FARKLI ORTAMLARDAN İZOLE EDİLEN MİKROORGANİZMALAR
KULLANILARAK Pinus sylvester, Carpinus betulus ve Populus canadensis AĞAÇLARININ TALAŞLARINDAN ETİL ALKOL ÜRETİMİ
Merve DİLMAÇ Y.Lisans Tezi Biyoloji Anabilim Dalı
Danışman: Yrd. Doç. Dr. İsa KARAMAN 2011
T.C.
GAZİOSMANPAŞA ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ GENEL BİYOLOJİ ANABİLİM DALI
YÜKSEK LİSANS TEZİ
FARKLI ORTAMLARDAN İZOLE EDİLEN MİKROORGANİZMALAR
KULLANILARAK Pinus sylvester, Carpinus betulus ve Populus canadensis
AĞAÇLARININ TALAŞLARINDAN ETİL ALKOL ÜRETİMİ
MERVE DİLMAÇ
TOKAT 2011
TEZ BEYANI
Tez yazım kurallarına uygun olarak hazırlanan bu tezin yazılmasında bilimsel ahlak kurallarına uyulduğunu, başkalarının eserlerinden yararlanılması durumunda bilimsel normlara uygun olarak atıfta bulunulduğunu, tezin içerdiği yenilik ve sonuçların başka bir yerden alınmadığını, kullanılan verilerde herhangi bir tahrifat yapılmadığını, tezin herhangi bir kısmının bu üniversite veya başka bir üniversitedeki başka bir tez çalışması olarak sunulmadığını beyan ederim.
ÖZET
YÜKSEK LİSANS TEZİ
FARKLI ORTAMLARDAN İZOLE EDİLEN MİROORGANİZMALAR KULLANILARAK Pinus sylvester, Carpinus betulus ve Populus canadensis AĞAÇLARININ TALAŞLARINDAN
ETİL ALKOL ÜRETİMİ Merve DİLMAÇ Gaziosmanpaşa Üniversitesi
Fen Bilimleri Enstitüsü Genel Biyoloji Anabilim Dalı
Danışman : Yrd. Doç. Dr. İsa KARAMAN
Kullanılan fosil yakıtların ekosisteme verdikleri zarar doğrudan veya dolaylı olarak tüm canlılığı etkilemektedir. Bilim insanları ve insanlık artık çevre dostu yakıtların kullanılma zamanının bir zorunluluk olduğunu vurgulamaktadır. Etanol bu çevre dostu yakıtlardan birini temsil etmektedir. Biyoetanol üretiminde kullanılan substratlar oldukça fazla çeşitlilik göstermektedir. Bu çalışmada kullanılan substratlardan sadece 3 bitkiye ait talaş örnekleri tercih edilmiştir. Fosil yakıtlarla kıyaslandığında bu örnekler oldukça düşük maliyetlidir. Biliyoruz ki biyoetanol benzinli motorlu araçlarda % 30- 35’lere varan düzeyde yakıta katılarak kullanılabilmektedir. Çalışmanın neticesinde biyoetanol üretiminde oldukça verimli olan suşlar belirlenerek bundan sonraki çalışmalarda insanlara ışık tutması ve bu mikroorganizmalar üzerine dikkat çekilmesi hedeflenmektedir. Tokat İli, Zile İlçesi’nde yetişen üzüm bağlarından toplanan üzüm meyvelerinin yüzeyleri Fizyolojik Tuzlu Su ile yıkanıp örnekler alınarak mikrobiyal izolasyonlar yapılmıştır. İzolasyonlar neticesinde ortaya çıkan mikrobiyal çeşitlilik içerisinden bu çalışma için mikroorganizmalar tercih edilmiştir. Bu işlemlerin neticesinde bu bölgede yetişen üzüm meyveleri üzerinde simbiyotik olarak yaşayan mikroorganizma izolatları belirlenmiştir. Deneylerde kullanılmak üzere elde edilen hedef suşlar biyokimyasal ve morfolojik testlerle genus bazında identifikasyonları yapılmış ve biyoetanol eldesinde yapılacak olan testlerde kullanılmak üzere saflaştırılarak stok kültüre alınmıştır. Biyoetanol elde etme sürecinde en verimli olan mikroorganizma suşları tespit edilmiştir. Anaerobik ortamda, Carpinus betulus (gürgen) talaşı için MD-77 mikroorganizması ile yapılan denemede etanol üretiminin gerçekleşmediği, 3, 22, 42, 25, 27, 57, 55, MD-44 ve MD-70 ile yapılan denemelerde ise etanol üretiminin gerçekleştiği görülmüştür. Populus canadensis (kavak) talaşı için MD-77 mikroorganizması ile yapılan denemede etanol üretiminin oldukça az olduğu, diğer mikroorganizmalarda ise etanol üretimi oldukça fazla olduğu görülmüştür. Pinus sylvester (çam) talaşı için, MD-3 mikroorganizması ile yapılan denemede etanol varlığı tespit edilememiş, MD-55 mikroorganizması ile yapılan denemede ise etanol üretiminde olumlu bir sonuca ulaşılmıştır. Ancak diğer mikroorganizmalarla gerçekleştirilen fermantasyon sonuçlarında etanol üretiminin çok az olduğu NMR sonuçları ile ortaya konulmuştur. Aerobik ortamda ise, 3 ayrı talaş örneği (Carpinus betulus, Populus canadensis ve Pinus sylvester) ile hazırlanan mediumların inkübasyonu sonucu etil alkol üretip üretmediğini kontrol etmek için kromik asit testi uygulanmıştır. Carpinus betulus (gürgen) talaşı için aerobik ortamda MD-48, MD- 47, MD-23, MD-35, MD-76, MD-33, MD-4, MD-70b ve MD-52 kodlu suşlar, Populus canadensis (kavak) talaşı için aerobik ortamda, MD-52 kodlu suşu ve Pinus sylvester (çam) talaşı için aerobik ortamda, MD-33, MD-76, MD-70b, MD-4 ve MD-52 kodlu suşlar pozitif sonuçlar verdiği tespit edilmiştir.
ABSTRACT Ms Thesis
ETHANOL PRODUCTION FROM WOOD CHIPS OF Pinus sylvester, Carpinus betulus and Populus canadensis TREES USING MICROORGANISMS ISOLATED FROM DIFFERENT
SAMPLES. Merve DİLMAÇ Gaziosmanpaşa University
Graduate School of Natural and Applied Sciences Department of Biology
Supervisor : Asst. Prof. Dr. İsa KARAMAN
The damage given to ecosystem by used fossil fuels effects all living beings. Scientists and humanity emphasize the necessity of using of friendly fuels for environment. Ethanol is one of those friendly fuels. Substrates used in bioethanol production vary. In this project, only three sawdust samples from used substrates were choosed. These samples are so inexpensive when they are compared with fossil fuels. As we know , bioethanol may be used in %30-35 ratio in vehicles by petroleum. In the result of this study, strains that are highly productive in bioethaanol production were determined. In the next studies, it is aimed that this study coulld light the way for human and take attention upon these microorganisms. Grape samples were collected from grape orchards in Tokat, Zile and they were washed with Physiologic Salt Water and then microbial isolations were made from samples. In the result of microbial isolations, microorganisms were choosed for study. In the results of the proseses, simbiotic microorganism strains which live upon the grapes were choosed. Biochemical and morphological tests, identifications were made from collected strains for using in the experiments and then were prepared cultures. The most productive mikroorganism strains were determined. In anaerobic fermantation, for Carpinus betulus sawdust, bioethanol production didn’t take place for 77 strain and was taken place for 3, 22, 42, MD-25, MD-27, MD-57, MD-55, MD-44, MD-70 strains. Also, for Populus canadensis sawdust, bioethanol production was seen in low level for MD-77 strain and in the others were seen high level. For Pinus sylvester sawdust, bioethanol wasn’t obtained for MD-3 but for MD-55 strain. However, bioethanol production in the fermantation results occured by the other microorganisms was observed to be little by the NMR results. Also, in aerobic medium, cromic acid test was applied to control whether in media prepared by 3 different sawdust samples ethyl alcohol is produced or not. For Carpinus betulus with the help of 48, 47, 23, 35, 76, 33, MD-4, MD-70b and MD-52 strains, for Populus canadensis with the help of MD-52 strain and for Pinus sylvester sawdust with the help of MD-33, MD-76, MD-70b, MD-4, MD-52 strains were determined giving the positive results.
2011, xi+72 pages
Key words: Biomass, Ethanol, Mikroorganism, Saccarafication, Fermantation
TEŞEKKÜR
Tüm dünyada insanların yaşam tarzları ve ekonomik süreçlerinde büyük bir öneme sahip olan fakat ekosistem üzerinde oldukça tehlikeli yan etkiler bırakan fosil yakıtlarını kabul etmekle beraber global ekonominin çevre üzerinde daha az olumsuz etkisi olabilecek alternatif yakıtların geliştirilmesi konusunda çaba sarfetmesi gerektiği görülmektedir. Bu hassas konuya yönlenmenin bir yolu alternatif ve yenilenebilir bir enerji kaynağı olarak biyoatıkların ve biyokütlelerin değerlendirilmesidir. Bitki hücrelerinin morfolojik yapı elemanlarından olan, selüloz, hemiselüloz ve lignoselülozik maddeler gibi yapılar biyoürün gelişimi için atıkları önemli bir hale getirir ve biyoteknolojik işlemler sayesinde doğal çevrenin korunmasına yardım etmede bir fırsat sunduğu görülmektedir.
Maddi manevi her türlü çalışma imkanını sunan, bu projeye çalışma fikri veren ve yardımlarını esirgemeyen değerli hocam Yrd. Doç. Dr. İsa Karaman’a içten teşekkürlerimi sunarım. Ayrıca bu çalışmada kullanılan biyokütle teminini sağlayan Tokat sanayi esnaflarına, kimyasal malzeme temini sağlayan Turhal mermer’e, laboratuvar malzemelerini kullanmama izin veren ve yardımlarını esirgemeyen Kimya Bölümü hocaları, Arş. Gör. Hayrettin Gezegen, Uzm. Hüseyin Akşit ve Uzm. Özkan Şen’e, çalışmamda emeğini esirgemeyen Y. Lisans Öğr. Mine Farımaz ve diğer arkadaşlarıma teşekkür ederim.
