Background: Lung injury occurs following lower limb reperfu-sion due to neutrophil infiltration and free oxygen radicals. Melatonin, the chief secretory product of the pineal gland, plays a role in the regulation of various physiological and neuroen-docrine functions. In this study, injury in the lungs due to exper-imental lower extremity ischemia-reperfusion (I-R) and the pro-tective effect of melatonin were investigated.
Methods: Forty male New Zealand white rabbits were used in the study. Rabbits were randomly divided into four groups: Group 1 (sham group, n=10), group 2 (I-R group without treatment, n=10), group 3 (preischemia treatment group, n=10), group 4 (prereperfu-sion treatment group, n=10). Only anesthesia was performed to rab-bits in group 1 and after 6 hours blood and tissue samples were taken. In groups 2, 3 and 4, after anesthesia tourniquets were applied to bilateral hind limbs at the hip level. After 4 hours of ischemia, the tourniquets were removed and following two hours of reperfusion period, blood and tissue samples were taken. Melatonin (10 mg/kg) was administered intraperitoneally 15 minutes before ischemia to group 3, and 15 minutes before reperfusion to group 4. Plasma malondialdehyde (MDA) levels were measured in blood samples and lung tissue MDA levels were determined. Additionally, lung tissue was examined histopathologically. Results: The levels of tissue and plasma MDA were found to be significantly lower in group 4 when compared to groups 2 and 3 (p<0.01). Histopathological examination revealed a lower neu-trophil count, less interstitial edema and congestion in group 4 (p<0.01), in which the septums between the alveoli were also thinner.
Conclusion: Administration of melatonin before reperfusion decreased the lung injury caused by temporary lower extremity ischemia-reperfusion. Melatonin exerts these effects by inhibit-ing lipid peroxidation and neutrophil infiltration.
Key words: Lung/pathology; melatonin/therapeutic use; reperfusion injury.
Alt ekstremite iskemi reperfüzyonunun yol açt›¤› akci¤er hasar›nda
melatoninin koruyucu etkinli¤i
Protective effect of melatonin on lung injury caused by ischemia-reperfusion of the lower extremities
Ayhan Uysal,1Oktay Burma,1‹lker Akar,1Kadir Kaan Özsin,1Ali Rahman,1Bilal Üstünda¤,2Hanifi ‹brahim Özercan3
F›rat Üniversitesi T›p Fakültesi, 1Kalp ve Damar Cerrahisi Anabilim Dal›, 2Biyokimya Anabilim Dal›, 3Patoloji Anabilim Dal›, Elaz›¤
Amaç: Alt ekstremite iskemi sonras› reperfüzyon döneminde nötrofil infiltrasyonuna ve serbest oksijen radikallerine ba¤l› ola-rak akci¤er hasar› oluflmaktad›r. Bafll›ca pineal bezden salg›lanan melatonin, çeflitli fizyolojik ve nöroendokrin fonksiyonlar›n dü-zenlenmesinde rol oynar. Bu çal›flmada, deneysel alt ekstremite iskemi-reperfüzyonuna (‹-R) ba¤l› oluflan akci¤er hasar› ve bun-lar› önlemede melatoninin koruyucu etkisi araflt›r›ld›.
Çal›flma plan›: Çal›flmada, 40 adet Yeni Zelanda cinsi beyaz erkek tavflan kullan›ld›. Tavflanlar rasgele dört gruba ayr›ld›: Grup 1 (sham grubu, n=10), grup 2 (I-R grubu, n=10), grup 3 (preiskemik tedavi grubu, n=10) ve grup 4 (prereperfüzyon te-davi grubu, n=10). Grup 1’de sadece anestezi uyguland› ve 6 saat bekleme sonras› kan ve doku örnekleri al›nd›. Grup 2, 3 ve 4’de anestezi verildikten sonra iki tarafl› arka ekstremite, kalça eklemi hizas›ndan turnike ile s›k›ld›. Dört saat iskemi sa¤land›ktan sonra turnike aç›ld› ve iki saat reperfüzyon son-ras› kan-doku örnekleri al›nd›. Melatonin, grup 3’te iskemiden ve grup 4’te reperfüzyondan 15 dakika önce 10 mg/kg intra-peritoneal yolla verildi. Al›nan kan örneklerinde plazma ma-londialdehit (MDA), akci¤er dokusunda ise doku MDA dü-zeyleri saptand›. Ayr›ca akci¤erler histopatolojik olarak ince-lendi.
Bulgular: Doku ve plazma MDA seviyeleri grup 4’te grup 2 ve grup 3’e göre anlaml› derecede daha düflük bulundu (p<0.01). Histopatolojik incelemede reperfüzyondan hemen önce melato-nin verilen grupta (grup 4) nötrofil say›s› ile interstisyel ödem ve konjesyonun daha az, alveoller aras› septumlar›n daha ince oldu-¤u saptand› (p<0.01).
Sonuç: Reperfüzyondan önce melatonin kullan›m›, alt ekstremi-te geçici iskemi-reperfüzyonuna ba¤l› akci¤erlerde oluflan hasar› azaltmaktad›r. Bunu da lipid peroksidasyonunu önleyerek ve nöt-rofil infiltrasyonunu azaltarak gerçeklefltirmektedir.
Anahtar sözcükler: Akci¤er/patoloji; melatonin/tedavide kullan›m; re-perfüzyon hasar›.
