Model Organizmalar Yazı Serisi - 1 Drosophila Genetiği ve Kullanım Alanları
İrem DoğruoğluY., Emre Can BuluzE.
Genel olarak meyve sineği adı ile bilinen Drosophila melanogaster, genetik ve daha birçok alanda en yaygın kullanılan model organizmalardan biridir. Drosophila genetiği ile yapılan araştırmalarda; hücre ve gelişim biyolojisi, nörobiyoloji ve davranış, moleküler biyoloji, evrimsel ve popülasyon genetiği ve diğer alanlar etkileyici ilerlemelere tanık olmuştur. Diğer model organizmalardan daha fazla doku türü ve çeşitli gözlemlenebilir davranışlarla ve cins içindeki birçok tür için mevcut olan geniş genom verileriyle, sineğin izlenebilir karmaşıklığı, karmaşık gelişim programlarının mekanizmalarını keşfetmek için heyecan verici fırsatlar sağlamaya devam etmektedir1,2.
Drosophila'nın laboratuvarda belgelenen ilk kullanımı, 1901'de Harvard Üniversitesi’nden William Castle'ın ekibi tarafından yapılmıştır.
Fakat Drosophila genetiği araştırmalarının temel ismi Thomas Hunt Morgan olarak bilinmektedir. Morgan, genleri tanımlamak ve kromozomlarda bulunduğunu tespit etmek için
Drosophila kullanarak Gregor Mendel tarafından önerilen kalıtım teorisini büyük ölçüde rafine etmiştir ve 1933'te kromozomun kalıtımda oynadığı rolle ilgili keşifleri için Nobel Fizyoloji ve Tıp Ödülü'nü kazanmıştır.
Drosophila genetiğini, 100 yıldan fazla bir süre önce Morgan'ın deneylerine dayanan biyolojiyi anlamak için bir araç olarak kullanmanın uzun bir geçmişi olmuştur. Tüm Drosophila genlerine genom dizisinin ek açıklaması sırasında bir
“CG numarası” verilmiştir fakat hala bir CG numarası ile anılan bilinen mutasyon veya ortologları olmayan birçok karakteristik olmayan gen vardır. Morgan'la çalışan araştırmacılardan biri olan Hermann Muller, 1946'da X-ışını yoluyla mutasyon üretiminin keşfi için Nobel Fizyoloji ve Tıp Ödülü'nü kazanmıştır. 1920'lerde Drosophila'yı kullanan Muller, X-ışınlarının genlerdeki mutasyon hızında büyük bir artışa neden olduğunu ve kromozomları kırabildiğini keşfetmiştir.
Böylece, radyasyonun maruz kalan insanların yavrularında zararlı genetik kusurlara neden olduğunun farkına varılmasını sağlamıştır2,3.
Şekil 1. Drosophila melanogaster'da Yetişkin Üreme Dormansisine Etki Eden Faktörler. Farklı sıcaklıklar ve kısa gün süreleri ile kaynaklanan genetik değişimlere yanıt olarak, bazı D. melanogaster popülasyonları, yetişkin üreme dormansisinde dişilerde yumurtalıkta küçülme veya erkeklerde spermatogenezin durmasına yol açmaktadır4.
Drosophila’nın Yaşadığı Bölgeler
Drosophila’lar, Antarktika hariç tüm kıtalarda yaşayabilen bir cinstir. Yaklaşık 15.000 yıl önce D. melanogaster, Güney Sahra altı Afrika'daki atalarının menzilinden Avrupa'ya göç edip, daha sonra dünyanın geri kalanının çoğunu kolonize etmiştir. 2000'den fazla tarif edilen Drosophila türü vardır ve bununla birlikte, bu türlerin çoğu arasındaki filogenetik ilişkiler üzerine çalışmalar yürütülmektedir.
