Log-likelihood oranı kullanarak CASS ve SSS’in karşılaştırılması

Bilgisayar-destekli embryo seçilimi: embryo kalitesini değerlendirmesindeki faydası?

Goedele Paternot ve arkadaşları Giriş

Reproduktif tıbbın en major problemlerinden biri çoğul gebeliklerdir. Çoğul gebelikler daha yüksek insidansla perinatal ve neonatal olmak üzere, tıbbı komplikasyonlara ve daha yüksek sosyoekonomik maliyete neden olur ve transfer edilen embryo sayısını azaltarak önlenebilir.

Tek-embryo transferi (SET) çoğul gebelik insidansını azaltan en efektif yoldur. Her ne kadar, SET yapılmasıyla tüm gebelik hızları korunabilir, iki embryo transferi( hatta 3) ile karşılaştırıldığında, canlı doğum hızı azalabilir. Çoğul gebeliklerden korunmak için, elektif SET veya çift-embryo transferinin evrensel görüş olarak değerinin arttırılması için, yüksek implantasyon potansiyeli olan ve canlı doğum ile sonuçlanacak embryoların seçimi çok önemlidir. Şimdiye kadar, embryo şeçimi, rutin olarak embryo kalitesini değerlendiren, değişik klasifikasyon ve skorlama sistemleri kullanılarak embryonun gelişimi ve morfolojik karakterlerine bakılarak yapılırdı.

Bir embryolog tarafından direkt mikroskopi kullanılarak yapılan standart klivaj-evresindeki embryo skorlamasının bir takım kısıtlamaları vardır. İlk olarak, morfolojiyi değerlendirmedeki gözlemciler arasındaki fark rapor edilmiştir. İkincisi, spesifik karakterleri ölçmedeki standart metodun olmayışı önemli bilgilerin kaybına neden olur. Fragmantasyonun derecesinin değerlendirilmesi bakacak olursak, birçok skorlama sistemi bu karakterleri kategoriler kullanarak değerlendirmektedir. Daha detaylı ölçümler daha fazla bilgi verebilir. Üçüncüsü, değerlendirmenin süresi mümkün olduğunca kısa tutulmalıdır ki, değişken ph ve ısı embryo kalitesini bozmaması için. Bu yüzden, değerlendirme sürelerinin kısa olması gereklidir. Tersine, gerçek zamanlı tam morfolojik karakterlerin değerlendirmesi zaman alır.

Yeni teknoloji kullanılarak çok boyutlu görüntü sağlayan bilgisayar yardımlı skorlama sistemi (CASS), standard skorlama sistemi (SSS)’nin getirdiği birçok dezavantajın üstesinden gelebilir.

İlk olarak, CASS gelişim sırasında embryoların çok boyutlu görüntülerini alabilmektedir, hızlı bir yolla, optimal şartlara maruz kalma zamanını sınırlar. İkinci olarak, bu çok boyutlu görüntüler embryoloğun embryo kalitesini, inverted mikroskop kullanarak değerlendirmesiyle aynı şekilde değerlendirilir. Bu hiç zaman kaybetmeden daha detaylı bir inceleme yapılabileceğini işaret etmektedir. Üçüncüsü, embryo karakterleri, skorlama olarak daha iyi ve kesin olarak semi-otomotik olarak analiz edilebilir. Bu embryo skorlaması sırasındaki gözlemciler arasındaki değişkenleri azaltır.

Her ne kadar implantasyon prediksiyonunda CASS ve SSS’i karşılaştıran bir çalışma yoksa da, bu çalışma implantasyon ve canlı doğum oranlarında hangi skorlama sisteminin daha iyi olduğu analiz edildi.

Materyal ve Metod Embryo seçilimi

Bu çalışma 3 günde SET’li intrasitoplazmik sperm enjeksiyonu (ICSI) yapılan 463, 36 yaşından genç veya IVF siklusu yapılan 502 hastadan toplanan toplam 3185 embrioyu içermektedir. Etik kurul onayı alındı. Hasta ve siklus özellikleri tablo 1’de verildi.

Oosit toplanmasından sonra, oositler 500 µl fertilizasyon mediumuyla mineral yağı altında 4 kez yıkandı. Spermatozoalar standart densite-gradient proseduru ile IVF için hazırlandı. ICSI için kullanılacak sperm örnekleri dilue edildi ve iki kez 10 dakika süre ile 300g’de santrifuj edildi.

