“Flow Cytometry” Çalışmalarında Kullanılan Florokromlar

“Flow Cytometry” Çalışmalarında Kullanılan

Florokromlar

Örneği fixe etmek ya da etmemek en önemli noktalardan biri ________________________________________

• Boyalar:

– “Permeant” –sağlam membrandan geçebilirler(vital dyes) – “Impermeant” – sağlam membrandan geçemezler

• Fiksasyon (Tespit) ile

– Proteinler denatüre edilir (etanol, metanol, aseton)

– Çapraz bağlar oluşturur (formaldehyde, gluteraldehyde)

• Fiksasyon yapmadan hücre geçirgen hale getirilebilir

– Nonionic deterjanlar (Triton X-100, Nonidet P-40)

İÇERİK

• Floresan boyaların özellikleri

• Nükleik asit boyaları

• “Tandem” boyalar

• “Reporter Gen” ler

• Fonksiyonel problar

• İzlemede kullanılan boyalar (Tracking Dyes)

Florokromlar: Temelözellikleri

• Excitation and emission spektrumu

• Extinction Coefficient

• Quantum Yield (adsorbe edilen her foton için salınan foton sayısı)

• Stokes Shif

• Spectral Overlap/Separation

• Uyarılan elektronların istirahat haline

dönüşlerinde açığa çıkan

ışığın enerjisi uyaran ışığa

göre daha düşük, dalga

boyu daha uzun olur

• İki florokrom birbirine yeterince yakınsa aralarında enerji transferi olur

• Örneğin bir Rodamin türevi olan Texas Red , PE’ye bağlanırsa PE uyarıldığında açığa çıkan enerji Texas Red in uyarılmasını sağlar.

Bu durumda son açığa çıkan ışığın dalga boyu 576 yerine 620 olur

• Uyaran ve açığa çıkan ışığın dalga boyu(rengi) Farklı olacagından optik filtreler kullanılarak

renkler birbirlerinden ayrılabilirler

• Florokromun özellikleri içinde bulunduğu koşula göre değişir

Ör: PI, suda zayıf floresan verirken DNA ya

bağlandığında hidrofobik ortamda floresans 50 kat artar

Ör:Bazı florokromlar pH a hassas (ör fluoroscein) Ör: İyon konsantrasyonuna hassas olan problar

var (ör Ca++)

• Floresansın şiddeti, ortamda bulunan ve enerji transferi olabilecek bazı moleküllerden de

etkilenir

Ör:Hoechst 33342, DNA ya bağlanan bir boya, UV ile uyarıldığında mavi renk verir. Ancak

DNA, daha önceden 5'-bromodeoxyuridine

(BrDU) ile işaretlenmişse , bu boyanın enerjisi

brom atomuna aktarılacagından azalacaktır

(farklı renk)

FCM de kullanılan fluorokromlar 2 tip

• Kovalan olmayan bağlarla hücre komponentlerine tutunabilenler

• Diğer problara kovalan bağlarla bağlanabilenler – Bu prob genelde bir antikordur

– Lectin, hormonlar avidin, streptavidin gibi diğer proteinler de olabilir

• Floresan proteinler(ör GFP) bu sınıflamanın dışında kalır

(GFP gen transfeksyonunda “reporter” olarak kullanılır

DAPI

Biotin –Avidin

kompleksi

Dolaylı(İndirect) İşaretleme:

Avidin-Biotin Yöntemi I

biotinylated primary Ab

biotin avidin

biotinylated dye

Kaynak: Dr. Carleton Stewart

Gelişimi

• Tek renkten çok renge geçiş

– Geleneksel sentetik boyalar: FITC, Rodaminler

• Düşük molekül ağırlığı : 400 -1,000

• Düşük sensitivite

– Doğal “phycobiliprotein” boyalar: PE, APC

• Molekül ağırlıkları daha büyük : 35K – 200 K

• Yüksek sensitivite

– Yeni sentetik boyalar: Cyanine & Alexa Boyaları

• Düşük molekül ağırlığı

• Spektral yelpaze genişliyor

• Yeni boyaların kullanılması için farklı lazerler gerekebilir

– Maliyet artıyor

• Çözüm: “Tandem Dyes” geliştirilmesi

– Gereken lazer sayısı azalır

– Kullanılabilecek renk sayısı artar

Nükleik Asit boyaları: Uygulamalar

• DNA ploidi

• Hücre siklusu analizi

– DNA içeriği

– BrdU işaretlemesi

• Apoptozun belirlenmei

– PI

– Hücre canlılığının değerlendirilmesi PI/TO – TUNEL assay

• Side population analysis (stem cells)

