GENTAM‹S‹NE DUYARLI STAPHYLOCOCCUS AUREUSSUﬁLARINDAGENTAM‹S‹N‹N B‹YOF‹LM VE KOAGÜLAZ OLUﬁUMUNA ETK‹S‹*

(1)

ÖZET

Klinikte önemli patolojilere neden olabilen Staphylococcus aureus’un patojenitesinde biyofilm ve plazma koagülaz en- zimi oluflturman›n da önemi vard›r. Bu çal›flmada kateter ucundan ayr›flt›r›lm›fl bir klinik sufl (KSA) ile standart bir ATCC 25923 suflunun (SSA), gentamisinin en düflük bask›lay›c› yo¤unluk (M‹K) alt›ndaki ve üstündeki yo¤unluklarda biyofilm ve ba¤l› ve serbest koagülaz oluflturma özellikleri karfl›laflt›r›lm›flt›r. Mikrodilüsyon yöntemi ile gentamisinin M‹K de¤erleri KSA suflu için 4 μg/mL, SSA suflu için M‹K 0.125 μg/mL olarak belirlenmifltir. Kristal viyole yöntemi ile belirlenen biyofilm oluflumunun ve lamda belirlenen ba¤l› koagülaz testinin iki sufl için de M‹K ve alt›ndaki gentamisin yo¤unluklar›nda inhibe edilmedi¤i, M‹K üstündeki yo¤unluklarda ise inhibe edildi¤i saptanm›flt›r. Tüpte serbest koagülaz testinde ise ilk 2 saatte iki suflta da ancak belirli M‹K alt›ndaki yo¤unluklarda inhibisyon görülürken, 4 ve 24 saatte KSA suflunda 2xM‹K’de bile inhibisyon olmam›flt›r. Bu sonuçlara göre; her iki suflta da biyofilm oluflumunu bafllatan genetik ekspresyonun, gentamisinin M‹K yo¤unlu¤unda bile pozitif bulunmas›n›n klinikteki uygulamalarda dikkat edilmesi gereken bir özellik oldu¤u düflünülmüfltür.

Anahtar sözcükler: biyofilm, koagülaz, Staphylococcus aureus SUMMARY

The Effect of Gentamicin on Biofilm Formation and Coagulase Activity in Gentamicin Susceptible Staphylococcus aureus Strains

Staphylococcus aureus is an important pathogen which can cause severe pathologies in clinical practice. The formations of biofilm and coagulase enzyme are important factors of its pathogenesis. In this study, biofilm formation and coagulase activity of a clinical strain (KSA) isolated from catheter and standart ATCC 25923 strain (SSA) were investigated in above and below minimum inhibitor concentrations (MIC) of gentamicin. The MIC values of gentamicin by microdilution method were found to be 4 μg/ mL for KSA strain and 0.125 μg/ mL for SSA strain. Biofilm formations detected by crystal violet method and slide (bound) coagulase tests were not inhibited in both strains by MIC and sub-MIC gentamicin concentrations. On the other hand, at concentrations above the MIC values these two assays were inhibited. Tube (free) coagulase as- say was inhibited at certain sub-MIC concentration at the first two hours, but it was not inhibited at 4 and 24 hours in even 2xMIC concentration. As a result, the genetic expression of biofilm formation even at MIC concentrations seems to be important in clinical practice.

