*‹ntranazal ve ‹ntraperitoneal Uygulanan Pseudomonas
aeruginosa Quorum Sensing Vahfli tip ve Mutant
kökenlerin Akci¤er Histopatolojisindeki Etkileri
The Effects of Intranasally and Intraperitoneally Administered
Pseudomonas aeruginosa Quorum Sensing Wild-type and
Mutant Strains on Lung Histopathology
Meral Kahraman1
, Müge Kiray2
, Alper Ba¤r›yan›k2
, Hakk› Bahar3 Dokuz Eylül Üniversitesi T›p Fakültesi 1Multidisipliner Laboratuvar›, 2Histoloji ve Embriyoloji ve
3
T›bbi Mikrobiyoloji Anabilim dallar› ‹zmir
*Bu araflt›rma XXXIV. Türk Mikrobiyoloji Kongresinde poster olarak sunulmufltur. (7-11 Kas›m 2011, Girne-K›br›s)
ÖZET
Amaç: Pseudomonas aeruginosa enfeksiyonlar›n›n patogenezinde Quorum Sensing (QS) olarak bilinen hücreden hücreye sinyal iletim sistemi önemli bir yere sahiptir. P. aeruginosa‘da birbiri ile iliflkili las, rhl ve kinolon olmak üzere üç QS sistemi tan›mlanm›flt›r. Deneysel hayvan modelleri QS sisteminin etkilerini incelemede yayg›n olarak kullan›lmaktad›r. Bu çal›flmada, s›çanlarda iki farkl› yol ile oluflturulan enfeksiyon modelinde P. aeruginosa QS sisteminin akci¤er histopatolojisindeki etkileri de¤erlendirilmifltir
Gereç ve Yöntem: P. aeruginosa PAO1 (QS wild type) ve PAO JP2 (QS mutant; ∆lasI/∆rhlI) referans laboratuvar sufllar›, 230-280 gr a¤›rl›¤›nda Wistar albino soyu s›çanlara intranazal (n=21) ve intraperitoneal (n=21) yol ile uygulanm›flt›r. 24 saat sonra hayatlar› sonland›r›lan s›çanlar›n akci¤er dokular›nda; kapiller konjesyon, hemoraji, polimorf çekirdekli hücre infiltrasyonu ve alveoler septumda kal›nlaflma kriterleri aç›s›ndan hasar skorlamas› yap›lm›flt›r.
Bulgular: Bakterilerin uygulanmas›ndan 24 saat sonra akci¤erlerde makroskobik ve mikroskobik düzeyde hasar olufltu¤u gözlenmifltir. Her iki uygulama yolu ile de, PAO1 grubunda akci¤er hasar›n›n, kontrol ve PAO JP2 gruplar›na göre anlaml› olarak yüksek oldu¤u belirlenmifltir. PAO JP2 suflunun, intranazal yol ile uyguland›¤›nda intraperitoneal uygulamaya göre daha fazla akci¤er hasar›na neden oldu¤u saptanm›flt›r.
Sonuç: Bakterinin intranazal ve intraperitoneal verilmesi ile oluflturulan akci¤er enfeksiyonu modeli oldukça basit bir yöntemdir. Bu yöntem, QS sisteminin yan› s›ra çeflitli virülans faktörlerinin etkilerini incelemede de yararl›d›r. QS sistemi, akci¤er hasar› oluflturmada her iki uygulama yolunda da belirgin rol oynamakla birlikte, QS mutant sufllar›n da hasar oluflturmas› patogenezde farkl› mekanizmalar›n varl›¤›n› düflündürmektedir.
Anahtar Kelimeler: Pseudomonas aeruginosa, ço¤unlu¤u alg›lama, akci¤er histopatolojisi
G‹R‹fi
F›rsatç› bir patojen olan Pseudomonas aeruginosa üretti¤i çeflitli virülans faktörleri ve sürekli artan antibiyotik direnç oranlar›yla s›k rastlanan, mortalite ve morbiditesi yüksek bir enfeksiyöz ajand›r (1,2).