Merve DİLMAÇ 2011
İÇİNDEKİLER Sayfa ÖZET... i ABSTRACT...ii TEŞEKKÜR...iii İÇİNDEKİLER...iv
SİMGE VE KISALTMALAR DİZİNİ...vi
ŞEKİLLER DİZİNİ...viii ÇİZELGELER DİZİNİ...xi 1. GİRİŞ...1 2. LİTERATÜR ÖZETLERİ...9 3. MATERYAL VE METOD...12 3.1.Materyal...12 3.1.1. Biyokütle... 12 3.1.2. Kullanılan Besiyerleri... ..12
3.1.2.1. Bakteriler İçin Genel Besi Ortamı... ...12
3.1.2.2. Mayalar için Genel Besi Ortamı... ..13
3.1.3. Mikroorganizmaların İzolasyonu... ...14
3.1.4. Mikroorganizmaların Yağ Asidi Metil Esterlerinin Saflaştırılmasında Kullanılan Çözeltiler...18
3.2. Metod...22
3.2.1. Mikroorganizmaların Seçimi...22
3.2.2. Biyoetanol Üretiminde Kullanılacak Hammaddeler...23
3.2.3. Kültür Ortamının Hazırlanması...23
3.2.3.1. Bakteriler için genel besi ortamının hazırlanması...23
3.2.3.2. Nutrient Agar Besi Yerinin Hazırlanması...23
3.2.3.3. Müller Hinton Besi Yerinin Hazırlanması...24
3.2.3.4. Brain Heart Infusion Agar Besi Yerinin hazırlanması...24
3.2.3.5. Mayalar İçin Genel Besi Ortamının Hazırlanması...24
3.2.3.5.1. Yeast Pepton Glukoz Agar...24
3.2.3.5.2. Yeast Pepton Dekstroz Agar...24
3.2.3.5.3. Yeast Pepton Mannitol Agar...25
3.2.3.6. Fermantasyon Ortamının Hazırlanması...25
3.2.4. Sakkarafikasyon... 25
3.2.5. Nötralizasyon... 26
3.2.6. Antron Testi...28
3.2.7. Dietil Eter Muamelesi... 28
3.2.8. Fermantasyon... 29
3.2.9. Biyoetanolün Verimlilik Testi... 30
3.2.10. Fraksiyonel Destilasyon Prosesi... 30
3.2.11. Kromik Asit Testi... 31
3.2.12. İzole Edilen Mikroorganizmaların Morfolojik ve Biyokimyasal Testleri... 33
3.2.12.1. Katalaz Testi... 33
3.2.12.2. Gram Reaksiyon Testi... 33
3.2.12.3. Oksidaz Testi... 33
3.2.13. Mikroorganizmaların Yağ asidi Analizi... 34
Sayfa
4.1. Etanol Üretiminde Kullanılan Mikroorganizmalar... 36
4.2. Anaerobik Ortamda Biyoetanol Üretimi... 38
4.3. Aerobik Ortamda Biyoetanol Üretimi... 41
5. SONUÇ ve TARTIŞMA... 48
KAYNAKLAR... 52
EKLER... 55
EK1- FERMANTASYON SONUÇLARININ NMR DEĞERLERİ... 56
SİMGE VE KISALTMALAR DİZİNİ Simgeler Açıklama μg mikrogram 0C santigrad dk dakika h saat atm atmosfer w/v ağırlık/hacim ml mililitre M molar kg kilogram g/L gram/Litre mg/Litre miligram/Litre Kısaltmalar Açıklama ddH2O Double distile su CaCO3 Kalsiyum karbonat H2SO4 Sülfürik asit Na2Cr2O7 Sodyum dikromat K2Cr2O7 Potasyum dikromat TCA Trikarboksilik asit CO2 Karbondioksit H2 Hidrojen C5H8O4 Ksilan
H2O2 Hidrojen peroksit KOH Potasyum hidroksit NaOH Sodyum hidroksit
YPM Yeast pepton mannitol YPG Yeast pepton glukoz YPD Yeast pepton dekstroz ATP Adenozin trifosfat TSA Triptik soy agar FTS Fizyolojik Tuzlu Su GC Gaz Kromotografisi
NMR Nükleer Manyetik Rezonans HMF Hidroksi metil furfural
ŞEKİLLER DİZİNİ
Sayfa
Şekil 1.1. Saccharomyces cerevisiae...5
Şekil 3.1. Tokat’ın Zile ilçesindeki üzüm bağlarından toplanan iri siyah üzüm (öküz gözü) örneği...15
Şekil 3.2. Tokat’ın Zile ilçesindeki üzüm bağlarından toplanan küçük siyah üzüm (taş kara) örneği...15
Şekil 3.3. Tokat’ın Zile ilçesindeki üzüm bağlarından toplanan küçük siyah üzüm (taş kara) örneği genel görüntüsü...16
Şekil 3.4. Tokat’ın Zile ilçesindeki üzüm bağlarından toplanan yeşil üzüm (güzel üzüm) örneği...16
Şekil 3.5. Tokat’ın Zile ilçesindeki üzüm bağlarından toplanan yeşil üzüm (misket) örneği...17
Şekil 3.6 Tokat’ın Zile ilçesindeki üzüm bağlarından toplanan yeşil üzüm (narenciye) örneği...17
Şekil 3.7. Tokat’ın Zile ilçesindeki üzüm bağlarından toplanan siyah üzüm (kömüş ciciği) örneği...18
Şekil 3.8. Tokat’ın Zile ilçesindeki üzüm bağlarından toplanan yeşil üzüm (kadın parmağı) örneği... 18
Şekil 3.9. Yağ asidi analizinde kullanılan çözeltiler... 20
Şekil 3.10. Yağ asidi analizinde çalkalayıcının kullanılması... 20
Şekil 3.11. Çalkalama sonrası tüplerde oluşan faz... 21
Şekil 3.12. Yağ asidi çıkarılan mikroorganizmaların hazır hale getirilmesi...21
Şekil 3.13. Steril kabinde mikroorganizma inokülasyonu... 22
Şekil 3.14. Biyokütlenin sakkarafikasyon aşaması... 26
Şekil 3.15. Nötralizasyon işlemi...27
Şekil 3.16. Nötralizasyon işleminde CaCO3 ilavesi...27
Şekil 3.17. Vakumlama...28
Şekil 3.18. Dietil eter muamelesi... 29
Şekil 3.19. Fermantasyon... 30
Şekil 3.20. Fraksiyonel Destilasyon... 31
Şekil 3.21. Kromik asit testi... 32
Şekil 3.22. Kromik asit testi sonucu etil alkol varlığı... 32
Şekil 4.1. Kullanılan Mikroorganizmalar... 36
Şekil 4.2. Carpinus betulus (Gürgen) talaşı için MD-3 mikroorganizması kullanılarak etanol üretiminin NMR sonucu... 39
Şekil 4.3. Carpinus betulus (Gürgen) talaşı için MD-77 mikroorganizması kullanılarak etanol üretiminin NMR sonucu... 39
Şekil 4.4. Aerobik ortamda Carpinus betulus (gürgen) talaşı için kromik asit testi... 42
Şekil 4.5. Aerobik ortamda Carpinus betulus (gürgen) talaşı için kromik asit testi... 42
Şekil 4.6. Aerobik ortamda Populus canadensis (kavak) talaşı için kromik asit testi... 43
Şekil 4.7. Aerobik ortamda Pinus sylvester (çam) talaşı için kromik asit testi... 43
Şekil 4.8. Aerobik ortamda etil alkol üretimi... 45
Şekil 1.1. Carpinus betulus (Gürgen) talaşı için MD-22 mikroorganizması kullanılarak etanol üretiminin NMR sonucu...56
Şekil 1.2. Carpinus betulus (Gürgen) talaşı için MD- 42 mikroorganizması kullanılarak etanol üretiminin NMR sonucu... 56
Şekil 1.3. Carpinus betulus (Gürgen) talaşı için MD- 25 mikroorganizması
kullanılarak etanol üretiminin NMR sonucu... 57 Şekil 1.4. Carpinus betulus (Gürgen) talaşı için MD- 27 mikroorganizması
kullanılarak etanol üretiminin NMR sonucu... 57 Şekil 1.5. Carpinus betulus (Gürgen) talaşı için MD- 57 mikroorganizması
kullanılarak etanol üretiminin NMR sonucu... 58 Şekil 1.6. Carpinus betulus (Gürgen) talaşı için MD- 55 mikroorganizması
kullanılarak etanol üretiminin NMR sonucu... 58 Şekil 1.7. Carpinus betulus (Gürgen) talaşı için MD- 44 mikroorganizması
kullanılarak etanol üretiminin NMR sonucu... 59 Şekil 1.8. Carpinus betulus (Gürgen) talaşı için MD- 70 mikroorganizması
kullanılarak etanol üretiminin NMR sonucu... 59 Şekil 1.9. Populus canadensis (Kavak) talaşı için MD-3 mikroorganizması
kullanılarak etanol üretiminin NMR sonucu... 60 Şekil 1.10. Populus canadensis (Kavak) talaşı için MD-77 mikroorganizması
kullanılarak etanol üretiminin NMR sonucu... 60 Şekil 1.11. Populus canadensis (Kavak) talaşı için MD- 77 mikroorganizması
kullanılarak etanol üretiminin NMR sonucunda ortaya çıkan yan ürünler... 61 Şekil 1.12. Populus canadensis (Kavak) talaşı için MD-22 mikroorganizması
kullanılarak etanol üretiminin NMR sonucu... 61 Şekil 1.13. Populus canadensis (Kavak) talaşı için MD-42 mikroorganizması
kullanılarak etanol üretiminin NMR sonucu... 62 Şekil 1.14. Populus canadensis (Kavak) talaşı için MD-25 mikroorganizması
kullanılarak etanol üretiminin NMR sonucu... 62 Şekil 1.15. Populus canedensis (Kavak) talaşı için MD-27 mikroorganizması
kullanılarak etanol üretiminin NMR sonucu... 63 Şekil 1.16. Populus canadensis (Kavak) talaşı için MD-57 mikroorganizması
kullanılarak etanol üretiminin NMR sonucu... 63 Şekil 1.17. Populus canadensis (Kavak) talaşı için MD- 55 mikroorganizması
kullanılarak etanol üretiminin NMR sonucu...64 Şekil 1.18. Populus canadensis (Kavak) talaşı için MD-44 mikroorganizması
kullanılarak etanol üretiminin NMR sonucu... 64 Şekil 1.19. Populus canadensis (Kavak) talaşı için MD- 70 mikroorganizması