Standart IVF/ICSI prosedurleri oosit toplanmasından 2-6 saat sonra yapıldı. IVF işlemi sırasında, oositle 200.000 progresif motil spermatozoa ile insemine edildi. ICSI siklusunda vakada, injekte edilen oosit 20 µl kültür mediumunda inkübe edildi. 1’inci günde (inseminasyon/injeksiyondan 16-20 saat sonra) oosit fertilizasyon açısından kontrol edildi.

Sadece normal fertilize olmuş oosit (iki pronukleuslu) 20 µl dropletli mediumunda mineral yağ altında ayrıca inkübe edildi.

Bu çalışmanın ilk kısmında, tüm embriolar çok boyutlu görüntüler kullanılarak CASS ile değerlendirildi ve embro karakterlerinin değerlendirilmesi için Leuven Üniversitesi fertilite merkezinin SSS’i ile karşılaştırıldı. Bu çalışmanın ikinci kısmında, implantasyon ve canlı doğum açısından, her iki skorlama sistemi 502 transfer edilen embryoda karşılaştırıldı.

Embryo değerlendirmesi

Bilgisayarlı sistem ile gelişmelerine göre embryo kesitlerine ait görüntüler birinci günde (inseminasyon/injeksiyon sonrası 16-20 saatte), ikinci günde (inseminasyon/injeksiyon sonrası 41-44 saatte) ve üçüncü günde (inseminasyon/injeksiyon sonrası 66-71 saatte) kayıt edildi. Bu sistem aynı oosit ve embryonun otomotik fokus ile art arda 26 görüntüsünü tüm embryonun 5µm kesitlerinde kayıt edilmesini sağlar. Bu görüntü sekanslarının kullanılması, FertMorph bilgisayar sistemi yazılımı ile semi-otomatik olarak her embryonun morfolojik analizini sağlar.

Birinci günde, zigotun çapı manual olarak çizildi. Bu çizilmiş çaplara dayanarak, zigotun total hacmi bilgisayar tarafından hesaplandı. İkinci gün ve üçüncü gün embryolarının her blastomerine aynı işlem yapıldı. Hnido ve arkadaşları ve Johansson ve arkadaşlarının bulgularına dayanan blastomer ve fragment ayrım kriterleri; ikinci günde blastomer ≥45µm ve üçüncü günde >40µm olarak kullanıldı. Gelişimin ilk günlerinde total volumun değişmediği prensibine dayanarak, zigotun hacmi ve tüm blastomerlerin toplam hacmi arasındaki fark bilgisayar sistemi kullanılarak hesaplandı. Bu tüm sitoplazmik azalma fragmantasyon olarak yorumlandı; bu sebeple, bu toplam sitoplasmik azalma takip eden bölümlerde fragmantasyon olarak adlandırılır. Ek olarak sistem embryo içerisindeki blastomerlerin hacmini karşılaştırır ve boyut olarak eşit (<%25 fark) ve eşit değil (>%25 fark) olarak tanımlanır.

SSS değerlendirmesi sırasında, bir embryolog ikinci günde ve üçüncü günde her embryoyu blastomerlerin sayısını skorlayarak değerlendirir.Fragmantasyon derecesi (0= hiç fragmantasyon yok; 1=<%10 fragmantasyon; 2=%11-25 fragmantasyon;3= %26-50 fragmantasyon ve 4 =>%50 fragmantasyon)ve blastomer boyutu (0=eşit boyutlu blastomerler, 1=hafifçe eşit olmayan blastomerler (%25-50 fark); 2=eşit olmayan blastomerler (>%50 fark)).

İki skorlama sistemini karşılaştırmak için bu kriterler ‘hafifçe eşit’ ve ‘eşit olmayan’ embryo grupları kombine edildi ve ‘eşit olmayan blastomerler’ olarak tanımlandı. Üçüncü gün en iyi embryo SSS ile transfer için şeçildi.

İki skorlama sisteminin karşılaştırılması; pratik beklentiler

En son adım, bu iki skorlama sistemini değerlendirmek için bazı pratik beklentiler değerlendirildi. ilk olarak, suboptimal şartlara maruziyet ölçüldü. Dört embryo içeren üç kap, ayrıdamlalar kullanılarak kültüre edildi. Suboptimal koşullara maruziyet zamanı, inkubatorden embryoların çıkarılması ve inkübatöretekrar geri konmaları arasındaki zaman dilimi idi.

Embryolar, CASS ve SSS kullanılarak değerlendirildi. CASS’ın reproduktif kabiliyeti 10 değişik embryonun çapının üç farklı zaman diliminde birinci günde, ikinci günde ve üçüncü günde gelişim periodunda ölçüldü (n=3). Sonuçta, birinci günde 10 oositin değerlendirilmesi, ikinci günde 10 embryonun ve üçüncü günde on embryonun CASS kullanılarak değerlendirilme zamanı değerlendirildi.