P. aeruginosa enfeksiyonlar›n›n patogenezinde, bakteriyel popülasyonlara kendi hücre yo¤un-luklar›n› alg›layarak çevresel koflullara göre davran›fl sergileme imkan› veren ve "Quorum Sensing"(QS) olarak adland›r›lan sistem anahtar rol oynamaktad›r. Vibrio, Agrobacterium, Erwi-nia ve YersiErwi-nia gibi birçok bakteri türünde de bulunan bu mekanizmayla bakteriler bulunduk-lar› ortamda birbirleriyle iletiflim kurabilmekte, çevresel koflullar› alg›layabilmekte ve konakta enfeksiyon oluflturabilecek gerekli hücre yo¤un-lu¤una ulafl›ncaya kadar immun sistem taraf›n-dan fark edilmeden yaflam›n› sürdürebilmekte-dir (3,4).
P. aeruginosa’da birbiri ile iliflkili las, rhl ve ki-nolon (Pseudomonas quiki-nolone signal; PQS) olmak üzere üç QS sistemi tan›mlanm›flt›r (5,6). Bunlardan las sistemi; sinyal molekülü olarak uzun zincirli AHL’yi (3-oxo-C12-HSL-L) kul-lanarak biyofilm oluflumunu ve Las B elastaz, Las A proteaz, ekzotoksin A gibi di¤er hücre d›-fl› virülans faktörlerinin üretimini kontrol et-mektedir (7). Sinyal molekülü olarak k›sa zin-cirli AHL’yi (C4-HSL) kullanan ve rhl AB ope-ronunun yap›m›n› kontrol eden rhl sistemi ise, ramnolipid üretimi için gerekli olan "rhamnosyl transferase" enziminin sentezlemesini ve Las B elastaz, Las A proteaz, piyosiyanin, siyanid ve alkalen proteaz›n üretimini düzenlemektedir (8,9). PQS molekülünün üretimi lasR sistemi taraf›ndan kontrol edilmektedir ve ekzojen PQS, elastaz B’nin ve RhlI’nin ekspresyonunu güçlü bir flekilde uyarmaktad›r (6). Bu üç sistem
SUMMARY
Objective: In the pathogenesis of Pseudomonas aeruginosa infections, cell to cell signal transmission system, known as Quorum Sensing (QS), has an important role. Three interrelated QS systems are defined in P. aeruginosa, namely las, rhl and quinolone. Experimental animal models are widely used in examining the effects of QS system. In this study, the effects of P. aeruginosa QS system on lung histopathology were assessed by two different rat infection model.
Materials and Methods: P. aeruginosa PAO1 (QS wild type) and PAO JP2 (QS mutant; ∆lasI/∆rhlI ) reference laboratory strains were administered to Wistar albino rats, weighing 230-280 gr, by intranasal (n=21) and intraperitoneal (n=21) routes. Rats were executed after 24 hours and lung tissue samples of rats were investigated for capillary congestion, hemorrhage, infiltration of polymorphonuclear cells and alveolar septum thickening, in terms of damage scoring.
Results: Macroscopic and microscopic damages were observed 24 hours after the administration of bacteria. Lung damage observed in the PAO1 group was significantly higher than the control and PAO JP2 groups for both of the administration routes. PAO JP2 was determined to cause more pulmonary damage in the infection model induced by intranasal administration compared to the intraperitoneal administration.
Conclusion: Experimental lung infection model, induced by intranasal and intraperitoneal administration of bacteria, is a very simple method to apply. It would be useful in examining the effects of various virulence factors, as well as QS system. Although QS system has a significant role in the pathogenesis of the lung damage induced by the two application methods, damage caused by QS mutant strains suggests that different mechanisms that funtion in pathogenesis should be further addressed.
aras›nda las sistemi anahtar rol oynamakta ve di¤erleri las ile hiyerarflik bir iflleyifl içinde bu-lunmaktad›r. las QS sistemi, rhl QS sistemini kontrol etmekte ayn› zamanda lasR QS, PQS üretimini düzenlemektedir. PQS ise rhlI ve rhlR ekspresyonunu art›rd›¤›ndan PQS etkinli¤i las ve rhl QS sistemleri aras›nda düzenleyici ba¤-lant› rolü oynamaktad›r (10,11).
