Virüslere dayanıklı
transgenik bitkilerin elde edilmesi
Sebahattin ÖZCAN
Virüslere Dayanıklı Transgenik Bitkilerin Geliştirilmesi
Dünyada tarım alanlarında bakteri, fungus ve virüs hastalıklarının neden olduğu ürün kayıpları her geçen gün artmaktadır.
Bunlardan, virüslerin özellikle tropik ve subtropik bölgeler başta olmak üzere, birçok ülkede ürün kalitesi ve miktarı yönünden zararları ise önemli
boyutlardadır.
Virüs mücadelesinde kullanılan başlıca yöntemler
Kimyasal ilaçlarla zirai mücadele mümkün değildir
Virüslerden ari bitkilerle üretim yapılması (doku kültürü yöntemleri ve termoterapi uygulamaları),
Bulaşık bitkilerin tarım alanlarından uzaklaştırılması,
Virüs taşıyıcı vektörlerle (böcek, nematod vb.) mücadele edilerek bitkiden bitkiye taşınımın önlenmesi,
Çapraz korunma
Moleküler biyoloji teknikleri ile virüslere dayanıklı bitkilerin
elde edilmesi gelmektedir.
Çapraz Korunma
Bu yöntemde, ilgili virüsün daha az zarar yapan bir ırkıyla
(koruyucu virüs) bitki inoküle edilerek, ileriki dönemlerde daha çok zarar yapan ırklara karşı bitkide bir korunma sağlanmaktadır.
Bununla birlikte, koruyucu amaçla inoküle edilen ve bitkide şiddetli semptomların oluşmadığı bu yöntemde semptomların sürekliliği nedeniyle zaman içerisinde ürün kayıplarının
gözlenmesi, yöntemin en önemli dezavantajını oluşturmuştur.
Ayrıca, tarımsal ürünlerde zarar yapan her virüsün az zarar yapan ırkının bulunmamaktadır.
Bir virüsle yapılan enfeksiyonun daha sonraki aynı veya farklı virüslerin ırklarına karşı kesin bir koruma sağlayıp
sağlayamayacağının bilinmemektedir
Bu gibi nedenler çapraz korunma yönteminin uygulanabilirliğini ortadan kaldırmaktadır.
Genetik mühendisliği yöntemleri kullanılarak virüslere tam dayanıklı bitkilerin elde edilmesi
Kılıf Proteini
Antisens RNA
Virüsün Haraketini Sağlayan Proteinler
Replikaz Genleri
Ribozimler
Satelit ve Hasarlı RNA’lar
Gen İnaktivasyonu
Dayanıklılık Genleri
Ribozomları İnaktive Edici Proteinler
Memeli 2’,5’ Oligoadenilat (2-5A) Sistemi
Virüs Proteinlerine Karşı Antikor Kullanımı
Kılıf Proteini
Bitkilerde kılıf proteinine bağlı dayanıklılık sağlamak amacıyla, ilgili virüsün kılıf protein genini içeren yapı, değişik gen aktarım
yöntemleriyle bitkilere aktarılmaktadır.
Aktarılan bu genlerin bir veya birden fazla
kopyasının bitkinin genomik DNA’sıyla rasgele
bütünleşmesi ve ifadesi sonucunda üretilen virüs
kılıf proteini sonuçta bitkileri virüse karşı dayanıklı
kılmaktadır.
Kılıf Proteini
Virüs Kılıf proteinini kodlayan genin bitkilere aktarılması sonucunda bitki hücrelerinde bu gene ait mRNA ve proteinler üretilmektedir.