kullanılarak etanol üretiminin NMR sonucu... 65 Şekil 1.20. Pinus sylvester (Çam) talaşı için MD-3 mikroorganizması kullanılarak etanol üretiminin NMR sonucu... 65 Şekil 1.21. Pinus sylvester (Çam) talaşı için MD-77 mikroorganizması kullanılarak etanol üretiminin NMR sonucu... 66 Şekil 1.22. Pinus sylvester (Çam) talaşı için MD-22 mikroorganizması kullanılarak etanol üretiminin NMR sonucu... 66 Şekil 1.23. Pinus sylvester (Çam) talaşı için MD-42 mikroorganizması kullanılarak etanol üretiminin NMR sonucu... 67 Şekil 1.24. Pinus sylvester (Çam) talaşı için MD-25 mikroorganizması kullanılarak etanol üretiminin NMR sonucu... 67 Şekil 1.25. Pinus sylvester (Çam) talaşı için MD-27 mikroorganizması kullanılarak etanol üretiminin NMR sonucu... 68 Şekil 1.26. Pinus sylvester (Çam) talaşı için MD-57 mikroorganizması kullanılarak etanol üretiminin NMR sonucu... 68 Şekil 1.27. Pinus sylvester (Çam) talaşı için MD-55 mikroorganizması kullanılarak etanol üretiminin NMR sonucu... 69
Şekil 1.28. Pinus sylvester (Çam) talaşı için MD-44 mikroorganizması kullanılarak etanol üretiminin NMR sonucu... 69 Şekil 1.29. Pinus sylvester (Çam) talaşı için MD-70 mikroorganizması kullanılarak etanol üretiminin NMR sonucu... 70
ÇİZELGELER DİZİNİ
Sayfa Çizelge 1.1. Ülkelere / Bölgelere Göre Etanol Üretimi (2005)... 8 Çizelge 4.1. Kullanılan mikroorganizmaların suş kodları ve tür adları...37 Çizelge 4.2. Anaerobik ortamda Carpinus betulus (gürgen) talaşı için etil alkol üretim sonuçları... 40 Çizelge 4.3. Anaerobik ortamda Populus canadensis (kavak) talaşı için etil alkol üretim sonuçları...40 Çizelge 4.4. Anaerobik ortamda Pinus sylvester (çam) talaşı için etil alkol üretim
sonuçları...41 Çizelge 4.5. Aerobik ortamda Carpinus betulus (gürgen) talaşı için etil alkol üretim sonuçları...44 Çizelge 4.6. Aerobik ortamda Populus canadensis (kavak) talaşı için etil alkol üretim sonuçları...44 Çizelge 4.7. Aerobik ortamda Pinus sylvester (çam) talaşı için etil alkol üretim
sonuçları... 45 Çizelge 4.8. Teşhisi yapılan mikroorganizmaların biyokimyasal, morfolojik ve
1. GİRİŞ
Ekonomistlere göre, dünya çapındaki gerilemenin ana sebebi enerji üretiminin oldukça pahalı olması ve bu durumun ancak enerji tasarrufu ve alternatif yakıt üretiminde yeni teknolojilerin kullanılmasıyla dengeleneceğidir. Kaçınılmaz olarak fosil yakıt üretimi yerine, “biyokütle” fikri olabilirlik sınırları içinde, oldukça popüler olmuştur. Biyokütle enerji problemine kısmı bir çözüm sağladığı düşünülmektedir. Bu kısmi çözüm içerisinde, alışılagelmiş otomotiv yakıtı yerine geçecek alkol ve diğer uçucu bileşiklerin üretiminde, “biyokütle şeker içeriğinin fermantasyonu” izlenecek yollardan birisi olarak görülmektedir. Bazı bitkisel atıklar ya da biyokütle atık olarak görünse de aslında bunların içerdikleri karbonhidratlar bakımından oldukça zengin oldukları bilinmektedir. Endüstriyel işletmelerde özellikle şeker fabrikalarında atık olarak nitelendirilen melas bugün biyoetanol üretiminde birinci sırayı almıştır. Petrol ve kömürün büyük tüketimleri yüzünden atmosferdeki CO2 birimi küresel ısınma ve iklim değişiminin büyük bir faktörü olarak tanımlama noktasına gelmiştir (Ward ve Singh, 2002).
Bu yüzden etanol, metan ve hidrojen gibi alternatif enerji kaynakları araştırılmaktadır. Petrol yerine biyoetanol kullanımı araçların CO2 salınımını %90 azaltabilir (Ward ve Singh, 2002).
Geniş çapta üretilen endüstriyel alkolün yakıt olarak kullanılabilmesi yanında; günümüzde alkolün teknikte yaygın bir kullanım alanı vardır. Eritken madde olarak birçok maddelerin hazırlanmasında, suni ipek yapımında, renk maddelerinin yapılmasında, sirke yapımında, kimyasal birçok ecza ve kimyasal maddelerin hazırlanmasında, parfümeride, nitrosellüloz ve patlayıcı maddelerin yapılmasında, konservecilikte ve içki yapımında kullanılmaktadır (Çelebi ve Güngör, 1997).
Günümüzde alkol üretimi büyük ölçüde fermantasyona dayanmaktadır. Fermantasyonda kullanılacak karbon kaynağının ucuz olması, biyolojik yapısı ve kimyasal bileşiminin kullanılan rnikroorganizmaların fizyolojik gereksinimlerine cevap verebilmesi
gerekmektedir. Selülozik atıklar, bugün dünya üzerinde biyokütlenin en çok kullanılan formudur. Ama bu atıkların enerji içeriklerini, direk yanma ile düzenlemek çok daha ekonomiktir. Yararlanılabilir şekerin doğal selülozdan çıkarılması için kullanılan, gelişmekte olan bu yöntemlerin problemi dünya çapında kabul görmemektir. Bugün fermantasyon endüstrisinde en gerçekçi substratlar, şeker deposu olan enerji ürünleri veya hidrolize polisakkaritlerdir. Bu substratlar, biyokütle dönüşümü için özel olarak yetiştirilmiş olabilecekleri gibi, gıda üretimi sırasında açığa
çıkmış atıklar veya bozulmuş ürünler de olabilirler. Bu tür hammadde, güneş ışığının bol bulunduğu ve işgücünün ucuz olduğu gelişmekte olan ülkelerde bulunmaktadır. Fermantasyonda kullanılan substratlara örnek olarak; hububat sap ve samanları ile hububat kepekleri, şeker melası ve küspesi, meyve-sebze artıkları, peynir altı suyu, nişasta artıkları veya yan ürünleri ile üretim fazlası meyve ve sebzeler verilebilir. Şeker kamışı, mısır nişastası gibi tahıl kaynaklı substratlardan etanol üretimi iyi gelişmiş bir teknolojidir (Çelebi ve Güngör, 1997).
Ülkemiz, tarımsal ve gıda prosesi artıkları, tüketimi az olan hammaddelerin değerlendirilmeleri, fermantasyonda yararlanılmaları açısından çok etkileyici ve çekici imkanlar sergilese bile; değerlendirilmeyen veya kısmen değerlendirilen çok miktarda artık bulunmaktadır.
Çoğu bitki materyalinin kuru ağırlığının yaklaşık %90’ı selüloz, hemiselüloz, pektin ve lignin oluşumunda depolanır. Atık materyallerden selüloz ve hemiselülozun şekere dönüşümü yakıt etanolü için bir hammadde sağlar ve somut olarak atıkların miktarını azaltır (Iranmahboob ve ark., 2002).
Atıkların değerlendirilmesiyle ilgili olarak birçok çalışma yapılmaktadır. Özellikle etil alkol üretimi, son zamanlarda önem kazanmakta birçok sanayi atığı, şehir kanalizasyon atığı ve diğer katı atıkları hammadde olarak kullanıp, etil alkol üretilmeye çalışılmıştır. Bu kaynakların hammadde olarak kullanılması için bazı ön işlemlerden geçirilmesi ve hidroliz yoluyla maya ve bakterilerin fermantasyon sırasında kullanabilecekleri karbon kaynaklarının oluşturulması gerekmektedir. Bunun için birçok yöntem uygulanmaktadır. ‘Wet Oxidation’ , asit hidrolizi, ‘ADP (Ammoniation Pressurization-Depressurization prosesi)’ ve sellülaz enzimi ile hidroliz bu yöntemlerden bazılarıdır. Bu yöntemlerle elde edilen verimi arttırmak için bazı kombinasyonlar da uygulanır. Hidroliz olayında dikkat edilecek en önemli nokta yan ürün olarak oluşan hidroksi metil furfural (HMF) ve şeker asitleri gibi maddelerin alkol fermentasyonu sırasında mayaların çalışmasını inhibe etmeleridir. Bu problemi ortadan kaldırmak için genetik olarak adapte edilmiş mayalar kullanılarak etil alkol üretimi gerçekleştirilmiştir. Bir çalışmada iki aşamalı asit hidrolizi sonucunda sellülaz enzimi kullanarak şeker verimi %75’e çıkartılmış, hidroliz yan ürünleri olan inhibitörlere adapte edilmiş Saccharomyces cerevisiae ile %90 etil alkol üretilebilmiştir. Fermentasyon sonucunda elde edilen etil alkol destilasyon yoluyla ortamdan ayrılır. Bu yolla elde edilen etil alkol, alkollü içkilerde ana madde olarak ve kimyasal ürünlerin hammaddesi olarak kullanılmaktadır. Etil alkolün en önemli özelliği ise yanma sonucu açığa çıkardığı enerjiyle, diğer enerji kaynaklarına alternatif
Biyolojik veya kimyasal proses atıklarının, alkol üretiminde kullanılmasındaki amaç hızlı artan ihtiyacı karşılamakla birlikte, tarımsal ve endüstriyel atıkları substrat olarak kullanmak ve çevre kirlenmesi sorununa çözüm getirirken, sonuçta ekonomik değeri olan bir ürün elde etmektir (Çelebi ve Güngör, 1997).