Kronik P. aeruginosa enfeksiyonlar›nda bakteri biyotik ve/veya abiyotik bir yüzeye tutundu¤unda konak hücre yan›t›ndan kaçmak ve de¤iflen çevre flartlar›nda canl› kalmak için biyofilm (ekzopolisakkarid ile çevrili mikrokoloniler) içerisinde yaflam›n› sürdürmektedir. Biyofilm içerisinde üreyen bakteriler, planktonik olarak üreyenlere göre antibiyotiklere daha dirençlidir. P. aeruginosa enfeksiyonlar›nda biyofilm olu-flumu QS sisteminin kontrolündeki sinyallerle düzenlenmektedir (12,13). Benzer flekilde QS sistemi taraf›ndan düzenlenen elastaz ve ramnoli-pid üretiminin, özellikle pulmoner enfeksiyonlar›n geliflmesinde ve mikroorganizman›n yay›lma-s›nda önemli rol oynad›¤› bildirilmifltir (14). P. aerugiosa enfeksiyonlar›nda QS sistemi ve bu sistemin kontrolü alt›ndaki virülans faktörle-rinin etkilefaktörle-rinin anlafl›lmas›nda, QS vahfli tip ve QS sisteminin sinyal molekülü üreten genleri mutasyona u¤rat›lm›fl sufllarla yap›lan karfl›lafl-t›rmal› çal›flmalar oldukça de¤erli bilgiler sun-maktad›r. P. aeruginosa’n›n patojenitesinde QS sisteminin önemi gerek farkl› hücre dizilerini içeren ex-vivo modeller, gerekse deneysel hay-van modellerinin kullan›ld›¤› çeflitli çal›flmalar-da araflt›r›lm›flt›r (15-18). Deneysel hayvan mo-delleri aras›nda ise akci¤er enfeksiyonu modeli ön plana ç›kmaktad›r. P. aeruginosa kaynakl› deneysel akci¤er enfeksiyonu modelinin olufltu-rulmas›nda, agar içine emdirilmifl bakteri süs-pansiyonlar›n›n trakeaya inokule edilmesi
ol-agar içine P. aeruginosa’n›n emdirilmesi ile bi-yofilm oluflumunu taklit etmek, bakterinin hava yollar›nda varl›¤›n› sürdürmesine ve kronik ak-ci¤er enfeksiyonu bafllatmas›na zemin haz›rla-mak amaçlanhaz›rla-maktad›r (19). Ancak bu modelde hayvanlarda mekanik t›kan›kl›¤a ba¤l› olarak yüksek oranda ölümlerin görülmesi ve modelin el becerisi gerektirmesi uygulamay› k›s›tlamak-tad›r. Bakterinin sistemik yollarla verilmesi sonucunda da akci¤er enfeksiyonu modeli oluflturulabildi¤i gösterilmifltir. ‹ntranazal ya da intratrakeal yol ile bakteri süspansiyonunun verilmesi bu yöntemler aras›ndad›r. Çal›flma-m›zda, P. aeruginosa QS vahfli tip ve QS mutant sufllar›n intranazal uygulamas› ile ger-çeklefltirilen akci¤er enfeksiyonu ve intraperito-neal uygulamas› ile gerçeklefltirilen sepsis mo-dellerinde QS sisteminin akci¤er histopatoloji-sindeki etkilerini araflt›rmak amaçlanm›flt›r.
GEREÇ ve YÖNTEM
Çal›flmada konvansiyonel flartlarda yetifltirilmifl, 230-280 gram a¤›rl›¤›nda Wistar albino erkek s›çanlar kullan›lm›fl ve çal›flma, Dokuz Eylül Üniversitesi Hayvan Deneyleri Yerel Etik Kuru-lunun onay› (HADYEK NO:32/2010) ile etik kurallara uygun olarak yürütülmüfltür.
Deneysel enfeksiyon modeli: Çal›flmada enfek-siyon modelleri için P. aeruginosa PAO1 (QS Wild Type) ve PAO JP2 (QS mutant; ∆lasI/∆rhlI) referans laboratuvar sufllar› kulla-n›lm›flt›r. Her bir uygulama yönteminde 21 tane olmak üzere toplam 42 s›çan kullan›lm›fl olup, gruplar PAO1 (WT) (n=7), PAO JP2 (∆lasI/∆rhlI) (n=7) ve kontrol (n=7) olarak düzenlenmifltir.