Yaklaşık iki düzine Drosophila türü, melanogaster'ın en temel genom dizilerine ve çok çeşitli ekolojik habitatlarına, yaşam tarihi özelliklerini ve evrimsel sapma zamanlarını kapsamaktadır (Şekil 2.). Bu izlenebilir karmaşıklık, Drosophila'yı gen ailesinin evrimi gibi konularda karşılaştırmalı genomik çalışmalar, gen düzenlemesi ve ekolojik adaptasyon için güçlü bir model haline getirmektedir2,5.
Şekil 2. D. melanogaster'ın Dünya Üzerinde Farklı Bölgelerdeki Fenotip Değişiklikleri. Ilıman ve subtropikal/tropikal bölgeleri kapsayan çeşitli kıtalarda ve alt kıtalarda, sinek popülasyonları bileşenlerinde önemli farklılıklar göstermektedir. Böylece, sineklerin fenotiplerinin kısmen de olsa çevre şartlarından etkilendiği açığa çıkmaktadır4.
D. melanogaster’in Yaşam Döngüsü
D. melanogaster ve ilgili türlerin model sistemleri olarak kullanılmasının en büyük avantajı, genetik araştırmalarda çok sayıda yavruların hızlı bir şekilde üretilmesine izin veren özellikle kısa yaşam döngüsüdür (Şekil 3.). D. melanogaster'de döllenmiş bir yumurtadan yetişkine gelişme süreci, ortalama olarak 25°C'de sadece 9-10 gün gerektirmektedir. Bununla birlikte, sıcaklık bu işlemin hızını etkilemede büyük bir faktör olarak yer almaktadır. 18°C'de kültürlenen sinekler yumurtadan yetişkine yaklaşık 19 gün içerisinde ulaşmaktadır. Döllenmeden sonra, embriyogenez 24 saat içinde tamamlanır, ardından her aşama geçişinde bir molting (deri değişimi) olayı ile üç larva aşaması (birinci, ikinci ve üçüncü instar) takip edilmektedir. İlk iki instarın (larvaların, pupa döneminden önceki aşamaları) her biri ortalama 1 gün sürerken, üçüncü instar genellikle 2 gün sürmektedir.
Böylece döllenmeden 5 gün sonra, larva
gelişimi tamamlanır ve hayvanlar, dış larva kütikülünden oluşan sert, koruyucu kitin bazlı bir pupa içinde metamorfoz sürecini gerçekleştirmektedir. Steroid hormonu olan ekdison, Drosophila metamorfozunda büyük öneme sahiptir ve gen ekspresyonunun larvadan yetişkin sinek paternine kaymasına aracılık etmektedir. Drosophila, 4-5 gün boyunca pupa aşamasında kalır, bu sırada larva dokularının çoğu parçalanır ve birçok yetişkin yapı larvalarda bulunan disklerden gelişimini sağlamaktadır. Imaginal diskler, embriyonik ve larva evreleri sırasında gelişen ve daha sonra pupa evreleri sırasında çoğu olgunlaşmış yapıya yol açan dokuya özgü progenitör hücrelere bağlı bir yapıdır. Yetişkin sinekler, eklosion adı verilen bir süreçte pupal vakadan ortaya çıkar ve yaşam döngüsünün tekrarlanmasına izin vererek yaklaşık 8-12 saat içinde cinsel olarak olgunlaşmaktadır.
İnsanlar gibi, yetişkin dokular genellikle Drosophila'da yenilenmez4,6.
Şekil 3. D. melanogaster'ın Yaşam Döngüsü. Şekildeki şişe, sineklerin 25°C' de tutulduğu 9-10 gün içinde tamamlanan yaşam döngüsünün her bir aşamasını göstermektedir. Embriyolar yumurtadan yaklaşık 1 gün sonra yumurtadan çıkar ve 4 günlerini yiyeceklerde larva olarak geçirmektedir. 5. gün civarında, üçüncü instar larvaları, şişenin yüzeyinde pupa yapmak için yiyeceklerden ayrılmaktadır. 5-9.
günler arası metamorfoz meydana gelir ve pupa içindeki koyulaşan kanatlar ile olgunlaşma süreci tamamlanmış olmaktadır6.
