Spektrofotometrik Ölçüm/Bulanıklık Tayini/Optik Yoğunluk

Spektrofotometrik Ölçüm/Bulanıklık Tayini/Optik Yoğunluk

•Bulanıklık tayini spektrofotometre ya da fotometre denilen cihazlar ile optik dansitenin (OD) tayiniyle ölçülür.

•Bu metot indirek bir metot olup mikroorganizmaların belli dalga boyundaki ışığı absorbe etme özelliklerinden yararlanılarak ölçülür.

•Hızlı ve güvenilir bir yöntem olmasına karşın canlı-ölü

hücreler ayırt edilemez.

Spektrofotometrik Ölçüm/Bulanıklık Tayini/Optik Yoğunluk

•Ayrıca tam sayının bilinebilmesi için standart eğri grafiğinin çizilerek her bir OD değerine karşılık gelen kuru-yaş ağırlık, koloni/mL, koloni oluşturan birim/mL (CFU/mL) gibi değerlerin tayin edilmesi gerekir.

•Pek çok mikroorganizma 600 nm. dalga boyundaki ışık varlığında spektrofotometrede ölçülebilir.

Spektrofotometrede 600 nm. dalga boyunda ölçülen

değerlere OD ₆₀₀ de denmektedir.

Spektrofotometrik Ölçüm/Bulanıklık Tayini/Optik Yoğunluk

•Bulanıklık tayininde katı veya sıvı kültürde bulunan

mikroorganizmalar aseptik koşullarda seyreltilerek yada direk

olarak spektrofotometre küvetine aktarılır. Bu işlem için genellikle 2 mL hacim yeterlidir fakat daha küçük ya da büyük hacimli

küvetler mevcuttur.

•Spektrofotometrenin dalga boyu 600 nm. ye ayarlanır.

•Spektrofotometre çift ışık yollu ise ikinci bir küvete saf su

konularak saf sudan gelen OD bertaraf edilir. Bu işleme körleme (blank) denilir.

•İkinci bir ışık yolu yok ise küvete önce saf su konularak auto-zero

tuşuna basılır. Bu sayede saf sudan gelen OD yok edilir.

Spektrofotometrik Ölçüm/Bulanıklık Tayini/Optik Yoğunluk

•1, 2, 4, 8, ve 10 g yaş mikroorganizma uygun besiyerinden elde edilir.

•Spektrofotometre körlendikten sonra mikroorganizmaları içeren süspansiyon küvete aktarılır ve ışık yoluna konulur. Okunan

değerin 0.1-0.9 arasında olmasına dikkat edilir. Bu değerlerin üzerinde ya da altındaki değerler aşırı hassas ya da yoğun olacağından tercih edilmez ve uygun seyreltmeler yapılır.

•Daha sonra diğer mikroorganizma süspansiyonları bu şekilde cihaza okutulur.

•1, 2, 4, 8 ve 10 g yaş mikroorganizma kütlesine karşılık gelen OD

değerleri excel dosyasında standart eğriye çevrilir.

Spektrofotometrik Ölçüm/Bulanıklık Tayini/Optik Yoğunluk

y=0.1x denkleminden ise yaş kütleye karşılık gelen OD değerleri hesapalanabilir. Örneğin OD’si 0.65 olan mikrooranizmanın yaş ağırlığının 6.5 olduğu

söylenebilir.

OD: 0.65 ise

Yaş ağırlık 6.5

Spektrofotometrik Ölçüm/Bulanıklık Tayini/Optik Yoğunluk

Yaş kütle OD

1 0,1

2 0,2

4 0,4

8 0,8

10 1

1. Ekle

2. Dağılım grafiği ekle

Şekildeki gibi bir grafik elde edilir. R

değerinin 0.98 altında kaldığı değerler kabul edilmez ve deney

tekrar edilir.