Keywords: biofilm, coagulase, Staphylococcus aureus

GENTAM‹S‹NE DUYARLI STAPHYLOCOCCUS AUREUS SUﬁLARINDA GENTAM‹S‹N‹N B‹YOF‹LM VE KOAGÜLAZ OLUﬁUMUNA ETK‹S‹*

Vahide BAYRAKAL*, Yavuz DO⁄AN**, Hüseyin BASKIN**, ‹.Hakk› BAHAR**

* Dokuz Eylül Üniversitesi Sa¤l›k Bilimleri Enstitüsü, Mikrobiyoloji ve Klinik Mikrobiyoloji Anabilim Dal›, ‹nciralt›,

‹ZM‹R

** Dokuz Eylül Üniversitesi T›p Fakültesi, Mikrobiyoloji ve Klinik Mikrobiyoloji Anabilim Dal›, ‹nciralt›, ‹ZM‹R

Yaz›ﬂma adresi: Hüseyin Bask›n. Dokuz Eylül Üniversitesi T›p Fakültesi, Mikrobiyoloji ve Klinik Mikrobiyoloji Anabilim Dal›,

‹nciralt›, 35340 ‹ZM‹R

Tel.: (0232) 412 45 11, GSM: (0533) 334 31 66 e-posta: huseyin.baskin@deu.edu.tr Al›nd›¤› tarih: 17.05.2007, revizyon kabulü: 27.09.2007

* Bu çal›ﬂman›n bir bölümü, XXXII Türk Mikrobiyoloji Kongresi’nde sunulmuﬂtur (12 -16 Eylül 2006, Antalya) ANKEM Derg 2007;21(3):175-178

175

G‹R‹ﬁ

Mukozal› yüzeylerin normal floralar›nda bulunan Staphylococcus türlerinin özellikle

Staphylococcus aureus’un, sepsis, toksik ﬂok sen- dromu, endokardit, tromboflebit, solunum sistemi infeksiyonlar› gibi birçok infeksiyonda et- ken oldu¤u bilinmektedir.

(2)

Makrofajlar›n ve di¤er ba¤›fl›kl›k sistemi hücrelerinin bakterilere ulaflmas›n› engelleyen mükoid bir yap› olan biyofilmin, bakterinin tutunmas› ve antibiyotik direncinde önemli rolü oldu¤u bilinmektedir. Biyofilmin, antibiyotiklerin geçifline engel olarak dirence uygun ortam haz›rlad›¤› düflünülmektedir^(4,5).

Ekstraselüler bir proenzim olan koagülaz,

“Coagulase-Reacting Factor (CRF)” ile birleﬂip aktif duruma geçerek plazmay› p›ht›laﬂt›r›r.

Staphylococcus türleri için koagülaz, patojen olan ve olmayan sufllar›n ayr›m›nda kullan›lan standart bir belirleyicidir. Patojen stafilokoklarda ba¤l› koagülaz (Kümelefltirici Faktör: KF; Clum- ping Factor) ve serbest koagülaz olmak üzere iki çeflit koagülaz belirlenmifltir. Serbest ve ba¤l›

koagülazlar›n oluﬂma mekanizmalar› farkl›d›r.

Protrombin ve türevleri ile etkileflen serbest ko- agülaz hücre d›fl› bir enzimdir. Hücre yüzeyin- de meydana gelerek serbest b›rak›lmayan KF ile fibrinojen, fibrine dönüflür. Bu dönüflüm ile hücre yüzeyinde fibrin presipitasyonu meydana gelir ve böylece stafilokoklar kümeleflir.

Hücre duvar›n›n yüzeyinde ba¤l› bulunan ba¤l›

koagülaz ise, plazma fibrinojenlerinin a ve b zincirleri ile etkileﬂir^(6,8). Bir virulans faktörü olan koagülaz›n, bakteri yüzeyinin fibrin ile kaplanmas›n› sa¤layarak fagositozu önledi¤i düﬂünülmektedir⁽⁸⁾.

Bu çal›flmada, gentamisinin M‹K, M‹K al- t›ndaki ve üstündeki yo¤unluklar›n›n klinikte önemli patolojilere neden olan S.aureus’un pato- jenite ölçütlerinden olan biyofilm ve koagülaz oluflumlar›na etkileri de¤erlendirilmifltir.

GEREÇ VE YÖNTEM

Çal›flmada kateter ucundan ayr›flt›r›lm›fl bir klinik S.aureus suflu (KSA) ve standart sufl olarak da S.aureus ATCC 25923 suflu (SSA) kullan›lm›flt›r.