Üretilen bu mRNA ve proteinlerin çapraz
korunma mekanizmasıyla bitkileri virüslere
karşı dayanıklı kıldığı bildirilmektedir
Kılıf protein
geninin kay. Kılıf protein geninin
aktarıldığı bitki Dayanıklılık sağlanan virüs TMVTMV
TMVTMV AIMVAIMV AIMVTRV TSVCMV PVXPLRV
Tütün Tütün Tütün Domates Tütün Tütün Domates Tütün Tütün Tütün Tütün Patates
TMVToMV, TMGMV CMV, AIMV, SHMV TMV, ToMV
AIMVPVX,CMV AIMVPEBV TSVCMV PVXPLRV
TMV: Tütün mozayik virüsü (tobacco mosaic virus), AIMV: Yonca mozayik virüsü (alfalfa mosaic virus), TRV: Tütün “rattle” virüsü (tobacco rattle virus), TSV: Tütün çizgi virüsü (tobacco streak virus), CMV: Hıyar mozayik virüsü (cucumber mosaic virus), PVX: Patates X virüsü (potato virus X), PLRV: Patates yaprak kıvırcıklığı virüsü (potato leaf roll virus), ToMV:
Domates mozayik virüsü (tomato mosaic virus), TMGMV: Tütün yeşil zayıf mozayik virüsü (tobacco mild green mosaic virus), SHMV: Güneş keneviri mozayik virüsü (sunhemp mosaic virus), PEBV: Bezelye erkenci kahverengilik virüsü (pea early browning virus).
Virüs kılıf protein genlerinin aktarılmasıyla virüslere karşı dayanıklılığın sağlandığı bazı bitkiler
Reavy ve Mayo 1992, Ergül vd. 2002 (Ed: Özcan Vd.)
Antisens RNA
Virüslerin kılıf protein geninin nükleotid dizilerine yönelik antisens RNA’ların oluşturulması ve bunların ifade
düzeylerinin belirlenmesi oluşturmaktadır
Antisens RNA teknolojisi, basit olarak bir mRNA’ya ait cDNA kopyasının tamamlayıcı (komplementer) mRNA dizisi
oluşturmak üzere ilgili genoma aktarılmasıdır.
Tek sarmal antisens RNA’ların tek sarmal viral RNA’lar ile
dupleks oluşturması sonucunda gen ifadesinin veya virüs
replikasyonununun engellendiği düşünülmektedir.
Antisens RNA
Bu konuda yapılan çalışmalarda virüs genlerine karşı oluşturulan antisens yapılarının aktarıldığı transgenik bitkilerde, dayanıklılık oranı genellikle düşük olmaktadır.
Başarının düşük olmasında, çekirdekte oluşturulan antisens transkriptlerinin sitoplazmik replikasyon bölgelerine
taşınamamaları neden gösterilmektedir.
Ancak, başarının düşük olmasına rağmen antisens RNA
uygulamalarının dayanıklılık sağlamak açısından kılıf
proteinine dayalı çalışmalardan daha avantajlı olduğu
bildirilmektedir.
Antisens RNA
Bu teknikle yapılan çalışmalardaki düşük başarı oranı
muhtemelen kullanılan antisens RNA’nın fonksiyonlarına ve üzerinde çalışılan virüs grubuna bağlanmaktadır.
Özellikle, bitki hücresinin hem çekirdeğinde hem de
sitoplazmasında replike olan (çoğalan) RNA virüslerine dayanıklılıkta bu teknik başarısız kalmaktadır.
Buna karşın, sadece floemde bulunan PLVR (Patates Yaprak Kıvırcıklığı Virüsü)’ne yönelik yapılan bir çalışmada ise kılıf protein geninin antisens RNA’sının üretildiği transgenik
patates bitkilerinde, kılıf proteinine bağlı dayanıklılık
yöntemine göre daha başarılı sonuçlar alınmıştır.
Antisens RNA
Bugün birçok bitki virüsünün replikasyonu ve bunlara ait genlerin ifadesi ile ilgili konular tam bilinmediği için antisens yapılarının oluşturulacağı dizileri belirlemekte güçlük çekilmektedir.
Bu yönde sürdürülen çalışmalarda virüslerin replikasyonlarını engellemek amacıyla, bunlara özgü değişik bölgelere homoloji gösteren antisens yapılarının kullanımına gidilmektedir.