Etil alkol üç amaç için üretilmektedir; alkollü içkiler için, ana madde olarak ve kimyasal ürünlerin hammaddesi olarak. Alkollü içkilerde şekerin fermentasyonu sonucu etil alkol oluşur. Bunun yanında etil alkol çözgen olarak, önemli işlemlerde, sudan sonra ikinci sırada bulunur. Etil alkol çözgenler, ekstraktlar, boyalar, farmasotikler, lubrikantlar, adezivler, deterjanlar, pestisidler, plastisizerler, yüzey kaplama maddeleri, kozmetikler, patlayıcı maddeler, sentetik liflerin yapılmasında kullanılan reçineler gibi diğer organik maddelerin sentezinde bir substrat olarak kullanılırlar. Ayrıca asetaldehit, etil asetat, asetik asit, etilen dibromür, glikoller ve etil klorür gibi kimyasal maddelerin hammaddesini yine etil alkol oluşturur. 2. Dünya Savaşından sonra lastik üretiminde de kullanılmaya başlanmıştır (Ergin ve Çetin, 2001).
Etil alkol son zamanlarda enerji sektöründe de önem kazanmıştır. Kullanılmakta olan enerji kaynaklarının yerine alternatif olabilecek enerji kaynakları araştırılmaktadır. Petrol, gaz ve kömür gibi şu an kullanılan enerji kaynaklarının sınırlı oluşu ve 2100 yılına kadar tükenmesi beklendiği için etil alkolünde bir enerji kaynağı olarak kullanılması tasarlanmaktadır. Ayrıca bu kaynakların ‘Sera Etkisi’ne sebep oldukları bilinmekte ve kullanımlarının mümkün olduğunca azaltılması istenmektedir. 1975 yılından itibaren Brezilya enerji kaynağı olarak etil alkol kullanmakta ve 1996 yılında artık Brezilya’daki yakıtların %30’unu şeker pancarından elde edilen etil alkol oluşturur (Ergin ve Çetin, 2001).
Etanol üretiminde dünya ülkeleri arasında lider konumunda olan Brezilya 2005 yılı verilerine göre 16500 milyon litre ile dünyadaki toplam üretimin % 45,2’lik dilimine sahiptir. Topraklarının 50000 m2’sinde etanol üretiminde kullanılmak üzere şeker kamışı yetiştirilirken, tarım ayağından başlayan biyoetanol üretim zincirinde 1 milyon kişi istihdam edilmektedir (Dereli, 1999).
Biyoethanol’ün 12 milyon litresini kullanan İsveç gazın 5.5 milyar litrenin yaklaşık %0.22’sini kullanmıştır. Ethanol için talebin 2010 yılına kadar artacağı düşünülmüştür (Senthilkumar ve Gunasekaran, 2005).
Etanol üretimine uygun besin stoğunun seçilmesi
İçilebilir alkol üretim endüstrisi, kendi teknolojisini geliştirmiş, pratik ve karlı bir sistemdir. Bu endüstri dalı, düşük ücretli lüks pazarlara sunmaktadır. Bu endüstrinin teknikleri, enerji ve hammaddenin ucuz olduğu, kirlenme ile mücadelenin bir sosyal ihtiyaç olmadığı dönemlerde belirlenmiştir.
Hammaddeleri fermantasyona uygun hale getirmek için bir ön işlem gerekmektedir. Geçmişte, substratın orijinal kompozisyonunun getirdiği fiziksel kısıtlamalarda göz önüne alınarak mümkün olduğunca ideale yakın hammadde üretimine yeterli önem verilmemiştir.
İdeal fermantasyon işlemi için substratın aşağıdaki özellikleri içermesi gerekir;
1. Fermente olabilecek şeker konsantrasyonu, belirli fermantasyon metoduna uygun olacak şekilde düzenlenmeli ve işlem sonunda arta kalan şeker miktarının minimum seviyede tutulacağından emin olunmalıdır.
2. Substrat uygun sıcaklık derecesinde ve optimum pH’da berraklaştırılmalı ve maya için gerekli besin maddelerini yeterli miktarda içermelidir.
3. İnokulum hariç diğer mikroorganizmalar, pastörizasyon, antibiyotik veya antiseptik ilavesi, sterilizasyon metodlarının biriyle yok edilmelidir. Seçilen yok etme metodu ve derecesi, çalışmakta olan fermantasyon sistemine bağlıdır.
4. Maya üzerinde toksik etkiye sahip maddeler, uygun derecede azaltılmalı veya tamamen kaldırılmalıdır.
5. Osmotik basıncın ters etkisi uygun seviyelerde tutulmalıdır (Çelebi ve Güngör, 1997).
Mayalar
arasında değişir. Özellikle ekmek yapımında ve alkollü içki sektöründe kullanılırlar. Glikoz içeren hammaddeler, Saccharomyces türleri ile fermente edilirse seyreltik alkol çözeltisi elde edilir (Çelebi ve Güngör, 1997).
Saccharomyces cerevisiae’ın biyoetanol üretiminde tercih edilme nedenleri ;
• Ökaryotik ve kararlı yapıdadırlar. • Yüksek çoğalma hızı (aerobik olarak) • Yüksek etanol fermantasyon hızı • Güçlü invertaz üretimi
• Melastaki inhibitör bileşenlerinde yüksek tolerans • Kolaylıkla korunabilir ve çoğalabilir.
Şekil 1.1. Saccharomyces cerevisiae
Mayaların gelişmesi için gerekli optimum sıcaklıkları türlere bağımlıdır. Örneğin, optimum sıcaklık Saccharomyces cerevisiae türü için 27-30°C, S. ellipsoideus için 25°C dir. Vikarii ve ark. (1981), tarafından yürütülen fusarium türü mantarların fermentasyonu yoluyla, iki anaerobik termofilik bakteri (Clostridium thermorellum ve Thermoanaero bacterethanolicus) kullanarak ksilozun ethanole fermentasyonu sağlanmıştır. Optimum pH ise bira mayaları için 3.4-3.9’dur. Besi yerlerindeki suyun, besinlerin, osmotik basıncın, oksijenin ve ışığın da mayaların gelişmesi üzerine etkisi fazladır.
Bakteriler
Mikroorganizmalar kullandıkları enerji kaynaklarına göre iki gruba ayrılır. Bunlar ışık enerjisini kullanan fototroflar ve kimyasal bağ enerjisini kullanan kemotroflardır. Kemotroflar da organik maddelerin kimyasal bağ enerjilerini kullananlar (organotroflar) ile inorganik maddelerin kimyasal bağ enerjilerini kullanan litotroflar olmak üzere iki kısımda incelenirler. Glikozun tamamen okside edilerek CO2 ve H2O haline dönüştürülmesine solunum adı verilir. Ancak bazı mikroorganizmalar bu işlemi sonuna kadar yürütemezler. Glukoz ancak kısmen parçalanabilir. Bu işleme de fermantasyon adı verilir. Fermantasyonda çok daha az enerji elde edilir ve son ürün olarak da oldukça kompleks ve halen enerji taşıyan organik maddeler üretilir (Hasanekoğlu ve Yeşilyurt, 2002).
Glikoliz de glukoz pürivik aside okside edilir. Glikoliz sonucu glukoz molekülünde saklanan enerjilerin bir kısmı açığa çıkar. Bu olayda iki molekül ATP kullanılarak glukoz, iki molekül 3 C’lu pürivik asit haline dönüştürülür ve 4 molekül ATP ile 2 molekül NADH üretilir. Reaksiyon 10 basamaktan oluşur her basamağı özel bir enzim katalize eder. Bu reaksiyonlar sonucunda her bir glukoz molekülü başına net 2 molekül ATP enerjisi kazanılmış olur.
Glukozun pürivik aside okside olmasından sonra pürivik asit ya solunumda kullanılmak üzere trikarboksilik asit (TCA) çemberine (Krebs çemberi) gider veya fermantasyona maruz kalır. Fermentasyon yapan bakterilere bir örnek Yersinia pestis olabilir. Özellikle biyokütle gibi öncesinde enzimatik hidroliz olan hammaddelerin fermantasyonunda en çok çalışılmış olan Zymomonas mobilis’tir (Dereli, A., 1999).
Fermantasyonda kullanılan enzimlerin çeşidine bağlı olarak bu maddeler NADH tarafından indirgenir ve etil alkol, laktik asit, asetik asit ve diğer birçok metabolik yan ürün ortaya çıkar. Fermantasyonda son elektron alıcısı olarak organik madde kullanılır. Fermantasyonda moleküler oksijene gerek yoktur.
Glukoz fermantasyonunun son ürünü olan maddeler kimyasal bağlarında henüz önemli miktarda enerji taşımaktadırlar. Bazı bakteriler bu molekülleri fermente ederek enerji elde ederler. Örneğin Acetobacter etil alkolü sirkeye dönüştürür.
Propionibacteria ise enerjilerini diğer bir fermantasyon ürünü olan laktik asidi propiyonik asit, asetat ve karbondioksit haline dönüştürerek kazanırlar (Hasanekoğlu ve Yeşilyurt, 2002).
Etil Alkolün Kullanım Alanları
Etil alkol üç amaç için üretilmektedir; alkollü içkiler için, ana madde olarak ve kimyasal ürünlerin hammaddesi olarak. Alkollü içkilerde şekerin fermentasyonu sonucu etil alkol oluşur. Bunun yanında etil alkol çözgen olarak, önemli proseslerde, sudan sonra ikinci sırada bulunur. Etil alkol çözgenler, ekstraktlar, boyalar, farmasotikler, lubrikantlar, adezivler, deterjanlar, pestisidler, plastisizerler, yüzey kaplama maddeleri, kozmetikler, patlayıcı maddeler, sentetik liflerin yapılmasında kullanılan reçineler gibi diğer organik maddelerin sentezinde bir substrat olarak kullanılırlar . Ayrıca asetaldehit, etil asetat, asetik asit, etilen dibromür, glikoller ve etil klorür gibi kimyasal maddelerin hammaddesini yine etil alkol oluşturur. 2. Dünya Savaşından sonra lastik üretiminde de kullanılmaya başlanmıştır (Çelebi ve Güngör, 1997).