Gentamisinin sufllar için en düflük bask›la- y›c› yo¤unluklar› (M‹K de¤erleri) katyon ilaveli MHB’da mikrodilüsyon yöntemi ile CLSI standartlar›na uygun olarak belirlenmifltir. Bakteri süspansiyonlar› McFarland 0.5 (1.5 x 10⁸ hüc- re/mL) bulan›kl›¤›nda haz›rlanm›flt›r. ELISA

mikroplaklar›ndaki kuyucuklara önce 100 μL MHB besiyeri, sonra antibiyotiklerin iki kat di- lüsyonlar› ve son olarak da 100 μL bakteri süs- pansiyonu da¤›t›lm›fl, mikroplaklar 18 saat 37°C’de inkübe edilmifltir⁽³⁾. Gentamisinin M‹K de¤erleri her iki sufl için spektrofotometrik olarak de¤erlendirilmifltir^(1,3).

Biyofilm oluﬂumu kristal viyole boyama yöntemi ile yine ayn› ELISA plaklar›nda, iki ka- t› absorbanslar pozitif kabul edilerek, spektrofotometrik olarak de¤erlendirilmiﬂtir⁽⁹⁾.

Koagülaz aktivitesi getamisinin çeflitli M‹K de¤erleri ile karfl›laflm›fl KSA ve SSA sufllar›ndan örnekler al›narak, ba¤l› koagülaz için lamda (10- 30 saniye) ve serbest koagülaz için tüpte (1, 2, 4 ve 24. saatlerde) de¤erlendirilmifltir⁽²⁾.

Her deney ayn› koﬂullarda, her örnek için üçer kez yinelenmiﬂtir.

BULGULAR

Gentamisinin en düflük bask›lay›c› yo¤unlu¤u (M‹K de¤eri) KSA suflu için 4 μg/mL, SSA suflu için 0.125 μg/mL olarak bulunmufltur.

Her iki suflta biyofilm oluflumu ve lamda koagülaz testi gentamisinin M‹K ve alt›ndaki yo¤unluklar›nda pozitif, M‹K üstü yo¤unlukla- r›nda negatif olarak saptanm›flt›r (Tablo 1 ve 2).

Tüpte koagülaz testi KSA suflunda 1 ve 2 saatte 0.03 μg/mL (1/128 M‹K)’de ve alt›ndaki yo¤unluklarda pozitif bulunurken, 4 ve 24 saatte 2xM‹K, M‹K ve bütün sub-M‹K’larda pozitif sonuç vermifltir. SSA suflunda tüpte koagülaz testi ise 1 saatte 1/4 ve 1/8 M‹K gentamisin yo-

¤unluklar›nda bile negatif; 2 saatte bu yo¤unluklarda pozitif, daha yüksek yo¤unluklarda negatif; 4 ve 24 saatte 2xM‹K ve alt›ndaki yo-

¤unluklarda pozitif, daha yüksek yo¤unluklarda negatif bulunmuﬂtur.

TARTIﬁMA

S.aureus’un patojenitesinde önemli rol oy- nayan biyofilm oluﬂumu ve koagülaz, antibiyotik kullan›m›nda önemli de¤erlendirme önceli¤i taﬂ›maktad›r. S.aureus’un tutunmas›nda koagü-

V. Bayrakal ve ark.

176

(3)

laz›n rolü deneysel olarak gösterilmiﬂ, KF’nün S.aureus endokarditinin patogenezinde önemli bir rol oynad›¤› da belirlenmiﬂtir⁽⁷⁾.

Çal›flmam›zda gentamisine duyarl› iki farkl› S.aureus suflunun biyofilm ve tüpte ko- agülaz oluflumunun inhibe edildi¤i antibiyotik yo¤unluklar›n›n farkl› oldu¤u gösterilmifltir.