İstatistik

Tüm embryolar değerlendirldi (n=3185). Her iki embryo skorlama sistemini karşılaştırmak için, chi-kare testi ve 0.05 değeri anlamlı olarak kullanıldı. 502 transfer edilen embryo kullanıldığı, her iki testtin implantasyon ve canlı doğum hızını predikte edebildiği logistic regresyon analizi kullanılarak yapıldı.

Sonuçlar

Tanımlayıcı istatistikler

Her iki skorlama sisteminde tanımlayıcı istatistikler toplam embryo sayısından ( n:3185) morfolojik karakterleri kullanılarak karşılaştırılmıştır. Öncelikle, her iki sistemde de 2. ve 3.

gün blastomer sayıları benzerdir (Tablo 2). İkinci sonuç, CASS ile değerlendirilen 2. ve 3. gün embryolarda tüm kategorilerde daha fazla derece fragmantasyon saptanmıştır (resim 1).

Önemli bir konu da materyal ve metotta belirtildiği gibi embryoloğun hangi parça blastomer hangi parça fragman olduğu belirtene kadar blastomer sayıları tamamıyla otomatik olarak CASS ile değerlendirilmedi. Üçüncü sonuç, 2. günde eşit büyüklükte blastomer CASS kullananda, SSS’ e göre daha sık izlenmiştir (P < 0,001). Ancak, 3. günde, eşit büyüklükte blastomer, CASS kullananda, SSS’ e göre daha az sıklıkta izlenmiştir (P = 0,002) (Tablo 3).

Tablo 2 Embryo skorlama sistemlerine göre ve 2. ve 3. gün blastomer sayılarına göre embryolar ( n:3185)

İmplantasyonu tahmin etmede lojistik regresyon analizi

Bu çalışmanın öncelikli hedefi implantasyon hızları. Transfer edilen 140 embryonun toplamı intrauterin gebelik ile sonuçlandı ve bu da implante embryo olarak değerlendirildi. Birinci (%26, 97/371) ve ikinci (%33, 43/131) IVF/ICSI sikluslarında embryo implantasyon hızları arasında fark bulunmadığından her iki grupta aşağıdaki analizlerde bir grup olarak değerlendirilmiştir.

Bilgisayar destekli skorlama sistemi (CASS)

Basit regresyon analizi kullanıldığında implantasyon hızı 2.gün blastomer sayısı (P = 0,029) ve 3.

gün blastomer sayısından (P < 0,001) önemli derecede etkilendiği izlenmektedir (Tablo 4).

Çoklu regresyon analizinde ( backward selection) sayı, büyüklük ve 3.gün blastomerlerde fragmantasyon derecesi kullanıldığında, implantasyon hızı sayıdan (P < 0,001) ve blastomerlerin 3. gün büyüklüğünden (P = 0,018) önemli derecede etkilendiği izlenmektedir (Tablo 4).

Resim 1 Her iki sistemde fragmantasyon derecesi değerlendirmesi 2. ve 3. gün. Her 2.ve 3. gün içinde P- değeri <0,0001.

Tablo 3 Her iki embryo skorlama sitemine göre 2. ve 3. gün eşit büyüklükte olan veya olmayan embryolar (n:3185)

Standart Skorlama sistemi (SSS)

Basit regresyon analiz kullanıldığında, implantasyon hızı, 3. gün blastomer sayısından (P <

0,001), 3. gün blastomer fragmantasyon derecesinden (P = 0,019) ve 3. gün blastomer büyüklüğünden (P = 0,017) önemli oranda etkilenmektedir. 2. gün blastomer büyüklüğünden anlamlı olmayan bir sınırda etkilenme mevcuttur. (tablo 4). Çoklu regresyon analizinde (backward selection) bu 3 karakteri 3. gün için kullanıldığında implantasyon hızı özellikle şunlardan etkilenmektedir: blastomer sayısı (P < 0.001), fragmantasyon derecesi (P = 0,004) ve blastomer büyüklüğü (P = 0,04). (Tablo 4).