‹ntranazal uygulama ile akci¤er enfeksiyonu modeli için; bakteriler Luria Bertoni (LB) (Con-da, ‹spanya) agarda 37°C’da bir gece inkübe
optik dansitesi bir olacak flekilde ayarlan›p 37°C’da bir gece bekletilmifltir. Ertesi gün, ste-ril fosfat tampon ile 660 nm’de optik dansitesi 0.5 olacak flekilde ayarlanan bakteri süspansiyo-nundan 20µl s›çanlar›n her iki burun deli¤inden verilmifltir (20).
‹ntraperitoneal uygulama ile sepsis modeli için, bakteriler LB agarda 37°C’da bir gece inkübe edildikten sonra oluflan koloniler beyin kalp in-füzyon s›v› besiyerine (Conda, ‹spanya) al›n-m›flt›r. 37°C’da 16-18 saatlik bekletildikten son-ra bu suspansiyon 1000 g’de 15 dakika santrifüj edilmifl, üst faz uzaklaflt›r›lm›flt›r. Pellet steril serum fizyolojik ile 2x1010 yo¤unlu¤a
getiril-mifl, bu süspansiyondan s›çanlara gruplar›na gö-re 0.5 ml intraperitoneal yol ile verilmifltir (17). Her iki uygulama modellerdeki kontrol grupla-r›na ise bakterisiz serum fizyolojik verilmifltir. ‹nokulasyon sonras› tüm s›çanlar; 21-22°C ›s›-da, 12 saat karanl›k ve 12 saat ayd›nl›k ortam›s›-da, serbest su ve g›da sa¤lanarak, stres ve gürültü-den izole bir flekilde bar›nd›r›lm›flt›r. ‹nokulas-yondan 24 saat sonra intraperitoneal yol ile 100 mg/kg ketamin hidroklorür (Ketalar, Pfizer) ve-rilerek hayatlar› sonland›r›lan s›çanlar›n akci¤er dokular› histopatolojik inceleme için %10 for-malin içine al›nm›flt›r.
Histopatolojik ‹nceleme: Akci¤er örnekleri oda ›s›s›nda, %10’luk formalin solüsyonu içinde 48 saat tespit edildikten sonra, artan oranda alkol serilerinden geçirilmifltir. Dokular, fleffaf k›lmak amac›yla, üç de¤iflim ksilole tabi tutulduktan sonra parafin içine gömülmüfltür. Mikrotom (Leica RM2255) yard›m›yla bloklardan 5µm kal›nl›¤›nda kesitler al›narak Hematoksi-len&Eozin (H&E) boyama uygulanm›fl, haz›rla-nan preparatlar Olympus BX-51 model ›fl›k mikroskobu ve video kameradan (Olympus DP71) oluflan görüntü analiz sistemi (DP Cont-roller Olympus Corp. 3.1.1.267) arac›l›¤›yla
bil-gisayar ekran›nda kaydedilmifltir. Histopatolojik de¤iflimler; kapiller konjesyon, hemoraji, poli-morf çekirdekli hücre infiltrasyonu ve alveoler septumda kal›nlaflma olarak de¤erlendirilmifltir. Oluflan hasar›n derecesi; 0: hasar yok, 1: hafif derecede hasar 2: orta derecede hasar, 3: fliddet-li hasar ve 4: maksimal hasar olarak skorlan-m›flt›r (21). Tüm preparatlar farkl› iki göz tara-f›ndan de¤erlendirilmifl ve de¤erlendirmeyi ya-pan araflt›rmac›lar çal›flma gruplar› konusunda bilgilendirilmemifltir.
‹statistiksel Analiz: P. aeruginosa PAO1, PAO JP2 ve kontrol gruplar›, ortalama akci¤er hasar skor sonuçlar› aç›s›ndan karfl›laflt›r›lm›fl, veriler SPSS 15.0 istatistik program›nda de¤erlendiril-mifltir. Grup ortalamalar› aras›ndaki fark Mann Whitney testi kullan›larak analiz edilmifl, p<0.05 anlaml›l›k düzeyi esas al›nm›flt›r.