Etil alkol son zamanlarda enerji sektöründe de önem kazanmıştır. Kullanılmakta olan enerji kaynaklarının yerine alternatif olabilecek enerji kaynakları araştırılmaktadır. Petrol, gaz ve kömür gibi şu an kullanılan enerji kaynaklarının sınırlı oluşu ve 2100 yılına kadar tükenmesi beklendiği için etil alkolünde bir enerji kaynağı olarak kullanılması tasarlanmaktadır. Etanol yüksek oktanlı bir yakıt olup, petrolde oktan artırıcı olarak kullanılır. Etanol ile benzin karıştırılarak emisyonu azaltmak ve tam bir yanma sağlamak mümkündür. Yaygın olarak karıştırılan kullanma oranları %10 etanol ve %90 petrol şeklindedir (Ballesteros ve ark., 1991). Ayrıca bu kaynakların ‘Sera Etkisi’ne sebep oldukları bilinmekte ve kullanımlarının mümkün olduğunca azaltılması istenmektedir.
Çizelge 1.1.Ülkelere / Bölgelere Göre Etanol Üretimi (2005) (Licht, 2005)
Ülke / Bölge 2005 Etanol Üretimi
(Milyon Litre) Toplamdaki Payı (Yüzde) Brezilya 16500 45,2 A.B.D. 16230 44,5 Çin 2000 5,5 Avrupa Birliği 950 2,6 Hindistan 300 0,8 Kanada 250 0,7 Kolombiya 150 0,4 Tayland 60 0,2 Avustralya 60 0,2 Dünya Toplamı 36500 100 Biyoetanol’ün Avantajları
Biyoetanol’ün avantajlarını aşağıdaki gibi sıralamak mümkündür: Yerli, yenilenebilir bir yakıt kaynağıdır.
Petrol için dışa bağımlılığı azaltır. Temiz bir yakıt kaynağıdır.
Düşük maliyet ile yakıt oktan sayısını artırır.
Genelde benzinle çalışan araçlarda %30 oranında yakıta katılarak kullanılabilir. Üretimi ve muhafaza edilmesi kolaydır.
Biyoyakıtlar fosil yakıtlardan % 40-80 daha az sera gazı yayar. Asit yağmurunu azaltır.
Daha az su kirliliği oluşturur. Daha az atık oluşturur.
2. LİTERATÜR ÖZETLERİ
Broder ve Barrier (1988), Broder ve ark. (1995), Çeşitli şekerleri üretmek için 3 temel hidroliz süreci vardır; seyreltik asit hidrolizi, konsantre asit hidrolizi ve enzimatik hidroliz. Seyreltik asit, biyokütleyi glukoza hidrolize etmek için kullanılmıştır. Hidroliz biyokütlenin hemiselüloz ve selüloz kısmından maksimum şeker üretimi için iki aşamadan meydana gelir. Konsantre asit hidrolizinde kullanılan asit konsantrasyonu %10-30 arasındadır. Konsantre asit hidrolizi seyreltik asit prosesinden daha yüksek bir etanol verimiyle sonuçlandığını kanıtlamışlardır.
Çelebi ve Güngör (1997), Tarımsal ve endüstriyel atıkları substrat olarak kullanmak ve çevre kirlenmesi sorununa çözüm getirmek, sonuçta ekonomik değeri olan bir ürün elde etmek için kurutulmuş meyve atıklarından etil alkol üretimi yapmışlardır. Denemelerinde, hurda incirden alkol üretilmesinde optimum şartları araştırmışlardır. Bu çalışmalarında; şeker içeriğinin büyük bir kısmı indirgen şekerlerden oluşan incir, alkol hammaddesi olarak kullanılmıştır. Bu çal ma ile hurdaış
incirin etanol verimlili ini maksimum seviyeye ç karman n yollar ara t r lm t r.ğ ı ı ı ş ı ı ış ı
Kadam ve Newman (1997), Biyokütleden etanol üretimi için düşük maliyetli fermantasyon ortamının gelişimini çalışmışlardır. Çalışmalarında Saccharomyces cerevisiae mikroorganizmasını kullanmışlar ve etanol konsantrasyonunu kromotografi yöntemi ile belirlemişlerdir. Glukoz belirlenmesi için yellow spring instruments analyzer kullanılmıştır.
Patrick ve ark. (1997), Broder ve ark. (1995), Optimum şartlarda hemiselüloz seyreltik asit ile kolayca hidrolize edilir, fakat selülozun hidrolizi için daha fazla ekstrem şartlara ihtiyaç duyulur. Seyreltik asit konsantrasyonunda asit konsantrasyonu %2-5 oranındadır.
Sudha ve ark. (1998), O’Brien ve ark. (2004), Japonyada yetersiz tahıl kaynakları yüzünden bu substratlardan büyük miktarda etanol üretimi imkansızdır, bu yüzden son çalışmalar bir alternatif substrat olarak lignoselülozik biyokütle kullanma üzerine odaklanmıştır.
Sreenath ve Jeffries (1999), Pichia stipitis ve Candida shehatae maya suşlarını kullanarak odun hidrolizatından etil alkol üretimini sağlamışlardır. Etanol üretimi pH 5.5-6.0 ayarlaması yapılarak fermantasyonda 0.41-0.46 g/g verim elde etmişlerdir. C. Shehatae ile gerçekleştirilen etanol üretiminin P. stipitis den daha yüksek verimle elde edildiğini bulmuşlardır.
Ergin ve ark. (2001), yaptığı çalışmada, atık olan şeker pancarı küspesinden etil alkol üretimi yapılmıştır. Selülozik maddeler içeren, kurutulmuş ve öğütülmüş şeker pancarı küspesi öncelikle selülaz enzimi kullanarak 8 saatlik bir hidroliz işlemine tabi tutulmuştur. Sonuç olarak %10 şeker pancarı küspesi %1 enzim kullanılarak hazırlanan alkol üretim ortamında 8 saatlik hidroliz sonucu 13.79 g/l00ml glikoz elde edilmiştir. Fermentasyon sonucu aynı ortamda besin elementleri ilavesi olmadan % 5.92; besin elementi ilavesiyle %6.3 alkol elde edilmiştir.
Nigam (2001), Pichia stipitis ile buğday samanı hemiselülaz hidrolizatından etanol üretimini gerçekleştirmiştir. Etanol verimliliğini ve üretkenliğini sırasıyla 2.4+0.10 ve 5.7+0.24 oranında nötralize hidrolizatı karşılaştırarak arttırmışlardır. Hidrolizattaki asetik asit, furfurallar ve ligninlerin mikrobiyal büyüme ve etanol verimliliğini inhibe ettiğini bulmuşlardır.
Zaldivar ve ark., (2001), Helle ve ark., (2004), Son yıllarda pek çok araştırmacı heksoz ve pentoz şekerleri etanole dönüştürebilen mühendis bakteri ve mayaları çalışmıştır.
Iranmahboob ve ark. (2002), Çeşitli talaş örneklerini kullanarak iki aşamalı asit hidroliz yöntemi sayesinde fermantasyonla şekerin etil alkole dönüşümünü sağlamışlardır. Dekstroz verimliliğini etkileyen faktörlerin asit konsantrasyonu ve ısı olduğunun farkına vararak, 2 saatlik ısınma süresiyle %26’lık sülfürik asit konsantrasyonunda en yüksek verimi elde etmişlerdir.
Galbe ve Zacchi (2002), Hemiselüloz ve selüloz hidrolizi üzerine odaklı yumuşak odunlardan etanol üretimi için şu an ki teknolojinin durumu ile ilgili çalışma yapmışlardır. Asit hidrolizi, enzimatik hidroliz öncesi ön muamele, enzimatik hidroliz ve fermantasyon, etil alkolün ekonomisi ve gelişiminin geleceği hakkında bilgiler verilmiştir.
Sun ve Cheng (2002), Etanol üretimi için lignoselülozik materyallerin hidrolizinde yapılabilecek işlemler hakkında bir çalışma yapmışlardır. Lignoselülozik materyallerin ön muamelesi, selülozun enzimatik hidrolizi, enzimatik hidrolizi etkileyen faktörler ve etanol endüstrisinin geleceği hakkında bilgiler verilmiştir.
Ratnam ve ark. (2003), Sıcaklık, pH ve fermantasyon zamanının kalitatif etkilerini Zymomonas mobilis ve glucoamylase (AMG) ile sago nişastasından etanol fermantasyonu ve sakkarafikasyonu (SSF) üzerine incelemişlerdir.
Sakkarafikasyon ve fermantasyon sürecini serbest enzim ve serbest hücreleri kullanarak çalışmışlar ve 140 g/l lik nişasta konsantrasyonunu kullanarak maksimum
70.68 g/l lik ethanol konsantrasyonunu elde etmişlerdir. Verimlilik için optimum şartların 36.74 0C, pH 5.02 ve fermantasyon süresinin 17 saat olduğunu bulmuşlardır.
Yu ve Zhang (2004), Selülozik pirolizatın glukoza ve fermantasyonunun etanole dönüşümü için asit hidrolizini incelemişler. Maksimum % 17.4 glukoz verimini 1210C, 20 dakikada otoklav kullanarak, 0.2 mol/l sülfirik asit hidrolizi ile elde etmişlerdir. 31.6 g/l glukoz içeren hidrolizat ortamının Saccharomyces cerevisiae ile gerçekleştirilen fermantasyon sonucu 24 saat sonra 14.2 g/l etanol verdiğini, ancak 31.6 g/l saf glukozun 18 saat sonra 13.7 g/l etanol verdiğini bulmuşlardır. Sonuçlar asit-hidrolizat pirolizatının etanol üretimi için kullanılabileceğini göstermiştir.
Senthilkumar ve Gunasekaran (2005), Farklı mikroorganizmalar kullanarak E.coli, Klebsiella oxytoca, Zymomonas mobilis, Clostridium cellulolyticum, Lactobacillus casei ve birkaç maya suşları ile selülozik substratlardan etanol üretimini gerçekleştirmişlerdir.