– Hoechst boyası

Normal Hücre Döngüsü

G

G

- G

s ^G

^M

DNA Content

2N 4N

G₂ M G₀ G₁

s

0 200 400 600 800 1000

0 75 150 225 300

C e ll C o u n t

Kaynak: J.Paul Robinson, http://www.cyto.purdue.edu/class

Apoptotik Hücrelerin Belirlenmesi

PI - Floresans

# Sayı

Apoptotik hücreler (Sub G1 pik) Normal G0/G1 hücreler

Canlı Hücreler Ölü Hücreler

Erken Apoptotik hücreler

nekrotik hücreler

Annexin PI

SP (Side populating) hücreler

K: c-kit ⁺ T: Thy-1⁺

L: Lineage spes. İşaret^- S: Sca-1 ⁺

“mouse SC”

Hoescht 33342, öncelikle DNA nın A-T zengin bölgelerine bağlanır, “ABC transporter”lar ile hücre dışına pompalanır, UV ile uyarılır Data courtesy of Daniel Pearce, Haematopoietic Stem Cell Lab, CRUK.

“Nukleik Asit” Boyaları: Kaynaklar

• Argon laser (488nm)

– PI, EB, 7-AAD(interchelator), Pyronin Y, 7-AAD – Acridine Orange, Thiazole Orange, (intercalating)

• Argon laser (457 nm)

– Chromomycin A3, Mithramycin

• He-Ne laser (633nm)

– DRAQ 5, TO-PRO 3 (Canlı hücreleri)

• Violet laser (407nm)

– Hoechst dyes, DAPI, Chromomycin, Mithramycin

• UV laser (355 nm)

– Hoechst dyes (33342 and 33258), DAPI

İmmunfenotiplemede sık kullanılan florokromlar I

He-Ne laser (633nm)

Allophycocyanin (APC) 650 660

APC-cyanine5.5 (APC-Cy5.5) 660 710 APC-cyanine 7 (APC-Cy7) 650 767 Alexa 647

Violet laser (407nm)

Cascade blue 380,401 420 Cascade yellow 409 558 Pacific blue416 451

Alexa 350 346 442

İmmunfenotiplemede sık kullanılan florokromlar II

Argon ion laser (488nm)

Fluorescein (FITC)495 520 Alexa 488 488 520

R-phycoerythin (PE) 495,564 576

• Argon ion (488nm) - Tandem dyes

PE-Texas Red (ECD) 495,564 620 PE-cyanine5 (PC5) 495,564 670

Peridinin-chlorophyll (PerCP) 490 677

PE-cyanine5.5 (PC5.5) 495,564 696

PE-cyanine7 (PC7) 495,564 767

“Reporter” Gen ler

• Transfeksiyonun başarılı olup olmadığını izlemek için kullanılır

• Tespit edilebilen ürünler kodlayan bazı genler, ilgi alanında olan gene bağlanır

• Oluşan bu bileşik gen yapısı hücre içine aktarılır (transfeksiyon)

• Daha sonra izlemek amacıyla bağlanan genin ürünleri aracılığı

ile(var/yok) ilgi alanındaki genin kodlama yapıp yapmadığı da

anlaşılabilir

• DNA probları:

bis-benzimadazole, (örHoechst 33342) sağlam hücre

membranından geçtiği için canlı hücrelerdeki DNA nın işaretlenmesinde kullanılabilir

