F, clauw DJ, Fitzcharles Ma, goldenberg Dl, Häuser W, Katz RS, Mease P, Russell aS, Russell IJ, Win eld JB. Fibromyalgia criteria and severity scales for clinical and epide- miological studies: a modi cation of the acR Preliminary Diag- nostic criteria for Fibromyalgia. J Rheumatol 2011;38:1113–1122. doi:
10.3899/jrheum.100594
11. Buskila D, Sarzi-Puttini P. Biology and therapy of fibromyalgia. Genetic aspects of fibromyalgia syndrome. Arthritis res Ther 2006;8(5):218-222.
12. Yunus MB, Khan MA, Karolyn K. Genetic linkage analysis of multicase families with fibromyalgia syndrome. J Rheumatol 1999;26:408-412.
13. Matsuda JB, Barbosa FR, Morel LJ, França Sde C, Zingaretti SM, da Silva LM, Pereira AM, Marins M, Fachin AL. Serotonin receptor (5-HT 2A) and catechol-O-methyltransferase (COMT) gene polymorphisms: triggers of fibromyalgia? Rev Bras Reumatol 2010;50(2):141-9.
14. Gürsoy S, Erdal E, Herken H, Madenci E, Alasehirli B. Assocition of T102C polymorphism of the 5HT2A receptor gene with psychiatric status in
fibromyalgia syndrome. Rheumatol Int 2001;21(2):58-61.
15. Gürsoy S, Erdal E, Herken H, Madenci E, Alasehirli B, Erdal N. Significance of catechol-O-methyltransferase gene polymorphism in fibromyalgia syndrome.
Rheumatol Int 2003;23(3):104-107.
16. Buskila D, Cohen H, Neumann L, Ebstein RP. An associatin between
fibromyalgia and the dopamine D4 receptor exon III repeat polymorphism and relationship to novelty seeking personality traits. Mol Psychiatry
2004;9(8):730-731.
17. Su SY, Chen JJ, Lai CC, Chen CM, Tsai FJ. The association between fibromyalgia and polymorphism of monoamine oxidase A and interleukin-4.
Clin Rheumatol 2007;26(1): 12-16.
18. Tander B, Gunes S, Boke O, Alayli G, Kara N, Bagci H, Canturk F.
Polymorphisms of the serotonin-2A receptor and catechol-O-
methyltransferase genes: a study on fibromyalgia susceptibility. Rheumatol Int.
2008 May;28(7):685-91. doi: 10.1007/s00296-008-0525-8.
19. Martínez-Jauand M, Sitges C, Rodríguez V, Picornell A, Ramon M, Buskila D, Montoya P. Pain sensitivity in fibromyalgia is associated with catechol-O- methyltransferase (COMT) gene Eur J Pain. 2013;17(1):16-27. doi:
10.1002/j.1532-2149.2012.00153.x.
20. Park DJ, Kim SH, Nah SS, Lee JH, Kim SK, Lee YA, Hong SJ, Kim HS, Lee HS, Kim HA, Joung CI, Kim SH, Lee SS. Association between catechol-O- methyl transferase gene polymorphisms and fibromyalgia in a Korean population: A case-control study.Eur J Pain. 2016;20(7):1131-9. doi:
10.1002/ejp.837.
21. Inanir A, Karakus N, Ates O, Sezer S, Bozkurt N, Inanir S, Yigit S. Clinical symptoms in fibromyalgia are associated to catechol-O-methyltransferase (COMT) gene Val158Met polymorphism. Xenobiotica. 2014;44(10):952-6. doi:
10.3109/00498254.2014.913083.
22. Graeff FG. Serotoninergic systems. Psychitr Clin North Am 1997;20:723-739.
23. Fuentes JA, Lauzurica N, Hurtado A, escarti A, Barrios V, Morande G, Soriano J, Jauregui I, Gonzalez-Valdemoro MI, Garcia-Camba E. Analysis of the -1438 G/A polymorphism of the 5-HT2A serotonin receptor gene in bulimia nervosa patients with or without a history of anorexia nervosa. Psychiatr Genet
2004;14(2):107-109.
24. Lenzinger E, Neumeister A, Praschak-Reider N, Fuchs K, Gerhard E, Willeit
M, Sieghart W, Kasper SF, Hornik K, Aschauer HN. Behavioral effects of tryptophan depletation in seasonal affective disorder associated with the serotonin transporter gene. Psychiatry Res 1999;85:241-246.