BULGULAR
Bakteri inokulasyonundan 24 saat sonra, sakri-fiye edilen s›çanlar›n gö¤üs kafesi aç›ld›¤›nda kontrol grubunda makroskobik olarak bir de¤i-fliklik gözlenmezken, di¤er iki grupta her iki uy-gulama yönteminde de akci¤erde fokal kanama odaklar› ve apse oluflumlar› gözlenmifltir. Doku kesitlerinin histopatolojik de¤erlendirme sonuç-lar› ise makroskobik verileri desteklemifltir. Akci¤er dokusundan elde edilen H&E ile boyal› kesitlerdeki de¤erlendirme sonuçlar›na göre; hem PAO1 hem de PAO JP2 suflunun akci¤er dokusunda hasara yol açt›¤›, mutant suflun int-ranazal yol ile oluflturulan enfeksiyon modelin-de yapt›¤› hasar›n intraperitoneal yol ile olufltu-rulan enfeksiyon modelinden anlaml› olarak yüksek oldu¤u gözlenmifltir (Grafik 1). Intrana-zal uygulama ile PAO1 grubunda ortalama ha-sar skoru sonuçlar›, kontrol ve PAO JP2 grupla-r›na göre anlaml› olarak yüksek bulunmufltur.
Ortalama hasar skoru kontrol grubunda 0.1 ± 0.06, PAO1 grubunda 3.5 ± 0.14 ve PAO JP2 grubunda 2.9 ± 0.1 olarak belirlenmifltir. De-neysel sepsis modelinde de, PAO1 grubunda or-talama hasar skoru sonuçlar›n›n, kontrol ve PAO JP2 gruplar›na göre anlaml› olarak yüksek oldu¤u gözlenmifltir. Bu sonuçlar kontrol gru-bunda 0.05 ± 0.04, PAO1 grugru-bunda 3.7 ± 0.09 ve PAO JP2 grubunda 2.1 ± 0.12 olarak bulun-mufltur (Grafik 1).
Sufllar›n s›çanlara uygulanma yöntemine göre akci¤erde oluflturduklar› hasar›n türüne ve hasar skoruna bak›ld›¤›nda ise özellikle PAO JP2’nin intranazal uygulama ile akci¤er enfeksiyonu modelinde daha fazla hasara neden oldu¤u, al-veolar konjesyon ve septal kal›nlaflma
yönün-den enfeksiyon modelleri aras›nda anlaml› fark-l›l›k oldu¤u görülmüfltür (Tablo 1).
Gruplara ait akci¤er doku kesitlerinin ›fl›k mik-roskobu görüntüleri Resim 1’de gösterilmifltir.
TARTIfiMA
Son zamanlarda, P. aeruginosa enfeksiyonlar›n-da, bakteri, konak ve antibakteriyeller aras›nda-ki etaras›nda-kileflimi aç›klamak ve QS sisteminin enfek-siyon patogenezi üzerindeki etkilerini ortaya koymak amac›yla deneysel hayvan çal›flmalar› a¤›rl›k kazanm›flt›r. P. aeruginosa QS vahfli tip Grafik 1. Bakteri uygulama yöntemleri göre sufllar›n
akci¤erde oluflturduklar› hasar skorlar›
*‹ntraperitoneal uygulama grubuna göre anlaml› farkl›l›k
Resim 1. A: ‹ntranazal uygulama (A1; kontrol, A2; PAO JP2, A3; PAO1)
B: ‹ntraperitoneal uygulama (B1; kontrol, B2; PAO JP2, B3; PAO1)
(★): PMN infiltrasyonu; siyah oklar: septal kal›nlaflmas›; beyaz oklar: hemoraji odaklar
Tablo 1. Bakteri uygulama yöntemleri ve de¤erlendirme kriterlerine göre sufllar›n akci¤erde oluflturduklar› hasar kriterleri ve skorlar›
Akci¤er Hasar Deney Gruplar› ‹ntranazal ‹ntraperitoneal p
Skoru Kriteri Uygulama uygulama
Kontrol 0.0 ± 0.0 0.0 ± 0.0 1.00
Alveolar Konjesyon PAO1 (WT) 3.4 ± 0.2 3.0 ± 0.3 0.421