Listedeki diğer fluorokromlar ile çalışırken hücrelerin

tespit edilmeleri, geçirgen hale getirilmeleri gerekir

Fonksiyonel Problar

Enzyme substrate fluorophores Tracking cell proliferation

Rhodamine 110 PKH

Membrane potential probes Drug efflux assays Rhodamine 123 Hoechst 33342

JC-1 Rhodamine 123

DiOC-3 Doxorubicin

Indo-1 AM Flo-3 AM

pH probes Oxidative burst assay

BCECF Rhodamine 123*

DCFH DA**

Ca probes

Fluo-3 *peroxidase dependent

Fura red **esterase dependent

Indo-1

• DNA probları:

bis-benzimadazole, (örHoechst 33342) sağlam hücre

membranından geçtiği için canlı hücrelerdeki DNA nın işaretlenmesinde kullanılabilir

Listedeki diğer fluorokromlar ile çalışırken hücrelerin

tespit edilmeleri, geçirgen hale getirilmeleri gerekir

“Tracking Dyes” (hücre bölünmesini izlemede kullanılan florokromlar)

Canlı hücrenin membranından geçebilen boyalardır, Permeabilizasyon- fiksasyon işlemi yapılmaz

• Anthraquinone boyaları (640 excitation)

– DRAQ5 – canlı hücrede kullanılabilir

• Diğer Boyalar

– PKH26 (cyanine dye)

– CFSE ( carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester )

CFSE ile hücre bölünmesinin takibi

Fonksiyonel Problar

Membrana bağlanan problar

• The most widely used carbocyanine membrane probes have been the octadecyl (C18)

indocarbocyanines (D-282, D-3911) and

oxacarbocyanines (D-275), ofen referred to by the generic acronyms

DiI and DiO, or more specifically as DiIC18(3), and DiOC18(3), where the subscript is the number of carbon atoms in each alkyl tail and the bracketed numeral is the number of carbon atoms in the bridge between the indoline or benzoxazole ring systems

• DNA probları:

bis-benzimadazole, (örHoechst 33342) sağlam hücre

membranından geçtiği için canlı hücrelerdeki DNA nın

işaretlenmesinde kullanılabilirler .

Listedeki diğer fluorokromlar ile çalışırken hücrelerin tespit edilmeleri, geçirgen hale

getirilmeleri gerekir

• Anthraquinone,

DRAQ5(TO), ve bis-

benzimadazole, (örHoechst 33342) sağlam hücre

membranından geçtikleri için canlı hücrelerdeki DNA nın işaretlenmesinde

kullanılabilirler .

• Listedeki diğer

fluorokromlar ile çalışırken hücrelerin tespit

edilmeleri, geçirgen hale

getirilmeleri gerekir

• Hoechst bind preferentially to AT-rich regions in the small groove of double-stranded DNA and fluoresce blue when excited by UV light.

• Chromomycin A3, binds to the GC-rich regions of DNA

• ‘6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) has been used extensively to label DNA for excitation with UV; it is ofen the stain of choice in

instruments employing a mercury arc lamp.

• Bazı” reporter” moleküller hücreye girer ve çıkmaz (ör Hoechst 33342 DNA ya sıkıca bağlanır)

• Bazı “ reporter” moleküller, yüklüdür ve plazma

membranını geçmekte zorlanırlar. Bu durumda yüklerini

maskeleme yoluna gidilir (ör bir ester hazırlayarak) Yüksüz

olan molekül, membrandan diffüzyonla geçer Hücredeki

nonspesifik esterazlar, onu tekrar orijinal yüklü haline geri

çevirir

Indo-1 is a ratiometric calcium dye that is excited at 350-360 nm and emits at 390 nm and 530 nm. The dye when bound to calcium emits at 390 nm (violet) and when unbound emits at 530 nm (green), the ratio of the violet over the green signals is calculated as the ratio which is displayed as a parameter over time. | Hence before activation the presence of excess dye within the cell population should give a predominately green signal and hence low ratio value. Upon

activation the dye should change from green to violet and hence the Indo-1 ratio should increase over time.