25. Bondy B, Spaeth M, Offenbaecher M, Glatzeder K, Stratz T, Schwarz M, de Jonge S, Krüger M, Engel RR, Farber L, Pongratz DE, Ackenheil M. The T102C polymorphism of the 5-HT2A,receptorgen in fibromyalgia. Neurobiol Dis 1999;6:433-439.
26. Offenbaecher M, Bondy B, de Jonge S, Glatzeder K, Krüger M, Schoeps P, Ackenheil M. Possible association of fibromyalgia with a polymorphism in the serotonin transporter gene regulation region. Arthritis Rheum
1999;42(11):2482-2488.
27. Eren I, Sahin M, Tunc SE, Cure E, Civi II: Psychiatric symptoms and quality of life in patients with Behçet’s disease. Neurol Psychiatr Brain Res 2006;13:169- 74.
28. Sarmer S, Ergin S, Yavuzer G. The validity and reliability of the Turkish version of the Fibromyalgia Impact Questionnaire. Rheumatol Int 2000;20:9–
12.
29. Ağargün MY, Kara H, Anlar Ö. Pittsburgh uyku kalitesi indeksinin geçerliği ve güvenirliği. Türk Psikiyatri Dergisi 1996;7(2):107-115.
30. John S.W.M., Weitzner G., Rozen R., Scriver C.R.: A Rapid Procedure for extracting genomic DNA from leukocytes. Nucleic Acid Research, volume 19:2 408, 1988.
31. Arranz MJ, Munro J, Owen MJ, Spurlock G, Sham PC, Zhao J, Kirov G, Collier DA, Kerwin RW.: Evidence of Association between Polymorphism in the
Promoter and Coding Region of the 5-HT2A Receptor Gene and Response to Clozapine. Mol Psychiatry 3:61-66, 1998.
32. Tot S, Erdal E, Yazici K, Yazici AE, Metin O.: T102C and -1438 G/A polymorphisms of the receptor gene Turkish Patients with Obsessive- Compulsive Disorder. EurPhychiatry 18:249-254, 2003.
33. Goel N, Banks S, Lin L, Mignot E, Dinges DF. Catechol-O-Methyltransferase Val158Metpolymorphism associates with individual differences in sleep physiologic responses to chronic sleep loss. PLoS One. 2011;6(12):e29283.
doi: 10.1371/journal.pone.0029283.
34. Garcia-Fructoso FJ, Lao-Viladoniga JL, Beyer K, Santos C. Relationship between catechol-O-metyltransferase genotypes and fibromyalgia’s severity.
Rheumatology Clinic 2006;2:168-172.
35. Barbosa FR, Matsuda JB, Mazucato M, de Castro França S, Zingaretti SM, da Silva LM, Martinez-Rossi NM, Júnior MF, Marins M, Fachin AL. Influence of catechol-O-methyltransferase (COMT) gene polymorphisms in pain sensibility
36. Vargas-Alarcón G, Fragoso JM, Cruz-Robles D, Vargas A, Vargas A, Lao- Villadóniga JI, García-Fructuoso F, Ramos-Kuri M, Hernández F, Springall R, Bojalil R, Vallejo M, Martínez-Lavín M. Catechol-O-methyltransferase gene haplotypes in Mexican and Spanish patients with fibromyalgia. Arthritis Res Ther. 2007;9(5):R110.
37. Hagen K, Pettersen E, Stovner LJ, Skorpen F, Zwart JA. No association between chronic musculoskeletal complaints and Val158Met polymorphism in the Catechol-O-methyltransferase gene. The HUNT study. BMC
Musculoskelet Disord. 2006 May 4;7:40.
38. Cohen H, Buskila D, Neumann L, Enstein RP. Confirmation of an association between fibromyalgia and serotonin transporter promoter region (5-HTTLPR) polymorphism, and relationship to anxiety related personality traits. Arthritis Rheum 46(3);845-847.
39. Gürsoy S, Erdal E, Herken H, Madenci E, Alaşehirli B. Association of T102C polymorphism of the 5-HT2A receptor gene with psychiatric status in
fibromyalgia syndrome. Rheumatol Int. 2001 Oct;21(2):58-61.
40. Mergener M, Becker RM, dos Santos AF, dos Santos GA, de Andrade FM.
Influence of the interaction between environmental quality and T102C SNP in the HTR2A gene on fibromyalgia susceptibility. Rev Bras Reumatol.
2011;51(6):594-602.