Çalışmalarda D. melanogaster'in Kullanım Nedenleri
D. melanogaster'’in kullanımı nispeten ucuz ve bakımı kolay olması nedeniyle araştırmalarda çokça tercih edilmektedir. Ayrıca, laboratuvardaki kullanımları konusunda genellikle çok az kısıtlama vardır. Her dişi sinek, 20 güne kadar günde yaklaşık 100 yumurta bırakabilmektedir. Embriyonun verimli bir yetişkin sineğe dönüşmesi 25°C'de yaklaşık 10 gün sürmektedir. Bu nedenle, gerekirse deneysel bir yaklaşım için çok sayıda embriyo veya sinek üretmek daha kolaydır2.
Başlangıçta D. melanogaster sinekleri yaşam döngülerini sağlayabilmek amacı ile muz püresi içeren şişelerde tutulmuştur ancak günümüzde genellikle su, mısır unu, maya, soya unu, malt özü ve mısır şurubu karışımından yapılan jöle benzeri bir besin içeren şişelerde tutmak sineklerin yaşam döngüsü için en yaygın olanı haline gelmiştir (Şekil 4.). D. melanogaster’leri, bireysel şekilde manipüle etmek gerekirse, karbondioksitte güvenli bir şekilde anestezi altına alınabilmektedir böylece genetik bir hat oluşturmak ve daha fazla alanda çalışmalar kolayca yürütülebilmektedir2,7.
Şekil 4. Drosophila Larva ve Pupalarının, Araştırmalarda Kullanımı İçin Muhafaza Edilmeleri. Şişenin alt tarafında larvaların beslenmesi için gerekli besin yer alırken pupaların gelişimlerini tamamlayabilmeleri için şişenin üst kısmında pamuk konulmaktadır2.
D. melanogaster’in Kullanım Alanları
Drosophila hücre kültürlerinin, kullanımı hem genetik hem de başka alanlardaki araştırmaları olumlu yönde etkilemiştir. En yaygın kullanılan hücre hatları olarak belirlenen Schneider, Kc, CNS ve disk hatları birçok uygulama için tercih olmaya devam etmektedir. Drosophila hücre hatları; biyokimyasal deneyler, transkriptomik, fonksiyonel genomik ve biyomedikal uygulamalar için uygun homojen bir hücre kaynağı sağlamaktadır (Şekil 5.).
RNA interferaz (RNAi) ile yapılacak çalışmalar için uygundurlar ve herhangi bir biyolojik süreç ile ilgili aday genleri veya ilaçları tanımlamada platform görevi görmektedirler. Günümüzde, Drosophila hücre hatları için CRISPR tabanlı fonksiyonel genomik de geliştirilmektedir.
Birçok benzersiz şekilde türetilmiş hücre hattı mevcut olsa da transgenik UAS-GAL4 tabanlı RasV12 onkogen ekspresyonu,
CRISPR-Cas9 düzenleme ve
rekombinasyon aracılı kaset değişimi (RMCE) gibi hücresel genetik teknikleri belirli dokulardan, hücrelerden veya genotiplerden çok daha fazla hücre hattını oluşturulmasına neden olabilmektedir7,8. Bununla birlikte, yeni hatların oluşturma hızı, D. melanogaster hücre kültürleri ile çalışmaya özgü çeşitli faktörler tarafından engellenmektedir. Bu faktörler; tek hücre klonlaması, optimal medya formülasyonları ve yeni doku kaynaklarından veya genotiplerden gelen hücre hatlarını destekleyebilen kültür koşulları olarak sınıflandırılmaktadır7,8.