Tablo 4 Skorlama sistemlerinin lojistik regresyon analizlerinin (basit ve çoklu) sonuçları ve skorlama sistemlerinin kombinasyonu (çoklu) için sonucun implantasyon hızı olarak alınması

CASS ve SSS’in her ikisini entegre ederek çoklu regresyon analizi

Her iki sistemin karakteristik ölçülerini entegre ederek regresyon analizi yapıldı. Geriye dönük seçimden sonra, implantasyon hızı üzerine anlamlı etkileri olan CASS ile değerlendirilen 3. gün blastomerlerin sayı (P < 0,001) ve büyüklüğü (P = 0,009), SSS ile değerlendirilen 3. gün fragmantasyon derecesi (P = 0,001). (tablo 4)

CASS, SSS ve kombine CASS/SSS’i log-likelihood oranları kullanarak karşılaştırmak

0,05). Daha sonra, CASS tarafından verilen model ile kombine model karşılaştırılmıştır. İki model arasında farklılık 18,26'dır. Bu vakada ki-karenin 4 bağımsız derecesinin dağılımını takiben farlılıkta CASS’ın implantasyon şansını tahmin etmede daha iyi olduğu izlenmektedir.

Tablo 5 Canlı doğum hızı sonuç olarak alındığında lojistik regresyon analizi (basit) sonuçları

Canlı doğumları öngörmek için lojistik regresyon analizi

Basit regresyon analizinde canlı doğum hızı anlamlı olarak hem CASS hem de SSS’ de 3. gün blastomer sayısından etkilenmektedir ( her ikisi içinde P < 0.001).

Log-likelihood oranı kullanarak CASS ve SSS’in karşılaştırılması

Her iki skorlama sistemi benzer özellikleri ölçtüğünden beri çoklu regresyon analizi kullanılmadı. Sonraki adımda canlı doğum hızını öngörmede en iyi modeli oluşturmak için her bir model için log-likelihood oranı hesaplandı. CASS modeli için log-likelihood oranı -327,29, SSS için -333,92 (tablo 5). İki log-likelihood oranının karşılaştırmasında farklılık her modelin -2x log-likelihood oranı arasında alındı (86,74). CASS için olan modelin log-likelihood oranı anlamlı olarak daha yüksek (P < 0.05) ve CASS’ın canlı doğum oranını tahmin etmede daha iyi olduğunu düşündürmektedir.

Her iki skorlama sisteminin karşılaştırılması: Pratik yönü

Embryonun inkübatörden çıkartılması ve tekrar inkübatöre yerleştirilmesi arasında geçen ortalama süre SSS ile değerlendirmeye göre CASS ile değerlendirmede anlamlı olarak daha azdır (74,33 s vs 88,33 s, P = 0.007). Bundan dolayı, SSS ile değerlendirmede embriyo 1,2 kat daha fazla süre suboptimal şartlara maruz kalmaktadır. CASS’ın tekrarlarında toplam sitoplazmik hacimde çok düşük oranda değişiklik izlenmiştir (ortalama değişim katsayısı 0,031) . İhtiyaç duyulan ortalama ve standart sapma süreleri 1. gün 10 oositte 2,73 ± 0,12 dakika, 2. gün 10 embriyoda 5,83 ± 0,42, 3. gün 10 embriyoda 9,17 ± 0,15 dakikadır.

Daha da açıklayıcı biyolojik verileri gösteren bir makale şu an hazırlanma aşamasındadır.

Tartışma

Bu çalışma, CASS kullanımının implantasyon ve yeni doğum oranını arttırmada SSS’den daha etkili olduğunu göstermiştir. İstatistik sonuçlarına göre blastomer sayısında anlamlı değişiklik saptanmamıştır.

Önemli olan şu ki; CASS sadece otomatik bir sistem değildir ve blastomer sayısı manuel olarak arttırılabilir. Fragman ve blastomer arasında ayrım yapan ve hücrelerin sınırlarını belirleyen embryologdur. Bu limitasyon CASS full otomatik bir ayrıma optimize edilene ve blastomer tanımı bir yazılım programınca tanımlanana kadar devam edecektir.

Fragmantasyon artımı derecesinin skorlama sistemi ile embryo gelişiminin 2. ve 3. günlerindeki blastomer boyutu arasında anlamlı farklılık saptanmıştır. CASS, SSS ile karşılaştırıldığında 2.

günde aynı blastomer boyutunda, daha yüksek fragmantasyon derecesi ile daha fazla embryo ve 3. günde aynı blastomer boyutunda daha az embryo saptamıştır. Gerileme analizi göstermiştir ki CASS ile ölçülen karakteristiklerimplantasyon şartı ve canlı doğum konusunda SSS’den daha fazla bilgi vermektedir. CASS ile ölçülen blastomer sayı ve boyutunun kullanımı SSS veya ikisinin kombinasyonu ile karşılaştırıldığında implantasyon şansını daha fazla arttırmaktadır.