41. Dauvilliers Y, Maret S, Tafti M. Genetics of normal and pathological sleep in humans. Sleep Med Rev 2005;9:91-100.
42. Landolt HP. Genotype-dependent differences in sleep, vigilance and response to stimulants. Curr Pharm Des 2008;14:3396-3407.
43. Klimesch W. EEG alpha and theta oscillations reflect cognitive and memory performance: a review and analyses. Brain res Rev 1999;29:169-195.
44. Borbely AA, Achermann P. Sleep homeostasis and models of sleep regulation.
In: Kryger MH, Roth T, Dement WC, eds. Principles and practice of sleep medicine. 4th ed. Philadelphia, PA: Elservier Saunders,2005:405-417.
45. Borbely AA, Baumann F, Brandeis D, Strauch I, Lecmann D. Sleep deprivation: effect on sleep stages and EEG power density in man.
Electroencephalogr Clin Neurophysiol 1981;51:483-93.
46. Monti JM, Jantos H. The roles of dopamine and serotonin, and their receptors, in regulating sleep and waking. Prog Brain res 2008;172:625-646.
47. Viola AU, Brandenberger G, Toussaint M, Bouhours P, Paul Macher J,
Luthringer R. Ritanserin, a serotonin-2 receptor antagonist, improve ultradian sleep rhythmicity in young poor sleepers. Clin Neurophysiol 2002;113:429- 434.
Tablo 1. Fibromiyalji ve kontrol grubunun demografik verileri Hasta (n=105) Kontrol (n=110) p
Yaş 44.43±9.8 45.67±11.5 0.957
BKİ (kg/cm2) 26.38±4,25 25.94±3.74 0.415
BAÖ 31,07±13,0 ˂0.001
PUKİ 9.56±3.83 ˂0.001
FEA 60.16±14.06
TN 12.51±4.43
YAİ 12.92±3.39
SŞS 8.48±1.81
Hastalık süresi (ay) 61.86±44.17
BKİ: beden kitle indeksi; BAÖ: Beck anksiyete ölçeği; PUKİ: Pittsburgh uyku kalite indeksi; FEA: Fibromiyalji etki anketi; TN: tetik nokta; YAİ: yaygın ağrı indeksi; SŞS:
semptom şiddet skalası
Tablo 2. Fibromiyalji hastaları ve kontrol grubunda COMT, G102T ve 5HT2A gen allellerinin dağılımı
FM (n=105) Kontrol (n=110) p
Hasta sayısı (%) Kontrol sayısı (%) COMT
GG 29(27.6%) 28(25.5%) 0.281
GA 52(49.5%) 65(59.1%) 0.279
AA 24(22.9%) 17(15.5%) 0.568
G102T
CC 27(25.7%) 26(23.6%) 0.916
CT 46(43.8%) 51(46.4%) 0.916
TT 32(30.5%) 33(30%) 0.874
5HT2A
GG 23(21.9%) 24(21.8%) 0.995
GA 54(51.4%) 56(50.9%) 0.995
AA 28(26.7%) 30(27.3%) 0.942
FM: Fibromiyalji
Tablo 3. Uyku bozukluğu olan FM ve kontrol grubunda COMT, G102T ve 5HT2A gen allellerinin dağılımı
FM (n=89) Kontrol (n=42) p Hasta sayısı (%) Kontrol sayısı (%)
COMT
GG 26(29.2%) 11(26.2%) 0.627
GA 41(46.1%) 23(54.8%) 0.625
AA 22(24.7%) 8(19.0%) 0.843
G102T
CC 23(25.8%) 7(16.7%) 0.504
CT 39(43.8%) 21(50.0%) 0.490
TT 27(30.3%) 14(33.3%) 0.376
5HT2A
GG 20(22.5%) 8(19.0%) 0.904
GA 45(50.6%) 22(52.4%) 0.903
AA 24(27.0%) 12(28.6%) 0.701
FM: Fibromyalji
EKLER:
Ek 1. Fibromiyalji Etki Anketi
Fibromiyalji Etki Anketi (FIQ)
Soru 1. Geçtiğimiz hafta içinde aşağıdaki aktiviteleri ne sıklıkta gerçekleştirebildiğinizi belirtin. Bu aktivitelerden normal zamanlarda da yapmadıklarınız için yapmam şıkkını işaretleyin.