Şekil 5. Drosophila Sineklerinin, Çeşitli Amaçlarda Embriyonik Formdan Yetişkin Formları. Farklı morfolojilere sahip çoklu Drosophila hücre hatları incelenmektedir. Yuvarlak hücre hatlarında S2-DRSC (A), mbn2 (B), kc167 (C) ve Jüpiter-GFP, Dsas-9 hücreleri (H) görülmektedir. CNS kaynaklı hücre hatları ML-bg3-c2 (D) ve ML-bg2-c2 (İ) farklı morfolojiler göstermektedir. RasV12; wtsRNAi (WRR 1) hücre hattı ile epitel görünüm (E) ve yumurtalıktan türetilmiş OSS (F) hücre hattı da yaygın kullanılan bir hücre hattı olarak belirtilmiştir8 (Images courtesy of Drosophila Genomics Resource Center, Johnny Roberts).
İlk temel D. melanogaster hücre hatları oluşturulduğundan beri, melanogaster hücre hatları sadece in vivo çalışmayı tamamlamakla kalmayıp aynı zamanda temel ve korunmuş biyolojik soruların keşfi için birincil bir araç olarak değerli hale gelmiştir. Örneğin; memeli hücre hatları gibi, bu hücre hatları da yaşlanmanın etkileri olmadan birçok turdan geçebilir, kriyoprezervasyona (embriyo dondurma) tabi tutulabilir ve daha sonra tekrar
kültürlenmek için yeniden
canlandırılabilmektedirler7. Drosophila hücre
kültürü kullanımı in vivo transgenik potansiyel hızlı test uygun biyokimyasal ve hücresel fonksiyonlar için transgenik sinekleri, homojen hücre popülasyonunda bir uyarana anında yanıt takip yeteneğini, genetik manipülasyon için kullanılabilir moleküler ayıraçları, CRISPR- Cas9 düzenleme araçları ve birçok ifade de dahil olmak üzere geniş bir set-hazır etiketli ORF sürecin koleksiyon oluşturmadan önce olan yapıları, kimyasal taramalar ve RNA interferaz (RNAi) için iyi geliştirilmiş protokoller de dahil olmak üzere yüksek verimli
fonksiyonel genomiğe uygunluğu ve farklı hücre hatları için transkriptomiğin oluşmasını sağlamaktadır7,8.
Günümüzde Drosophila Genomik Kaynak Merkezi'nde (DGRC), 150'den fazla benzersiz hücre hattı bulunmaktadır. Bu hücre hatları çoğunlukla diğer Drosophila türlerinden birkaç hat da dahil olmak üzere melanogaster'den türetilmiştir. En yaygın beş D. melanogaster hücre hattı; embriyonik türetilmiş S2R+, S2- DGRC, S2-DRSC, Kc167 ve larva CNS türetilmiş ML-BG3-c2 hücre hatlarıdır.
RasV12 transgen, CRISPR-Cas9 genom düzenleme ve RMCE kullanımı da dahil olmak üzere Drosophila somatik hücre genetiğindeki son gelişmeler, yeni hücre hatlarının sayısını gelecekte artıracaktır7,8.
Drosophila ve İnsan Kanseri Çalışmaları
Çeşitli zorluklara rağmen, sinekler ve insanlar arasındaki anatomik farklılıklar nedeniyle Drosophila kanser modellerin kullanımı, insan kanserlerini düzenleyen bazı temel işlemler kanser kök hücreleri rekabet olarak anlamak için temel öneme sahiptir. Drosophila ve insanlar arasındaki evrimsel fark, ilaç keşfi ve geliştirilmesinde meyve sineğinin kullanımında kesinlikle bir kısıtlamayı temsil etse de fenotipik taramaların, hedeflerin yokluğunda klasik taramalardan kaçacak potansiyel ilaçları tanımlamak için uygun olduğu kanıtlanmıştır.
Drosophila'daki bu sinyal yollarının çoğunun korunması ve bunları genetik olarak kolayca
manipüle etme yeteneği, meyve sineğini kanser biyolojisi alanında incelemek için yararlı bir model organizma haline getirmiştir (Şekil 6.). Memelilerde hücre büyümesini ve istilasını (invazyon) kontrol eden sinyal yollarının çoğu, Drosophila gibi basit bir model organizmada kanser biyolojisini taklit eden modellere modülasyonlarına izin veren sineklerde korunmuş bir fonksiyona sahiptir9,10.