Gaspar ve ark. (2007), Hemiselüloz ve etanol üretimi için hammadde olarak mısır lifini kullanmışlardır. Çalışmalarında mısır lifinin etanole ve diğer ürünlere dönüşümünü incelemişlerdir. Nişastasız mısır lifi farklı alkalin solüsyonları kullanarak ön muameleden geçirilmiştir. Çoğunlukla selüloz içeren materyal selülozik enzimlerle hidroliz edilmiş ve Saccharomyces cerevisiae ile etanol içerisinde fermente edilmiştir.
Balat ve ark. (2008), Biyoetanol elde etme sürecindeki ilerlemeleri (ön muamele işlemleri, hidroliz, fermantasyon), biyoetanolün yakıt özelliklerini, biyoetanol üretimi için kullanılabilecek olan hammaddeleri (sükroz içerikli, nişastalı hammaddeler ve lignoselülozik biyokütle) incelemişlerdir.
Tozluoğlu ve ark. (2009), Tarımsal atık bileşenlerinden (yıllık bitkilerden) kimyasal ve enerji üretiminde faydalanma konusunda benzer literatürleri inceleyerek değerlendirme yapmışlardır.
Laopaiboon ve ark. (2009), Yüksek yerçekimi teknolojisini kullanarak, fermantasyon ve çeşitli karbon ve nitrojen kaynakları altında Saccharomyces cerevisiae ile etanol üretimini araştırmışlardır.
Ma ve ark. (2009), Steril olmayan fermantasyon altında mutfak atığından etanol üretimini başarmak amacıyla, aside toleranslı Zymomonas mobilis seçilmiş ve fermantasyon sisteminde uygulamışlardır. Bu yöntemle etanol üretiminin mümkün olduğunu kanıtlamışlardır.
Distile atığın kullanımı ile aside tolere bakterinin kullanımının etanol verimini artırabileceği, enerji tasarrufu ve etanol üretim maliyetinin azaltılabileceği ile ilişkili olduğu düşünülmüştür.
Hamelinck ve ark. (2005), Lignoselülozik biyokütleden etanolün kısa, orta ve uzun dönem tekno-ekonomik performansı hakkında inceleme yapmışlardır. Onların teknik performansları analiz edilmiş ve sonuçlar ekonomik değerlendirmeler için kullanılmıştır. Biyokütleden etanole dönüşüm için seyreltik asit hidrolizine dayalı olan şu anki mevcut teknoloji yaklaşık %35 etkinliğe sahip olduğunu ve tüm verimliliğin %60 olduğunu tespit etmişlerdir. Biyoteknolojideki ilerlemeler ve ön muameledeki gelişimler, özellikle kombinasyon süreci boyunca %48 etanol etkinliği getirebileceğini ve tüm etkinliğin %68 olduğunu vurgulamışlardır. 5 kat daha büyük etanol tesislerindeki gelecek teknolojinin 900 k€/kWHHV yatırımlar getirebilceğini düşünmüşlerdir.
3. MATERYAL ve METOD
3.1. Materyal
Bu çalışmada mikroorganizmaların substrat olarak kullanılmaları için aşağıdaki biyokütle kaynakları seçilmiştir.
3.1.1. Biyokütle
Gürgen Talaşı (Hızar Talaşı) Kavak Talaşı
Çam Talaşı
Bu üç farklı biyokütlenin tercih edilmesinin nedenleri şu şekilde sıralanabilir. a. Yeterince bol bulunması
b. Maddi açıdan oldukça ucuz olması
c. Bu şekliyle ekonomik değere sahip olmaması
d. Karbonhidrat içeriği bakımından oldukça zengin olması
3.1.2. Kullanılan Besi Yerleri
3.1.2.1. Bakteriler İçin Genel Besi Ortamı Glikoz 1.0 g Maya ekstraktı 0.5 g CaCO3 1.0 g
İz element Çözeltisi 2.0 g Agar-Agar 15.0 g Su 1000 ml pH 7.0-7.2
3.1.2.2. Mayalar İçin Genel Besi Ortamı
YPG Medium 10 g yeast ekstrakt 20 g pepton 20 g agar
Toplam hacim 600 ml olana kadar ddH2O
Ayrı bir erlende -30 ml Gliserol -370 ml H2O
Sterilizasyon uygulaması, 20 dk otoklavlama
Birleştirme ve petrilere dökme.
YPD Medium 10 g yeast ekstrakt 20 g pepton 20 g glukoz 20 g agar 1 lt ye tamamlanacak kadar dd H2O
YPM Medium Distile su 1 lt Agar 12 g Mannitol 25 g Pepton 3 g Yeast ekstrakt 5 g Fermantasyon Medium Karbonhidrat kaynağı……….. 100-250 g Yeast Ekstrakt………..10 g Distile su………..1 lt pH………...6.5 3.1.3. Mikroorganizmaların İzolasyonu
Tokat İli, Zile İlçesi’nde yetişen üzüm bağlarından toplanan 7 farklı üzüm meyvesinin yüzeyleri FTS ile yıkanarak örnekler alınmıştır. Bu üzümler çeşitleri sırasıyla; öküz gözü (iri siyah üzüm), taş kara (küçük taneli siyah üzüm), güzel üzüm (yeşil üzüm), misket (yeşil üzüm), narenciye (yeşil üzüm), kömüş ciciği (siyah üzüm), kadın parmağı (yeşil üzüm)’dır. Materyal ve metod kısmında seçilmiş olan besi ortamları kullanılarak mikrobiyal izolasyonlar yapılmıştır. Yapılan izolasyon çalışmaları neticesinde ortaya çıkan mikroorganizmalar içerisinden maya ve bakteri suşları tercih edilmiştir.
Şekil 3.1. Tokat’ın Zile ilçesindeki üzüm bağlarından toplanan iri siyah üzüm (öküzgözü) örneği
Şekil 3.2. Tokat’ın Zile ilçesindeki üzüm bağlarından toplanan küçük siyah üzüm (taş kara) örneği
Şekil 3.3. Tokat’ın Zile ilçesindeki üzüm bağlarından toplanan küçük siyah üzüm (taşkara) örneği genel görüntüsü
Şekil 3.4. Tokat’ın Zile ilçesindeki üzüm bağlarından toplanan yeşil üzüm (güzel üzüm) örneği
Şekil 3.5. Tokat’ın Zile ilçesindeki üzüm bağlarından toplanan yeşil üzüm (misket) örneği
Şekil 3.6. Tokat’ın Zile ilçesindeki üzüm bağlarından toplanan yeşil üzüm (narenciye) örneği
Şekil 3.7. Tokat’ın Zile ilçesindeki üzüm bağlarından toplanan siyah üzüm (kömüş ciciği) örneği
Şekil 3.8. Tokat’ın Zile ilçesindeki üzüm bağlarından toplanan yeşil üzüm (kadın parmağı) örneği
3.1.4. Mikroorganizmaların Yağ Asidi Metil Esterlerinin Saflaştırılmasında Kullanılan Çözeltiler
Çözelti 1 : Saponification (Hücre parçalayıcı)
Sodyum hidroksit (ACS grade) 45 g Metil alkol (HPLC grade) 150 ml Saf su 150 ml
Önce metil alkol ve su, 1 lt’lik renkli çözelti şişesine ilave edilir, daha sonra katı formundaki sodyum hidroksit eklenip iyice çözülünceye kadar
karıştırılır.
Çözelti 2 : Methylation (metilasyon=metilleştirme)
Hidroklorik asit (6.00 N) 325 ml Metil alkol (HPLC grade) 275 ml
1 litrelik çözelti şişesine ilave edilip çözülünceye kadar karıştırılır.
Çözelti 3 : Extraction (saflaştırma)
Hekzan (HPLC grade) 200 ml Metil-ter- butil eter (MTBE, HPLC grade) 200 ml MTBE, hekzan ilave edilerek karıştırılır.
1 litrelik renkli çözelti şişesine ilave edilip çözününceye kadar karıştırılır.
Çözelti 4 : Base wash (bazik yıkama)
Sodyum hidroksit (ACS grade) 10.8 g Saf su (Deiyonize) 900 ml
1 litrelik renkli çözelti şişesine katı formdaki sodyum hidroksit su içerisinde iyice çözününceye kadar karıştırılır.
Şekil 3.9. Yağ asidi analizinde kullanılan çözeltiler
Şekil 3.11. Çalkalama sonrası tüplerde oluşan faz
3.2. Metod
3.2.1. Mikroorganizmaların Seçimi
Tokat İli, Zile İlçesi’nde yetişen üzüm bağlarından toplanan üzüm meyvelerinin yüzeyleri FTS ile yıkanarak örnekler alınmıştır. Elde edilen bu solüsyonlardan materyal kısmında değinilen katı besiyerlerine ekimleri yapılarak izolasyon ve saflaştırma işlemleri gerçekleştirilmiştir. İzolasyonlar sonucunda elde edilen mikrobiyal izolatlar (bakteriler ve mayalar) saflaştırılarak fermantasyonda kullanılmak üzere stok kültüre alınmıştır. Başlangıçta bu izolatların identifikasyonları yapılmadığı için herhangi bir isim verilmemiştir. Çünkü bu bir survey çalışmasıdır. Her organizmanın tanılanmasının yerine fermantasyon prosesinde etkili olanların tanılanması amaçlanmaktadır. Bu şekilde bir yolu izlenmesi gereksiz harcamaların önüne geçmek için yapılmaktadır. Bu çalışma sonucu elde edilen mikrobiyal izolatlar içerisinden hedef olarak seçilenler biyoetanol üretiminde kullanılacaktır.
3.2.2. Biyoetanol üretiminde kullanılacak hammaddeler
Biyoetanol 3 temel ham maddeden üretilebilmektedir:
Şeker Bazlı Hammaddeler (Şeker kamışı, şeker pancarı)
Nişasta Bazlı Hammaddeler (Hububat: mısır, buğday, arpa soya fasulyesi, patates…vb.) Selüloz ve Hemiselüloz Bazlı Hammaddeler (odun, saman…vb.)