Her zaman Sık sık Nadiren Hiç Yapmam
0 1 2 3
Alışveriş yapmak Yemek yapmak
Elde bulaşık yıkamak Makineyle halı
süpürmek Yatak toplamak
Orta mesafe yürümek Misafirliğe gitmek Bahçe işi yapmak Araba sürmek Merdiven çıkmak Çamaşır makinesinde çamaşır yıkamak
Soru 2. Geçtiğimiz haftanın kaç günü kendinizi iyi hissettiniz?
(0-7 gün arası işaretleyin)
0 1 2 3 4 5 6 7
Soru 3. Fibromiyalji rahatsızlığı yüzünden geçtiğimiz hafta kaç gün işlerinizden uzak kaldınız (ev işleri dahil)?
0 1 2 3 4 5 6 7
Soru 4. Aşağıdaki her soruyu geçtiğimiz hafta yaşadıklarınıza ve hissettiklerinize göre cevaplayın.
A. Çalışmalarınızı (ağır işler dahil) ağır ve diğer fibromiyalji şikayetleriniz ne ölçüde etkiledi?
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Hiç
etkilemedi
Çok etkiledi B. Ağrınız ne derecede şiddetliydi?
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Ağrım olmadı
Çok şiddetliydi C. Ne kadar yorgundunuz?
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Yorgun değildim
Çok yorgunum D. Sabah katlığınızda kendinizi nasıl hissettiniz?
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
İyi
dinlenmiş uyandım
Çok yorgun uyandım E. Sabah sertliğiniz ne kadar şiddetliydi?
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Hiç olmadı
Çok şiddetliydi F. Sinirliliğiniz ya da anksiyeteniz ne düzeydeydi?
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Hiç
olmadı Çok
gergindim G. Depresyonunuz veya moral bozukluğunuz ne düzeydeydi?
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Hiç olmadı
Çok fazlaydı
Ek 2. Back Anksiyete ölçeği
BECK ANKSİYETE ÖLÇEĞİ
İSİM:
TARİH:
Aşağıda insanların kaygılı ya da endişeli oldukları zamanlarda yaşadıktan bazı belirtiler verilmiştir., Lütfen her maddeyi dikkatle okuyunuz. Daha sonra, her maddedeki belirtinin BUGÜN DAHİL SON BİR HAFTADIR sizi ne kadar rahatsız ettiğim yandaki uygun yere (x) işareti koyarak belirleyiniz.
Hiç Hafif Düzeyde Beni pek
etkilemedi
Orta Düzeyde Hoş değildi ama
katlanabildim
Ciddi Düzeyde Dayanmakta çok zorlandım
1. Bedeninizin
herhangi bir yerinde uyuşma veya
karıncalanma 2. Sıcak/ateş basmaları 3. Bacaklarda halsizlik, titreme 4. Gevşeyememe 5. Çok kötü şeyler olacak korkusu 6. Baş dönmesi veya sersemlik 7. Kalp çarpıntısı 8. Dengeyi
kaybetme duygusu 9. Dehşete kapılma 10. Sinirlilik
11. Boğuluyormuş gibi olma duygusu 12. Ellerde titreme 13. Titreklik
14. Kontrolü
kaybetme korkusu 15. Nefes almada
güçlük
16. Ölüm korkuşu 17. Korkuya kapılma 18. Midede
hazımsızlık ya da rahatsızlık hissi 19. Baygınlık
20. Yüzün kızarması 21. Terleme
(sıcaklığa bağlı olmayan)
Ek 3. Yaygın ağrı indeksi
0-19 arası puan alınır. Ağrının olduğu bölgeler sorgulanır.