PAO JP2 2.8 ± 0.2* 1.6 ± 0.2 0.016 Kontrol 0.0 ± 0.0 0.0 ± 0.0 1.00 Hemoraji PAO1 (WT) 3.0 ± 0.3 4.0 ±0.0* 0.032 PAO JP2 2.6 ± 0.2 2.2 ± 0.2 0.31 Kontrol 0.2 ± 0.2 0.0 ± 0.0 0.69 PMN infiltrasyonu PAO1 (WT) 4.0 ± 0.0 4.0 ± 0.0 1.00 PAO JP2 3.4 ± 0.2 2.6 ± 0.2 0.095 Kontrol 0.2 ± 0.2 0.2 ± 0.2 1.00
Septal kal›nlaflma PAO1 (WT) 3.6 ± 0.4 3.8 ± 0.2 1.00
ve QS mutant sufllarla yap›lan çal›flmalar›n ortak noktas› genel olarak hayvan deneylerinde vahfli tip sufllar›n daha virülan oldu¤u yönündedir (12,18). Deneysel modellemeler aras›nda ise Cash ve arkadafllar› (19) taraf›ndan ilk kez uygu-lanan, agar içine emdirilmifl bakteri süspansiyon-lar›n›n trakeaya yerlefltirilmesi ile gerçeklefltiri-len kronik akci¤er enfeksiyonu modeli kabul görmüfl bir modeldir. Özellikle bakterilerin önemli virülans faktörlerinden biri olan biyofilm oluflumunun taklit edilmek istenildi¤i çal›flmalar-da tercih edilmektedir. Ancak bu yöntemin uygu-lamas›n›n tecrübe gerektirmesi ve uygulama s›ra-s›nda hayvanlarda mekanik t›kan›kl›¤a ba¤l› ola-rak yüksek oranda ölümlerin görülmesi yöntemin kullan›labilirli¤ini etkilemekte, araflt›rmac›lar› al-ternatif enfeksiyon modellerine yönlendirmekte-dir. Çal›flmam›zda s›çanlara intranazal ve intra-peritoneal uygulama ile P. aeruginosa PAO1 (QS WT) ve PAO JP2 (QS mutant; ∆lasI/∆rhlI) refe-rans laboratuvar sufllar› verilmifl, bu uygulamalar sonucunda akci¤er dokusundaki histopatolojik de¤iflikliklere QS sisteminin etkisi araflt›r›lm›flt›r. Enfeksiyon modellerinin oluflturulmas›ndan 24 saat sonra s›çanlar›n gö¤üs kafesi aç›ld›¤›nda gözlenen fokal kanama ve apse odaklar› makros-kobik olarak akci¤er hasar›n›n olufltu¤unu gös-termifl ve akci¤er doku kesitlerinde histopatolojik olarak yap›lan hasar skorlamas› bu veriyi destek-lemifltir. Skorlama için literatürde önerilen; kapil-ler konjesyon, hemoraji, polimorf çekirdekli hüc-re infiltrasyonu ve alveoler septumda kal›nlaflma kriterleri kantitatif olarak de¤erlendirilmifl ve gruplar aras›nda karfl›laflt›rma yap›lm›flt›r (21). Analiz sonucunda her iki uygulama yönteminde de, daha önce agar boncuk yöntemini uygulad›-¤›m›z çal›flmam›zda saptad›uygulad›-¤›m›z (18) histopato-lojik de¤iflikliklerin olufltu¤u gözlemlenmifltir. Bu bulgular ›fl›¤›nda akci¤er enfeksiyonu model-lerinin oluflturulmas›nda, e¤er biyofilm oluflumu
taklit edilmek istenmiyorsa uygulamas› kolay olan bu iki deneysel modelin, araflt›r›lacak konu da dikkate al›narak kullan›labilece¤ini düflün-mekteyiz. Ancak burada dikkat edilmesi gereken bir nokta de¤erlendirmenin bakteri uygulamas›n-dan 24 saat sonra yap›lm›fl olmas›d›r. Bu uygula-ma yöntemlerinde, bakteri do¤rudan vücudun sa-vunma sistemi ile karfl›laflt›¤›ndan varl›¤›n› sür-düremeyebilece¤i bildirilmektedir (19). Bu ko-nuda, bakteri uygulamas›ndan sonra farkl› zaman dilimlerinde hayvanlar›n hayatlar›n›n sonland›r›l-mas› ve akci¤er hasar skorlar›n›n de¤erlendiril-mesi fikir verebilir.