Biyokütleyi oluşturan polisakkaritlerin (selüloz, polyazlar) şekerlere hidrolizi sakkarafikasyon yöntemlerinin temelini oluşturmaktadır. Sakkarafikasyon işleminin ana ürünü selüloz ve kısmen mannandan elde edilen glukozdur (Fengel and Wegener, 1984). Çalışmamızda kullanılacak olan ham madde selüloz ve hemiselüloz bazlı maddeler (odun, saman…vb.) olarak seçilmiştir. Seçtiğimiz hammaddeler Pinus sylvester, Carpinus betulus ve Populus canadensis ağaçlarının talaşları olarak belirlenmiştir. Kullanılacak olan talaş örnekleri bu aşamadan itibaren asit hidrolizine maruz bırakılmıştır. Sakkarafikasyon işlemlerinde kullanılan kimyasallar daha çok sülfürik ve hidroklorik asit olarak belirlenmiştir (Tozluoğlu ve ark., 2009). Bu çalışmada % 5 ve % 10’luk sülfürik asit çözeltisi kullanılmıştır.
3.2.3. Kültür Ortamının Hazırlanması
3.2.3.1. Bakteriler İçin Genel Besi Ortamının Hazırlanması
1 g glukoz, 0.5 g maya ekstraktı, 1 g CaCO3, 50 g standart tuz çözeltisi, 2 g iz element çözeltisi, 15
g agar, 1000 ml H2O, pH 7-7.2 olarak hazırlanıp otoklavlanmıştır.
3.2.3.2. Nurient Agar Besi Yerinin Hazırlanması
İnhibitör ve indikatör içermeyen, çok amaçlı kullanımı olan genel besi yeridir.
Dehidre besi yeri 20,0 g/L olacak şekilde damıtık su içinde ısıtılarak eritilip, otoklavda 121 oC de 15 dakika sterilize edilmiş ve 45-50 oC sıcaklığa geldiğinde steril petri kutularına 20'şer ml dökülmüştür. Hazırlanmış besi yeri berrak ve sarımsı kahve renkte olup, 25 °C de pH'sı 7,0±0,2'dir
3.2.3.3. Müller Hinton Besi Yerinin Hazırlanması
Müller-Hinton besi yeri, antibiyotik duyarlılık deneylerinde tercih edilen bir besi yeridir. Dehidre besi yeri, 34,0 g/L konsantrasyonda damıtık su içinde ısıtılarak eritilmiş, otoklavda 115 oC'da 10 dakika sterilize edilip, steril Petri kutularına 20'şer mL dökülmüştür. Besiyeri berrak, menevişli (yanar-döner) ve sarımsı kahverengindedir. 25 oC'da, pH 7,4±0,2'dir (Müller ve Hinton, 1942).
3.2.3.4. Brain Heart Infusion Agar Besi Yerinin Hazırlanması
Dehidre besiyeri 52,0 g/L olacak şekilde damıtık su içinde ısıtılarak eritilmiş, otoklavda 121 oC'da 15 dakika sterilize edilmiş ve steril Petri kutularına 20'şer mL dökülmüştür. Sterilizasyon sonrası 25 oC de pH'sı 7,4±0,2'dir. Hazırlanmış besi yeri berrak ve bazen hafif opalesent (meneviş, yanar döner) ve kahverengidir (Anonim, 1998).
3.2.3.5. Mayalar İçin Genel Besi Ortamının Hazırlanması
3.2.3.5.1. Yeast Pepton Glukoz Agar (YPG)
10 g yeast ekstrakt, 20 g pepton, 20 g agar, toplam hacim 600 ml olana kadar ddH2O ilave edilmiştir. Ayrı bir erlende 30 ml gliserol, 370 ml H2O hazırlanıp, 20 dk otaklavlanmıştır. Otoklavlama işleminden sonra iki ayrı erlendeki karışımlar birleştirilerek petrilere dökülmüştür.
3.2.3.5.2. Yeast Pepton Dekstroz Agar (YPD)
10 g yeast ekstrakt, 20 g pepton, 20 g glukoz, 20 g agar konularak 1 lt’ye tamamlanacak kadar ddH2O ilave edilerek otoklavlanıp, petrilere dökülmüştür.
3.2.3.5.3. Yeast Pepton Mannitol Agar (YPM)
12 g agar, 25 g mannitol, 3 g pepton, 5 g yeast ekstrakt ve 1000 ml distile H2O ilave edilerek otaklavlanıp, petrilere dökülmüştür.
3.2.3.6. Fermantasyon Ortamının Hazırlanması
Nötralize edilmiş ve dietil eter ekstraksiyonunun sulu fazından alınan sakkarafikasyon örneğimizden 200 ml (biyokütle), 10 g yeast ekstrakt ilave edilerek pH’sı 6.5’a ayarlanmıştır (Ratnam ve ark., 2003). Çalışmamızda 500 ml’lik erlenlerde 200 ml’lik mediumlar hazırlanmıştır. Nötralizasyon aşamasından sonra elde ettiğimiz 200 ml sulu şeker çözeltisine 2 g yeast ekstrakt tartılarak pH kontrolü yapılmış ve fermantasyona hazır hale getirilmiştir.
3.2.4. Sakkarafikasyon
Birinci aşama hemiselüloz hidrolizi için daha optimum koşullar altında meydana gelirken ikinci aşama daha dayanıklı selülozu hidroliz etmek için optimize edilmektedir. Biyokütle:H2SO4 1/5’lik oranı kullanılarak iki aşamalı hidroliz işlemi gerçekleştirilmiştir. İlk adımda 170-190 0C de % 10’luk H2SO4 (konsantre asit) kullanılarak 1 saat Pasteur fırınında bekletilmiştir. Biyokütledeki ligninleri uzaklaştırıp hemiselülozu parçalamak için yapılır (Şekil 3.14). İkinci adımda ise, 200-230 0C de %5’lik H
2SO4 (seyreltik asit)kullanılarak 2 saat Pasteur fırınında bekletilmiştir. Bu aşamada ise, biyokütlenin selülozunu hidrolize etmek için uygulanmaktadır (Yu ve Zhang, 2004; Tozluoğlu ve ark., 2009).
Şekil 3.14. Biyokütlenin sakkarafikasyon aşaması
3.2.5. Nötralizasyon
için hazır hale getirilmesi gerekmektedir. Fermentasyon ortamında kullanılan mikroorganizmanın yaşayabilmesi için optimum pH’sının ayarlanması gerekmektedir. Bunun için 500 ml lik hazırlanan karışımımıza (biyokütle + H2SO4), 200 g CaCO3 ilavesi ile birlikte 200 ml H2O ilave edilerek pH 6.5’a ayarlanmıştır. Nötralizasyon işlemi tamamlandıktan sonra elde ettiğimiz karışım vakum pompası yardımı ile katı ve sıvı faz olarak birbirinden ayrılmıştır (Şekil 3.17). Katı faz atılarak, sulu faz fermantasyon mediumda kullanılmak üzere hazır hale getirilmiş ve nötralizasyon tamamlanmıştır (Ratnam ve ark., 2003).
Şekil 3.15. Nötralizasyon işlemi
Şekil 3.17. Vakumlama
3.2.6. Antron Testi
Sakkarafikasyon sonucunda elde edilen sıvı nötralizasyon işlemine alınmıştır. Nötralizasyon işlemi sonunda elde edilen sıvı içerisinde glukoz varlığının anlaşılabilmesi için uygulanan bir yöntemdir. Toz halindeki kimyasal madde (antron), 5 ml sülfürik asit çözeltisi için 0.01 g tartılarak hazırlanır. Nötralize edilmiş (pH 6.5) sakkarafikasyon numunesinden plastik pastör pipeti ile alınarak cam tüpteki antron çözeltisi içerisine bir miktar damlatılarak renk değimi gözlemlenmiştir. Tüp içerisinde yeşil rengin oluşması ortamda glukoz’un varlığını göstermektedir. Bunu dışındaki renk oluşumlarında ise glukoz varlığının olmadığını ortaya koymuştur.
3.2.7. Dietil Eter Muamelesi
Nötralizasyon işlemi tamamlandıktan sonra elde edilen sıvı ayırma hunisi kullanılarak 3 aşamada ekstraksiyon işlemleri gerçekleştirilmiştir. Ekstraksiyon işlemi sonrasında ayırma hunisinde 2 farklı faz oluşmuştur (Şekil 3.18). Deneylerde sadece alt faz kullanılmış, şeker asitleri, furfurallar ve çüzünebilen lignin gibi maddelerin bulunduğu üst faz ise ayrı bir toplama kabında biriktirilmiştir (Nigam, 2001).
Şekil 3.18. Dietil eter muamelesi 3.2.8. Fermantasyon
İncelenecek bakterinin üreyebileceği besiyerinin terkibinde sadece asit hidrolizi, nötralizasyon ve dietil eter ekstraksiyon aşamalarından geçmiş olan biyokütleye ait sıvı, maya ekstraktı ve denenecek olan mikroorganizmanın bulunduğu karışımda biyoetanolün oluşup oluşmadığının izlenmesi ile gerçekleşir. Burada dikkat edilecek nokta besiyeri içerisinde denenecek şekerden başka karbonhidrat bulunmaması gerektiğidir. Böylece mikroorganizma, ortamdaki yegane karbonhidratı kullanmaya zorlanır. Mikroorganizmalar karbonhidratın türüne göre laktik asit, süksinik asit, asetik asit ve formik asit oluşturabilirler. Hidroliz süreci biyokütlenin selülozlu kısmını zayıflatıp etonole dönüştürmek üzere fermente edilebilir hale getirmiştir. Saf mikroorganizma kültürüne ait koloniden bir öze dolusu alınıp, mikroorganizma için uygun olan ve içerisinde sadece biyokütle örneği bulunan besiyerine (Fermantasyon medium) ekilir. Fermantasyonun gerçekleşebilmesi için anaerobik bir ortamın hazırlanması gerekmektedir. Böyle bir ortamın oluşturulabilmesi için 2.5 lt ‘lik anaerobik jarların (Merck) ve anaerobik ortamın oluşturulması için AnaeroGen (Oxoid) paketleri kullanılmıştır. Mikroorganizmanın biyoetanole dönüşümünü gerçekleştirmek için fermantasyon ortamı hazırlanmıştır. 10 g yeast extrackt, 1 L distile su, , 50 ml lik hacme 5 ml organizma süspanse edilerek (Wang ve ark., 2009), 300C de 48 h de anaerobik jarlarda inkübasyona bırakılmıştır (Sreenath ve Jeffries, 2000).