Üçüncü gündeki blastomer sayısının kullanımı canlı doğum oranı için daha iyi bir tahmin sağlamaktadır. Bu Johansson ve arkadaşlarının (2003) çalışmasındaki blastomer boyutlarının CASS’daki daha sınırlı limitleri ile açıklanabilir. SSS kullanarak blastomer ve fragment arasındaki ayrımın yapılması embryoloğa dayanmaktadır ve açıktır ki boyutun objektif ölçülmesine dayanmamaktadır.

CASS’in, SSS üzerinde önemli avantajları vardır. İlk olarak, çok boyutlu görüntülerin kullanımına bağlı olarak, analiz zamanında hiçbir kısıtlama yoktur. Çok boyutlu görüntüler bir kez yapıldıktan sonra, değerlendirme istenildiği zaman yapılabilir bir sınırlama yoktur, böylelikle embryo daha detaylı bir şekilde incelenebilir. Nuklear yapı gibi embryonun karakteristik özellikleri saptanırken, CASS kullanılarak bu geliştirilebilir (Hnida ve ark. 2005).

Dahası, bu çalışma göstermiştir ki, SSS ile kıyaslandığında CASS’ta suboptimal koşullara maruziyet söz konusu değildir. İkinci olarak, embryonun karakterini gösteren, fragmantasyon derecesi ve blastomer boyutları gibi, otomatik matematiksel hesaplamalar ile CASS software kullanılarak mümkündür. Bu durum insan embryolarının değerlendirmesinde gözlemciler arasındaki farkı ortadan kaldırabilir. Ve embryo morfolojisinin değerlendirilmesinde değerli bir metod olarak kullanılabilir.

CASS’ın en önemli dezavantajı, her farklı blastomerin çapının tek tek ölçülmesini gerektirmesinden dolayı çok boyutlu görüntülerin değerlendirilmesinin analiz için fazla zaman almasıdır. Otomatik blastomer tanımlayıcısı ve hesaplama sistemi analiz zamanını oldukça azaltacaktır ve kullanıcı dostu bir sistem mutlaka geliştirilmelidir.

Bu çalışmada, iyi prognozlu bir hasta populasyonu (<36 yaşında, ilk veya ikinci IVF/ICSI siklusu) kullanıldı. Daha fazla çalışma, IVF hasta populasyonunda bu sonuçların doğrulanması için yapılmalıdır. Embryo- skorlama sistemler çalışmalarının major dezavantajı, değişik laboratuvarlar kullandıkları için gold standardın oluşturulamamasıdır. Bu sebeple, CASS ile özel bir başka skorlama sistemi arasında karşılaştırma sonuçlarsı sınırlıdır (bu çalışmada SSS, Leuven Üniversitesinin kullandığı). Açıkçası, bu sonuçlar geniş çok merkezli çalışmalarla doğrulanmalıdır. Ek olarak, diğer gruplarca(De Neubourg ve ark.,2004; Guerif ve ark., 2010;

Hesters ve ark., 2008; Wong ve ark.,2010) yapılan diğer morfolojik karakteristikler üzerine bir sonuç belirtilemez, çünkü CASS sadece üç karakterin değerlendirilmesine izin vermektedir:

sayı, blastomer sayısı ve fragmentasyon derecesi.

CASS yazılımı ile ilgili malyet fayda analizleri yapılmadı ve maliyet görüntü analizi ile ilişkili.

Gelecekte, canlı doğum hızlarını predikte etmede CASS’ın sağlayacağı ek değerin, maliyet ile dengede olup olmayacağı araştırılacaktır. Her ne kadar, birçok disiplin tarafından bilgisayar destekli sistemlere ilgi artmaktadır ve bu sistemlerin gelecekte günlük uygulamalarınızda yeri olacaktır. Daha öncede belirtildiği gibi, yazılımın optimizasyonugörüntülerin analizi için gerekecek zamanı azaltmanın en iyi çözümü olacaktır.

Sonuçta, bu çalışma göstermiştir ki, ilk olarak bilinmelidir ki mümkün olduğunca, CASS üçüncü gündeki sayı ve blastomer boyutana dayanarak implantasyon hızlarında, SSS ile karşılaştırıldığında daha iyi prediksiyon sağlamaktadır. CASS kullanarak blastomer sayılarının hesaplanması, canlı doğum hızlarında daha iyi sonuçlar vermektedir. Çok merkezli, prospektif embryo implantasyonunu gösteren çok boyutlu bilgisayar görüntülerine ve matematik mühendisliğine dayanan gelecekteki araştırmalar ile bu bulgular daha iyi aydınlatılacaktır.