Çal›flmam›zda gerek intranazal gerekse intrape-ritoneal bakteri uygulamas› sonucu akci¤erde oluflan hasara bak›ld›¤›nda, literatürle uyumlu olarak vahfli tip suflun hasar skorunun mutant sufla göre anlaml› olarak yüksek oldu¤u belir-lenmifltir. Bu durumun QS mutant sufllar›n bu sistemin kontrolü alt›ndaki virülans faktörlerin-den yoksun olmas› dolay›s›yla daha az virülan olmas›ndan kaynakland›¤› düflünülmektedir. Sufllar›n uygulama yöntemine göre davran›fllar›-na bak›ld›¤›nda ise; vahfli tip suflun intraperito-neal uygulama yönteminde daha fazla hemoraji-ye neden oldu¤u, di¤er de¤erlendirme kriterleri aç›s›ndan bir farkl›l›k göstermedi¤i belirlenmifl-tir. Mutant suflun intranazal uygulama yönte-minde daha fazla akci¤er hasar›na neden oldu-¤u, kriterlere tek tek bak›ld›¤›nda ise akci¤er dokusunda alveolar konjesyon ve septal kal›n-laflman›n belirgin olarak artt›¤› görülmüfltür. Uygulama yöntemlerine göre oluflan bu farkl›l›-¤›n nedeni "tek hava yolu" prensibi ile aç›klana-bilir (23). Bu prensibe göre solunum sistemi mukozas› birbirinin devam›d›r; burundan bafllar ve alveollere kadar uzan›r. Dolay›s›yla intrana-zal uygulanan suflun intraperitoneale göre hasar skorlar›n›n daha yüksek olmas› bakterinin do¤-rudan akci¤ere ulaflmas› ile iliflkili olabilir.
Çal›flmam›zda, QS sistemi mutant köken de, vahfli tip kökene göre daha az olmakla birlikte belirgin bir akci¤er hasar› oluflturmufltur. Kara-tuna ve arkadafllar› (24) da P. aeruginosa’n›n neden oldu¤u solunum sistemi enfeksiyonlar›n-da, QS anahtar rol oynamakla birlikte, QS mutant sufllar›n da antimikrobiyal ajanlara karfl› duyarl›l›¤›n›n düflük olabildi¤ini ve bu sufl-lar›n enfeksiyona neden olabildiklerini belirt-mifllerdir.
Sonuç olarak bu çal›flmada s›çanlara intranazal ve intraperitoneal yol ile verilen P. aerugino-sa’n›n 24 saat içinde akci¤erde makroskobik ve mikroskobik düzeyde hasar oluflturdu¤u göste-rilmifltir. Uygulamas› kolay olan bu yöntemler QS sisteminin yan› s›ra çeflitli virülans faktörle-rinin etkilerini incelemede de yararl› olacakt›r. Her iki uygulama yönteminde de akci¤er hasa-r›nda QS sistemi önemli rol oynamakla birlikte, QS mutant sufllar›n da hasar oluflturmas› pato-genezde farkl› yönlerin de oldu¤unu düflündür-mektedir.
TEfiEKKÜR
Bu çal›flmada kullan›lan referans laboratuvar sufllar› için Prof Dr Hüseyin Bask›n’a teflekkür ederiz.
‹letiflim / Correspondence Meral Kahraman
Dokuz Eylül Üniversitesi
T›p Fakültesi, Multidisipliner Laboratuvar›, ‹zmir e-mail: meral.karaman@deu.edu.tr
Kaynaklar
1. Lyczak JB, Cannon CL, Pier GB. Establishment of Pseudomonas aeruginosa infection: lessons from a versatile opportunist. Microbes Infect 2000; 2:1051-60. 2. Crouch BS, Wunderink RG, Jones CB.
Ventilator-associated pneumonia due to Pseudomonas aeruginosa. Chest 1996; 109:1019-29.
3. Fuqua C, Winans SC, Greenberg EP. Quorum sensing in bacteria: the LuxR-LuxI family of cell density-responsive transcriptional regulators. J Bacteriol 1994;176:269–75.
4. Williams P, Winzer K, Chan WC, Cámara M. Look who's talking: communication and quorum sensing in the bacterial world. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci 2007; 362:1119-34.
5. Favre-Bonté S, Chamot E, Köhler T, Romand JA, Van Delden C. Autoinducer production and quorum-sensing dependent phenotypes of Pseudomonas aeruginosa vary according to isolation site during colonization of intubated patients. BMC Microbiol 2007; 18:33. 6. McKnight SL, Iglewski BH, Pesci EC. The Pseudomonas
quinolone signal regulates rhl quorum sensing in Pseudomonas aeruginosa. J Bacteriol 2000; 182:2702–8. 7. Gambello MJ, Iglewski BH. Cloning and characterization
of the Pseudomonas aeruginosa lasR gene, a transcriptional activator of elastase production. J Bacteriol 1991; 173:3000–9.