Bu amaçla, Day ve ark. (1991) transgenik tütün bitkilerinde virüs replikasyon protein geni AL1’i de içerisine alan bölgeye yönelik antisense RNA oluşturarak domates altınsarısı mozayik virüsü
(tomato golden mosaic virus; TGMV)’ne dayanıklı tütün bitkileri elde etmişlerdir.
Bu çalışmada TGMV’nin enfeksiyonundan sonra semptom oluşma oranı, bu genin değişik bölgelerine yönelik oluşturulan antisens
tiplerine göre değişmekle birlikte önemli ölçüde azalma göstermiştir.
Virüsün Haraketini Sağlayan Proteinler
Virüslere karşı dayanıklı bitkilerin elde edilmesi amacıyla üzerinde durulan diğer bir yaklaşım ise virüs tarafından sentezlenen ve özellikle virüsün hareketinde fonksiyonu olan proteinlerin
kullanılmasıdır.
Bitki hücrelerinde plazmodezmatanın
geçirgenliğini artırarak virüsün sistemik hareketini yani hücreden hücreye geçişini kolaylaştıran bu proteinlere yönelik mutant proteinler oluşturularak virüsün yayılımını önlemek bu çalışmaların
esasını oluşturmaktadır.
Virüsün Haraketini Sağlayan Proteinler
Enfeksiyonda, yani virüsün hücreden hücreye geçişinde etkili olan hareket proteinleri virüs replikasyonu ve kapsüllenmesi için gerekli olmamaktadır.
Transgenik tütün bitkilerinde Lapidot ve ark. (1993) tarafından yapılan çalışmalarda 3., 4. ve 5. amino asitleri eksik olan mutant TMV hareket proteininin (MPA 3-5) virüsün sistemik semptom oluşumunu geciktirdiği belirlenmiştir.
Bu çalışmalarda yapılan gözlemlerde, yalnızca MPA 3-5 proteinini ifade eden transgenik bitkilerde semptom oluşumu durdurulmuştur.
Ayrıca, bu mutant proteinin aynı gruba ait (tobamo grubu) TGMV (Tütün yeşil zayıf mozayik virüsü) ve SHMV (Güneş keneviri mozayik virüsü) virüslerinin yayılımında da azalmalara sebep olduğu belirlenmiştir.
Bu çalışmaların sonucunda; inaktif hareket proteininin üretiminin yapıldığı transgenik bitkilerde, virüs yayılımının azalması hücreden hücreye virüs geçişinin inaktif hareketli protein tarafından engellenmesine
bağlanmaktadır.
Replikaz Genleri
Viral replikaz genlerinin bitki virüslerine dayanıklılık da başarılı bir şekilde kullanılması genetik mühendisliğindeki çalışmaların bir diğer sonucudur.
Bu teknik ilk olarak Golemboski ve ark. (1990) tarafından TMV’ne karşı geliştirilmiştir.
Viral genom RNA’sının 5’ ucuna yakın bir bölge 126 kDa’luk bir proteini kodlarken, aynı bölgeden yine 183 kDa’luk bir proteininde okuması yapılmaktadır.
183 kDa’luk proteini kodlayan bu gen bölgesi 54 kDa’luk bir protein için de açık okuma çerçevesi (open reading frame, ORF) içermektedir.
Ancak, enfekte olmuş dokularda 54 kDa’luk protein bulunmamaktadır.
Golemboski ve ark. (1990), 54 kDa’luk proteini ifade eden transgenik bitkiler kullanarak bu proteinin fonksiyonlarını araştırmışlardır.
54 kDa’luk proteinin kaynağı olan TMV’nün U1 suşu ile yaptıkları enfeksiyonlarda transgenik bitkilerin U1 şuşunun replikasyonuna tamamen dayanıklı oldukları gözlenmiştir.
Kılıf proteini ile sağlanan dayanıklılığın tersine, artırılan inokülasyon
konsantrasyonlarına karşın replikaz aracılığıyla TMV RNA ve TMV virionlarına karşıda dayanıklılık sağlanmıştır.