Yetişkin D. melanogaster’lerde bulunan bağırsak dokuları; gıdaların sindirimi, besinlerin emilimi ve enfeksiyona karşı savunma tepkisini kontrol etmek için uzmanlaşmıştır. Böylece bağırsak kanseri araştırmalarında büyük ölçüde katkı sağlamaktadır. D. melanogaster’de bağırsak epiteli, enteroblastlara (EB) veya pre- enteroendokrin hücrelere (pre-EE) farklılaşan bağırsak kök hücreleri (ISCs) tarafından doldurulan ve daha sonra emici enterositlere (EC) veya salgı enteroendokrin hücrelere (EE) farklılaşan bir tabaka olduğu görülmektedir. D. melanogaster bağırsağı ve omurgalıların bağırsağı yapıları arasındaki önemli fizyolojik benzerlikler sayesinde Drosophila yetişkin bağırsak epiteli, sinyal yollarının katkısını incelemek için kullanılmıştır. Günümüzde Drosophila, Kanser Genom Atlası'ndan (TCGA) gelen hastalardan elde edilen verileri kullanarak kolon kanserinin multigenik modellerini oluşturmak için de kullanılmıştır9.
Şekil 6. Drosophila ve İnsan Arasındaki Doku/Organ Benzerliğinin Kanser Araştırmalarıyla Olan İlişkisi. Her renk, Drosophila larva (A) ve yetişkin (B) ve insan (C) arasında fonksiyonel olarak benzer dokuları ve organları göstermektedir. Bu benzerlikler, doku/organ fonksiyonlarını etkileyen kanser de dahil olmak üzere insanlarda görülen çeşitli hastalıklar için Drosophila modellerinin oluşturulmasını sağlamaktadır10.
Meyve sinekleri genetik haritalarının, güçlü rekombinasyon teknikleri ile kombinasyonu bütün bir hayvanda korunmuş onkogenlerin ve tümör baskılayıcı genlerin birincil fonksiyonunun hızlı bir şekilde karakterize edilmesini sağlamıştır. Ek olarak, Drosophila görüntü disklerini kullanan son çalışmalar, epitel tümörlerinde büyümeyi yöneten mekanizmaları ve immün hücrelerin (makrofajlar) tümör kütlesine alınmasında bazı adımlar da dahil olmak üzere lokal TME ve stromal hücrelerle etkileşimlerini araştırmıştır.
Drosophila ayrıca organotipik kanserlerin araştırılmasına önemli bir katkı sunmaktadır.
Çünkü makroskopik seviyedeki belirgin
farklılıklara rağmen organ hücreleri ve fonksiyonel birimler genellikle sırasıyla biyokimyasal ve yapısal seviyelerde iyi korunmaktadır9,10.
Akciğer kanseri en yaygın rastlanan kanser türlerinden biridir ve tedavide kullanılan kemoterapi yöntemi kullanılan standart terapötik strateji kemoterapidir. Çünkü kullanılan diğer tedaviler sadece tümör büyümesini azaltır ve yüksek toksisiteye neden olmaktadır. Günümüzde yapılan çalışmalarda, trakeal ağın tübüler yapısını kullanan yeni bir Drosophila akciğer kanseri modeli geliştirilmiştir ve omurgalıların solunum sistemi ile fonksiyonel ve anatomik olarak
karşılaştırılabilir olarak kabul edilmiştir. Hem Drosophila’larda hem de memelilerde solunum sistemi, komşu hücreler tarafından Bnl/Fgf'lerin salgılanmasına bağlı olan birbirine bağlı dallar tarafından oluşturulmaktadır. İkili bir sistem kullanılarak RasV12, PI3K/AKT sinyalinin negatif bir düzenleyicisi olan PTEN'İ aşağı regüle ederken trakeal hücrelerde ektopik olarak eksprese edilmiştir. Bu modelin başarılı bir şekilde taramalarda çoğalması, akciğerlerdeki tümör hücrelerinin çoğalmasında azalma, trakeal fizyolojik fonksiyonlarında gelişim, kimyasal taramalarda akciğer kanseri için meyve sineği modellerin kullanımının önemini vurgulayarak mümkün çeşitli bileşiklerin belirlenmesi ile sonuçlandı ve onaylanmış kimyasal bileşikler için kullanılmıştır9,10.