8. Ochsner UA, Koch AK, Fiechter A, Reiser J. Isolation and characterization of a regulatory gene affecting rhamnolipid biosurfactant synthesis in Pseudomonas aeruginosa. J Bacteriol 1994; 176:2044–54.
9. Duan K, Surette MG. Environmental regulation of Pseudomonas aeruginosa PAO1 Las and Rhl quorum-sensing systems. J Bacteriol 2007; 189:4827-36. 10. Diggle SP, Winzer K, Chhabra SR, Worrall KE, Cámara M, Williams P. The Pseudomonas aeruginosa quinolone signal molecule overcomes the cell density-dependency of the quorum sensing hierarchy, regulates rhl-dependent genes at the onset of stationary phase and can be produced in the absence of LasR. Mol Microbiol 2003; 50:29-43.
11. Wilder CN, Diggle SP, Schuster M. Cooperation and cheating in Pseudomonas aeruginosa: the roles of the las, rhl and pqs quorum-sensing systems. ISME J 10.1038/ismej.2011.13
12. Costerton JW, Stewart PS, Greenberg EP. Bacterial biofilms: A common cause of persistent infections. Science 1999; 284:1318-22.
13. López D, Vlamakis H, Kolter R. Biofilms. Cold Spring Harb Perspect Biol 2010; 2:1-11.
14. Pearson JP, Pesci EC, Iglewski BH. Roles of Pseudomonas aeruginosa las and rhl quorum-sensing systems in control of elastase and rhamnolipid biosynthesis genes. J Bacteriol 1997; 179:5756-67. 15. Bayrakal V, Bask›n H, Bahar ‹H. Deneysel mikroçevre
modelleme çal›flmas›: Pseudomonas aeruginosa’n›n farkl› hücre dizilerinde ço¤unlu¤u alg›lama ve biyofilm yan›tlar›. Turkiye Klinikleri 2009; 29:637-42. 16. Tang HB, DiMango E, Bryan R et al. Contribution of specific P. aeruginosa virulence factors to pathogenesis of pneumonia in a neonatal mouse model of infection. Infect Immun 1996; 64:37-43.
17. Cirioni O, Ghiselli R, Orlando F et al. Efficacy of colistin/rifampin combination in experimental rat models of sepsis due to a multiresistant Pseudomonas aeruginosa strain. Crit Care Med 2007; 35:1717-23. 18. Karaman M, Y›lmaz O, Bayrakal V, Bahar ‹H.
Gentamisin ve imipenem etkisinde Pseudomonas aeruginosa quorum sensing yan›tlar› ve biyofilm üretimi: in vivo modelleme. ANKEM Derg 2010; 24:76-81. 19. Cash HA, Woods DE, McCullough B, Johanson WG,
Bass JA. A rat model of chronic respiratory infection with Pseudomonas aeruginosa. Am Rev Respir Dis 1979; 119: 453–9.
20. Smith RS, Harris SG, Phipps R, Iglewski B. The Pseudomonas aeruginosa quorum-sensing molecule N-(3-oxododecanoyl)homoserine lactone contributes to virulence and induces inflammation in vivo. J Bacteriol 2002; 184:1132-9.
21. Jerng JS, Hsu YC, Wu HD et al. Role of the renin-angiotensin system in ventilator-induced lung injury: an in vivo study in a rat model. Thorax 2007;62:527–35. 22. Pesci EC, Pearson JP, Seed PC, Iglewski BH. Regulation
of las and rhl quorum sensing in P. aeruginosa. J Bacteriol 1997; 179:3127–32.
23. Volcheck GW. Does rhinitis lead to asthma? Evidence for the one-airway hypothesis. Postgrad Med 2004; 115:65-8.
24. Karatuna O, Ya¤c› A. Analysis of the quorum sensing-dependent virulence factor production and its relationship with antimicrobial susceptibility in Pseudomonas aeruginosa respiratory isolates. Clin Microbiol Infect 2010; 16:1770-5.