Çene (sağ) Çene (sol)
Boyun Sırt
Omuz kuşağı (sağ) Omuz kuşağı (sol)
Üst kol (sağ) Üst kol (sol)
Ön kol (sağ) Ön kol (sol)
Göğüs Abdomen
Kalça (sağ) Kalça (sol)
Uyluk (sağ) Uyluk (sol)
Bacak (sağ) Bacak (sol)
Bel
Ek 4. Semptom şiddet skalası
Semptom şiddet skalası (0-12 puan)
Yok Hafif Orta Şiddetli
Yorgunluk 0 1 2 3
Dinlenmeden
uyanma 0 1 2 3
Kognitif semptomlar
0 1 2 3
Yok Birkaçı var Neredeyse yarısı var
Neredeyse tamamı var Somatik
semptomlar*
*Somatik semptomlar: kas ağrısı, irritabl barsak sendromu, yorgunluk-halsizlik, düşünme ya da atırlama problemi, kas zayıflığı, baş ağrısı, abdominal ağrı-kramp, uyuşma-karıncalanma, baş dönmesi-sersemlik hissi, uykusuzluk, depresyon, kabızlık, üst abdominal ağrı, mide bulantısı, sinirlilik, göğüs ağrısı, bulanık görme, ateş, ,shal, ağız kuruluğu, kaşıntı, hırıltı, Raynaud fenomeni, kurdeşen-ürtiker-cilt kabarıklığı, kulak çınlaması, kusma, mide ekşimesi, ağız ülseri, tat değişikliği-kaybı, nöbet, kuru gözler, nefes darlığı, iştahsızlık, döküntü, güneş hassasiyeti, işitme güçlüğü, kolay yaralanma-morarma, saç dökülmesi, sık idrara çaıkma, ağrılı idrar yapma ve mesane spazmları
Ek 5. Kullanılan Malzemeler Ek 5.a. Kullanılan Aletler
AgarozJelElektroforezGüçKaynağı, Claver( İngiltere ) AgarozJelTankıveDüzeneği( Mini ), Biometra ( ABD ) UV Kaynağı, VilberLourmat( Fransa )
OtomatikMikropipetler, Axygen( ABD ) pHMetre, WTW ( Almanya )
ManyetikKarıştırıcı, Daihan( Güney Kore) HassasTerazi, Mettler AT 261 ( İsviçre ) HassasTerazi, Mettler PJ6000 ( İsviçre ) Mikrosantrifüj, Eppendorf( ABD )
Otoklav, Tek-Bal( Türkiye )
PastörEtüv, Elektro-Mag ( Türkiye )
Spektrofotometre, Shimatzu Mini1240 ( Japonya) KırıkBuzMakinası, Scotsman ( ABD )
Buzdolabı, Arçelik( Türkiye )
DerinDondurucu -20 oC, Philco( Türkiye ) Isı DöngüCihazı, Techne(İngiltere ) Isolab( Türkiye )
Ek 5. b. Kullanılan Kimyasal Maddeler
Etanol, fenolveizoamil alkol Merck (Almanya); Kloroform Carlo Erba (İtalya); 50 bp ve25 bp DNA belirteç, Mavi / Turuncu 6X Yükleme boyası, dNTP, Taq Polimeraz enzim ve MspI restriksiyon enzim setleri MBI (Litvanya),Hsp92II restriksiyon enzim seti promega (ABD), Primerler iontek (Türkiye) ve bunların dışında kullanılan diğer tüm kimyasallar Sigma (ABD)’ den satın alınmıştır.
PrimerlerPrimerler Primer dizileri (5'→3')
HT2AR1F AAGCTCCAAGGTAGCAACAGC
HT2AR1R AACCAACTTATTTCCTACCAC
HT2AR2F TCTGCTACAAGTTCTGGCTT
HT2AR2R CTGCAGCTTTTTCTCTAGGG
COMTF GGAGCTGGGGGCCTACTGTG
COMTR GGCCCTTTTTCCAGGTCTGACA
Ek 5.c. Kullanılan Kimyasal Çözeltiler DNA İzolasyonu
Solüsyon 1:
10 mMTris-HCl( pH 7.6 ) 10 mMKCl
10 mM MgCl2
Solüsyon 2:
10 mMTris-HCl( pH 7.6 ) 10 mMKCl
10 mM MgCl2
0.5mM NaCl
% 0.5 SDS 2 mM EDTA TE Tamponu:
10 mMTris-HCl( pH 7.4 ) 1 mM EDTA ( pH 8.0 ) PZR
10XReaksiyon Tamponu:
500 mMTris-HCl, pH 8.8,
0.1% Tween®20 25 mMdNTPs:
100 mMnükleotidlerden ( dATP, dCTP, dTTP, dGTP ) eşitmiktardakarıştırılarakhazırlandı.
Agaroz Jel Elektroforezi 10XTBE :
54 gr Trisbaz 27 gr Borikasit
20 ml 0.5 M EDTA ( pH 8.0 )
Mavi/Turuncu 6X Yükleme Boyası:
%10 Fikol® 400
% 0.25 BromofenolMavisi
% 0.25 Ksilensiyanol
% 0.4 Turuncu G
10 mMTris-HCl( pH 7.5 ) 50 mM EDTA
PZR Ürünlerinin Restriksiyon Enzimi ile Kesimi( RFLP ) 10 X RFLP Tamponu:
10 mMTris-HCl( pH 7.5 ) 10 mM MgCl2
50 mMNaCl 0.1 mg/ml BSA