Çal›flmam›zda CLSI standartlar›na göre s›- v› mikrodilüsyon yöntemi ile belirlenen gentamisinin M‹K de¤erleri KSA için 4 μg/mL, SSA için 0.125 μg/mL olarak belirlenmifltir. Her iki suflta da biyofilm oluflumu, M‹K de¤erleri birbi- rinden farkl› olsa da, M‹K ve alt›ndaki yo¤unluklarda oluflmufl, M‹K üstü yo¤unluklarda en- gellenmifltir. Bu sonuç biyofilm oluflumunu bafllatan genetik ekspresyonun, her iki suflta da gentamisinin M‹K ve alt›ndaki yo¤unluklar›nda gerçekleflti¤ini düflündürmüfltür.

Lamda koagülaz, ba¤l› koagülaz varl›¤›n›

gösterir. Her iki suflta da ba¤l› koagülaz oluflumunun, yine biyofilm oluflumu gibi M‹K ve al- t›ndaki de¤erlerde pozitif oldu¤u görülmüfltür.

Bu sonuçlar ba¤l› koagülaz oluflumunun, biyofilm oluflumu ile paralel oldu¤unu, uyar›lma mekanizmalar›n›n M‹K ve alt›ndaki yo¤unluklarda fonksiyon görebildi¤ini düflündürmüfltür.

Tüpte yap›lan serbest koagülaz de¤erlen- dirmesinde ise; KSA’da ilk saatte 0.03 μg/mL (1/128 M‹K)’de koagülaz oluflurken, SSA’da ilk saatte denenen en düflük 0.015 μg/mL (1/8 M‹K)’de koagülaz oluflumu gözlenmemifl, 2’inci saatte 0.03 μg/mL’de koagülaz oluflumu belirlenmifltir. KSA suflunda 2’inci saatten önce ko- agülaz ekspresyonun gerçekleflmesi, bu suflun daha önce bu antibiyotik ile karfl›laflm›fl olma- s›ndan kaynaklanabilir.

Klinikte antibiyotik kullan›m›, özellikle biyofilm yapabilen organizmalar için gittikçe daha önemli bir sorun haline gelmektedir. Bu ça- l›ﬂmada bir aminoglikozid olan gentamisinin M‹K ve alt›ndaki de¤erlerinde, biyofilm ve ba¤- l› koagülaz oluﬂumunun inhibe edilmedi¤i, ancak M‹K üstü konsantrasyonlarda inhibe edildi-

¤i; serbest koagülaz›n ise ilk 2 saatte M‹K alt›n-

177

Gentamisine duyarl› Staphylococcus aureus suﬂlar›nda gentamisinin biyofilm ve koagülaz oluﬂumuna etkisi

Tablo 2: Staphylococcus aureus ATCC 25923 suﬂunun (SSA) gentamisin varl›¤›nda biyofilm, tüpte ve lamda koagulasyon oluﬂturmas›.

SSA*

Biyofilm Lamda koagülaz Tüpte koagülaz 1 saat 2 saat 4 saat 24 saat

0.5 μg/mL

4 M‹K - -

- - - -

0.250 μg/mL

2 M‹K - -

- - + +

0.125 μg/mL

M‹K + +

- - + +

0.06 μg/mL 1/2 M‹K

+ +

- - + +

0.03 μg/mL 1/4 M‹K

+ +

- + + +

0.015 μg/mL 1/8 M‹K

+ +

- + + +

* Antibiyotik ile karfl›laflmam›fl fluflta biyofilm ve lamda koagülaz pozitif, tüpte koagülaz 2 saatten itibaren pozitif bulunmufltur.

Tablo 1: Kateter ucundan ayr›flt›r›lm›fl Staphylococcus aureus suflunun (KSA) gentamisin varl›¤›nda biyofilm, tüpte ve lamda koagulasyon oluflturmas›.