Beyin tümörü araştırmalarında da D.
melanogaster sinekleri yaygın olarak kullanılmaktadır. Gliomalar en sık görülen intraserebral tümörlerdir. GBM (Glioblastoma Beyin Tümörü) bunlar arasında en tehlikeli olanıdır ve az sayıda etkili tedavi seçeneği olması nedeni ile hastalar için büyük risk oluşturmaktadır. GBM için GEMMler (genetik araştırmalardaki fare modelleri) tarafından yapılan çalışmalar, EGFR‐PI3K sinyal yolağı dahil olmak üzere gelişim mekanizmalarını ve terapötik direncini ortaya çıkarmıştır. Ancak yeni terapötik stratejiler üretmek son zamanlarda daha zor hale gelmiştir. Bu durumun üstesinden gelmek için, repo‐
GAL4.58 kullanarak aktive edilmiş Drosophila Egfr (dEGFRλ) ve p110 (dp110CAAX)
izoformlarını eksprese ederek GBM genotipini model olarak alan sineklerin transgenleri, insan gliomasını yeniden özetleyen glial proliferasyon, infiltrasyon (ödem birikmesi) ve hücre polaritesi kaybına neden olmuştur. Bu fenotipler; Tor, MYC, CCNG1‐CDKs ve RB‐
E2F yolakları ile benzer özelliklere sahip olması nedeni ile GBM tedavisi için alternatif hedefler olarak belirlenmişlerdir. Bu nedenle, D. melanogaster sinekleri beyin tümörü araştırmalarında ve kanser gelişimindeki sinyal ağlarını netleştirmek için uygun bir platform sunmaktadır10.
Sonuç
Gelecek çalışmalarda D. melanogaster kullanan araştırmacılar, şüphesiz yeni atılımlara yol açacaktır. Drosophila hücre hatları, en temel biyolojik soruların bazılarını ele almak için in vivo genetik yaklaşımlar için tamamlayıcı bir araç olarak ve aynı zamanda yüksek verimli fonksiyonel genomik için sağlam bir araç olarak rol üstlenmiştir. CRISPR tabanlı gen düzenlemesinin artan kullanımı ve hücre hatları oluşturmak için RasV12 yaklaşımı ile yeni hücre hatlarının sayısının artmasına ek olarak, kanser gibi birçok alanda yapılan araştırmalarda D. melanogaster sinekleri, araştırmacıların karşılaştığı temel soruları ele almak için birçok yeni ve yaratıcı şekilde kullanım potansiyeline sahiptir. Drosophila hücre kültürü kullanımı birçok uygulama için benimsenmeye devam ettikçe, araştırmalarda alınan fayda ve verim düzeyi artmaya devam edecektir.
Yue L., Bay Boon-Huat (06.2014) Drosophila melanogaster as a model organism to study nanotoxicity
https://doi.org/10.3109/17435390.2 014.940405
4. Flatt Thomas (01.01.2020) Life- History Evolution and the Genetics of Fitness Components in Drosophila melanogaster https://doi.org/10.1534/genetics.11 9.300160
System
https://doi.org/10.1534/genetics.11 5.183392
7. Barbash Daniel A., Castillo Dean M. (25.10.2017) Moving Speciation Genetics Forward: Modern Techniques Build on Foundational Studies in Drosophila https://doi.org/10.1534/genetics.11 6.187120
00051
10. Yamaruma Ryodai, Oosiho Takako, Sonoshita Masahiro (05.01.2021) Tiny Drosophila makes giant strides in cancer research
https://doi.org/10.1111/cas.14747