Fermantasyon 28-320 C sıcaklıkta 2 gün içinde tamamlanmıştır (Şekil 3.19). Fermantasyonun pozitif yönde ilerlediğini ortaya koyan bir diğer faktör ise ortamda gaz (CO2 ve H2 gibi) kabarcıklarının oluştuğunun kalitatif olarak gözlemlenmesidir.
Şekil 3.19. Fermantasyon
3.2.9. Biyoetanolün Verimlilik Testi
Bu çalışmada biyoetanol’ün eldesinde verimliliği belirlemek için 2 farklı yöntem kullanılmıştır. Bunlar; Fraksiyonel Destilasyon ve NMR ölçüm teknikleri kullanılmıştır. Burada esas olarak izole ettiğimiz mikroorganizmaların anaerobik ve aerobik ortamlarda biyoetanol üretip üretmediğinin belirlenmesi hedef seçilmiştir.
3.2.10. Fraksiyonel Destilaston Prosesi
Elde edilen etanol hala az miktarda su içermektedir. Fraksiyonel destilasyon prosesiyle, etanol-su karışımı kaynatılır. Etanolün kaynama sıcaklığı 780C, suyun ise 1000C dir. Dolayısıyla etanol sudan daha önce kaynama noktasına ulaşıp gaz formuna dönüşür ve tekrar yoğunlaştırılarak sudan tamamen ayrılmış olur (Şekil 3.20). Ayrıştırılmış olan sıvı içerisinde etanolün olup olmadığı kromik asit ve NMR tekniği yardımı ile belirlenmiştir.
Şekil 3.20. Fraksiyonel Destilasyon
3.2.11. Kromik Asit Testi
Bu çözelti için 5 g Na2Cr2O7 veya K2Cr2O7 (Merck 1.04952) 5 mL saf suda çözülür, yavaşça 100 mL derişik sülfürik asit katılır. Sıcaklık bu sırada 70-80°C’ a ulaşır. Karışım yaklaşık 40°C’a soğutulur ve cam kapaklı bir şişeye alınarak saklanır. Bu çözelti başta turuncu renktedir (Anonim, 2008). Aerobik ve anaerobik ortamdaki mikroorganizmaların etanol üretip üretmediğini kontrol etmek için kullanılmıştır. Fermantasyon için mediumlar hazırlanmış ve termoshaker’a yerleştirilip 2 gün boyunca inkübasyona bırakılmıştır. İnkübasyon sonrası elde edilen medium içerisinde etanolün varlığının anlaşılabilmesi için kromik asit çözeltisi kullanılmıştır. Cam tüpler içerisinde kromik asit ile muamele edilen fermantasyon sıvısında yeşil rengin meydana gelmesi ortamda biyoetanolün üretildiği anlamına gelmektedir. Yeşil rengin olması test edilen mikroorganizmanın biyoetanol ürettiğini (Şekil 3.22), olmaması ise biyoetanolün üretilmediğini göstermiştir.
Şekil 3.21. Kromik asit testi
3.2.12. İzole Edilen Mikroorganizmaların Morfolojik ve Biyokimyasal Testleri
İzole edilen mikroorganizmalar çeşitli morfolojik ve biyokimyasal testlere tabi tutulmuştur. Başlıca biyokimyasal testler olarak katalaz, oksidaz ve gram reaksiyon testleri yapılmıştır. Morfolojik testler mikroorganizmanın koloni renkleri (beyaz, sarı, kirli beyaz vb.), koloni şekilleri (düz, pürüzlü, yuvarlak, mukoid gibi), hareketlilik ve bakteri şekilleri (kok, basil, kokobasil) mikroskop altında incelenmiştir.
3.2.12.1. Katalaz Testi
Bir organizmanın katalaz enziminin olup olmadığını anlamak için yapılan testtir. Belirlenmek istenen bakteri bir öze ile alınıp boş bir petri kabına konulmuş ve üzerine H2O2 (Hidrojen peroksit) damlatılmıştır. Damlatıldıktan sonra bakteri numunesi üzerinde birçok hava kabarcıkları oluşuyorsa (tükürük şeklinde) katalaz enzimi taşıyor demektir (Klement ve ark.,1990).
3.2.12.2. Gram Reaksiyon Testi
Önce %3’lük KOH çözeltisi hazırlanır. Petri kabından öze ile alınan herhangi bir bakteri kümesi üzerine (boş bir petri kabında) bir damla KOH damlatılıp karıştırılmıştır. Özeyi bakteri KOH karışımına batırıp çıkardığımızda yukarı doğru bir uzama (sümüksü, yumurta akı gibi) meydana gelirse gram negatif, eğer uzama meydana gelmezse gram pozitif demektir. Buradaki uzamanın nedeni %3’lük KOH çözeltisi bakterinin hücre duvarını ve zarını parçalayarak hücrenin sitoplazmasının dışarı çıkmasına neden olur. Gram- bakterilerin KOH ile muamelesi sonucu, hücre duvarının parçalanması ile sitoplazma ve nikleer materyalin açığa çıkması nedeniyle bir viskoz yapının oluştuğu bilinmektedir (Fahy ve Hayward, 1983).
3.2.12.3. Oksidaz Testi
diskler geliştirilmiştir. Boş bir petri kabına konulup disklere dışarıya taşırmadan bolca su emdirilmiştir. Diskler yeterince su emdikten sonra öze ile bakteri kümesi su emdirilmiş diskin üzerine bırakılıp 1 dk bekletilmiştir. Diskin üzerinde koyu mavi veya lacivert bir renk oluşursa bu bakteri sitokrom c enzimini taşıyor demektir (Kovacs, 1956).
3.2.13. Mikroorganizmaların Yağ Asidi Analizi
7 farklı üzüm örneğinden izole edilen mikroorganizmalardan seçilmiş 21 hedef mikroorganizmanın teşhisi için Atatürk Üniversitesinde bulunan GC tekniğinden faydalanılmıştır. Mikroorganizmalarımızın teşhisi için laboratuarımızda, organizmaların yağ asitleri hazırlanarak tür tayinlerinin yapılması için hazır hale getirilmiştir. Hazırlanan 4 farklı çözelti kullanılarak aşağıda belirtilen yöntem ile aerobik bakterilerden yağ asidi metil esterlerinin saflaştırılması analizi ve GC’e verilinceye kadar izlenen yol (Karaman, 2005);
1- Steril bir öze ile test edilecek aerobik bakterinin tek bir kolonisinden, TSA katı besiyerine 4 fazlı çizgi ekim yapılır. Her bir petri silinmeyecek şekilde etiketlendirilir.
2- Ekim yapılmış petriler 280C de 24 h süre ile inkübasyona bırakılırlar. Klinik aerobik bakteriler 350C de inkübasyona bırakılırlar. Yavaş gelişen bakteriler için 48 h ile inkübasyon yapılabilir.
3- İnkübasyon periyodunu takiben, 4 fazlı çizim yapılmış petrilerin 3 ve 4 numaralı fazlarından canlı bakteri hücreleri steril bir öze ile toplanarak (yaklaşık 40 mg) steril bir cam test tüpüne (5 ml) aktarılır. Test tüpleri etiketlenerek ağızları kapatılır.
4- Her bir test tüpüne 1 ml çözelti 1 ilave edilir ve 5-10 sn çalkalanır, sonra test tüpleri 5 dk süre ile 1000C lik su banyosunda bekletilir. Tekrar 5-10 sn çalkalanan test tüpleri 25 dk süre ile 1000C lik su banyosunda inkübasyona bırakılır. Bu işlem ile canlı hücreler parçalanarak, yağ asitlerinin serbest kalması sağlanır.
5- Test tüplerine 2 ml çözelti 2 (metilasyon) eklenir. 5-10 sn çalkalamadan sonra 800C de 10 dk süre ile su banyosunda bekletilir ve en kısa sürede 10 dk süre ile buz veya soğuk su içerisinde soğutulur. Bu uygulama ile serbest yağ asitlerini ester bağlarına metil eklenmiş olur ve yağ asitlerinden yağ asit metil esterleri elde edilir. Bu durum yağ asitlerine yüksek sıcaklıklarda uçuculuk özelliği kazandırır.
6- Soğutulmuş tüplere 2.5 ml çözelti 3 (saflaştırma) eklenir ve 10 dk süre ile çalkalayıcı ile çalkalanır. Bu aşamada tüp içerisinde 2 ayrı faz oluşur. Bu tüplerin alt kısmında asidik, üst kısmında da organik sıvı fazlar oluşur. Yağ asit metil esterleri asidik fazdan ayrışarak organik faz bölgesinde toplanır. Bu nedenle pastör pipeti kullanarak tüplerin alt kısmındaki asidik faz atılır ve organik faz muhafaza edilir.
7- En son aşamada her tüpe 3 ml çözelti 4 (bazik yıkama) ilave edilip, 5 dk süre ile çalkalandıktan sonra 10 dk süre ile oda sıcaklığında bekletilir. Çözelti 4, bazik bir çözelti olup serbest yağ asit metil esterlerini daha saf olarak elde etmemize yardımcı olur. Tüp içerisinde yine 2 ayrı faz oluşur. Üst fazda toplanan ve yağ asit metil esterleri içeren faz, pastör pipeti ile alınarak 2 ml gaz kromatografisi tüplerine transfer edilir. Burada, üst fazdan alma işlemi yapılırken alt fazdan kesinlikle alınmaması gerekmektedir. Dikkat edilmez, alınırsa yağ asidi esterlerinin saflığı bozulmakta ve cihaz yanlış okuma yapmakta veya hata vermektedir. Ağızları sıkıca kapatılan bu tüpler GC cihazı üzerindeki örnek depolama aparatına yerleştirilir. Daha sonra cihaz çalıştırılarak, sistem kılavuzunda belirtildiği gibi örnekler tek tek analiz edilip tanı sonuçları alınmıştır.