KSA*

Biyofilm Lamda koagulaz Tüpte koagülaz 1 saat

2 saat 4 saat 24 saat

8 μg/mL

2 M‹K - -

- - + +

4 μg/mL

M‹K + +

- - + +

2 μg/mL 1/2 M‹K

+ +

- - + +

1 μg/mL 1/4 M‹K

+ +

- - + +

0.5 μg/mL 1/8 M‹K

+ +

- - + +

0.250 μg/mL 1/16 M‹K

+ +

- - + +

0.125 μg/mL 1/32 M‹K

+ +

- - + +

0.06 μg/mL 1/64 M‹K

+ +

- - + +

0.03 μg/mL 1/128 M‹K

+ +

+ + + +

0.015 μg/mL 1/256 M‹K

+ +

+ + + +

* Antibiyotik ile karfl›laflmam›fl fluflta biyofilm ve lamda koagülaz pozitif, tüpte koagülaz 2 saatten itibaren pozitif bulunmufltur.

(4)

daki konsatrasyonlarda inhibe edilebildi¤i, 4 saatte ise 2xM‹K’de bile inhibe edilmedi¤i belirlenmifltir. Biyofilm oluflumu ve koagülaz›n M‹K de¤erlerindeki pozitifli¤inin S.aureus sufllar›n›n patojenitesinde önemli rol oynad›klar› düflünül- dü¤ünde sonuç önemli olabilir kan›s›na var›l- m›flt›r.

Çal›flmalar›m›z S.aureus, Pseudomonas ae- ruginosa gibi biyofilm oluflturabilen bakterilerin, patolojik ekspresyonlar›n›n hangi yolaklar ile ne zaman ve hangi koflullarda olufltu¤unun araflt›r›lmas› yönünde devam etmektedir.

KAYNAKLAR

1. Bask›n H, Do¤an Y, Bahar IH, Yulug N: Effect of subminimal inhibitory concentrations of threee fluroquinolones on adherence of uropathogenic Escherichia coli strains, Int J Antimicrob Agents 2002;19(1):79-82.

2. Bilgehan H: Klinik Mikrobiyoloji Tan›, birinci bas- k› kitab›nda s. 452-3, Bar›ﬂ Yay›nlar› T›p Fakülte- leri Kitabevi, ‹zmir (1992).

3. Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI): (Çeviri editörü Deniz Gür) Antimikrobik

Duyarl›l›k Testleri için Uygulama Standartlar›, Onalt›nc› Bilgi Eki, M100-S16, Bilimsel T›p Kitabe- vi, Ankara (2006).

4. Hoffman LR, D’Argenio DA, MacCoss MJ, Zhang Z, Jones RA, Miller SI: Aminoglycoside antibiotics induce bacterial biofilm formation, Nature 2005;436(7054):1171-5.

5. Kanamaru S, Kurazono H, Terai A et al: Increased biofilm formation in Escherichia coli isolated from acute prostatitis, Int J Antimicrob Agents 2006;28(Suppl 1):S21-5.

6. Koneman EW, Allen SD, Janda WM, Schrecken- berger PC, Winn CW: Color Atlas and Textbook of Diagnostic Microbiology, 5th ed.” kitab›nda s.551-60, Lippincott, New York (1997).

7. Moreillon P, Entenza JM, Francioli P et al: Role of Staphylococcus aureus coagulase and clumping factor in pathogenesis of experimental endocardi- tis, Infect Immun 1995;63(2):4738-43.

8. Murray PR, Baron EJ, Jorgensen JH, Pfaller MA, Yolken RH: Manual of Clinical Microbiology, 8th ed.” kitab›nda s.384-93, ASM Press, Washington DC (2000).

9. Narisawa N, Furrukawa S, Ogihara H, Yamasaki M: Estimation of the biofilms formation of Esche- richia coli K-12 by the cell number, J Biosci Bioeng 2005;99(1):78-80.

178 V. Bayrakal ve ark.