Gelifl tarihi: 16 Mart 2005 Kabul tarihi: 1 Kas›m 2005
Alt ekstremite iskemi-reperfüzyonu s›k karfl›lafl›lan ve klinik aç›dan önemli sonuçlar› olan bir olayd›r. ‹ske-mi sonras› reperfüzyonla birlikte serbest oksijen radi-kalleri (SOR) ve inflamatuvar mediatörlerin etkisiyle hem lokal hem de sistemik hasar oluflumu bafllam›fl olur.[1]
Kan ak›m›n›n yeniden sa¤lanmas› ekstremiteyi kurtarmas›na karfl›n, multisistem organ disfonksiyonu geliflimine ve mortaliteye neden olabilmektedir. Bu ha-sar özellikle miyokard dokusunda, böbreklerde ve
akci-¤erlerde gözlenebilir.[2]
Akci¤er dokusu alt ekstremite iskemi reperfüzyon hasar›ndan en çok etkilenen hedef organ olup oluflan hasar sonucu baz› olgularda uzam›fl ventilatör ve inotropik destek gereksinimine,
dolay›s›y-la da mortaliteye neden odolay›s›y-labilmektedir.[3]
Bu hasar›n ön-lenmesi veya azalt›lmas›na yönelik pek çok ilaç ve yön-tem denenmifltir.
Melatonin bir indolamin türevi olup sirkadiyen ri-timle sal›n›m gösteren pineal bez hormonudur. Son y›l-larda yap›lan çal›flmay›l-larda melatoninin kardiyoprotek-tif, nöroprotekkardiyoprotek-tif, antiinflamatuvar, antikanserojen, analjezik özellikleri oldu¤u ve vücut ›s›s›, kan bas›nc›, gonadal fonksiyonlar ile uyku uyan›kl›k siklusunu
dü-zenlemede etkinli¤inin bulundu¤u gösterilmifltir.[4-6]Bu
etkilerin baz›lar›n›n melatoninin hem do¤rudan serbest oksijen radikali (SOR) temizleyici hem de dolayl› ola-rak antioksidan enzim aktivitelerini art›r›c› özelli¤inden
kaynakland›¤› bilinmektedir.[7]
Bu çal›flmada, deneysel alt ekstremite iskemi-reper-füzyon modelinde geliflen akci¤er hasar›n› önlemede farmakolojik olarak uygulanan melatoninin etkinli¤i araflt›r›ld›.
GEREÇ VE YÖNTEM
Çal›flmada a¤›rl›klar› 2400-2800 gram aras›nda de-¤iflen 40 adet Yeni Zelanda cinsi sa¤l›kl› beyaz erkek tavflan kullan›ld›.
Denekler rasgele dört gruba ayr›ld›;
Grup 1 (G1, sham grubu, n=10); sadece anestezi uy-gulan›p alt› saat beklemeden sonra kan ve doku örnek-leri al›nan grup.
Grup 2 (G2, iskemi/reperfüzyon=kontrol grubu, n=10); dört saat iskemiyi takiben iki saat reperfüzyon uyguland›ktan sonra kan-doku örnekleri al›nan grup.
Grup 3 (G3, preiskemik tedavi grubu, n=10); iske-miden 15 dakika önce 10 mg/kg melatonin uygulan›p, dört saat iskemi ve iki saat reperfüzyon sonras› kan-do-ku örnekleri al›nan grup.
Grup 4 (G4, prereperfüzyon tedavi grubu, n=10); dört saat iskemi bitiminde reperfüzyonun bafllamas›ndan 15 dakika önce 10 mg/kg melatonin uygulan›p iki saat-lik reperfüzyon sonunda kan-doku örnekleri al›nan grup.
Anestezi tekni¤i. Anestezi, 50 mg/kg ketamin hid-roklorür (Ketalar flk, Eczac›bafl›, Türkiye) ve 2 mg/kg ksilazin hidrokhlorid (Rompun flk, Bayer, Türkiye) int-ramüskuler yolla uygulanarak sa¤land›. Tavflanlar ge-rekti¤inde ilk dozun 1/3’ü ilave dozlar ile ifllem boyun-ca solunumlar› spontan devam edecek flekilde uyutuldu. Cerrahi teknik ve örneklerin al›nmas›. Tavflanlar›n deneyden sekiz saat önce sadece su içmelerine izin ve-rilip yemleri kesildi. Sham grubu d›fl›ndaki tüm denek-lerde her iki bacak iki dakika süreyle elevasyonda tutu-lup bacakta kalan kan miktar› minimale indirildi. Hardy
ve ark.n›n[8]tarif etti¤i, akut iskemi-reperfüzyon
mode-line uygun olarak kollateral ve femoral arter ak›mlar›n› durdurmak amac›yla, her iki alt ekstremitede torakanter majörün proksimal k›sm›ndan geçecek flekilde turnike uygulanarak iki tarafl› alt ekstremite iskemisi oluflturul-du. Denekler s›rtüstü pozisyona getirildi. Arteriyal ak›-m›n durduruldu¤u portatif doppler cihaz› (Promelec, Microdop, Norm. IEC 601.1, France) ile tespit edildi. Dört saatlik iskemi süresi tamamland›ktan sonra turni-ke aç›larak reperfüzyon bafllat›ld›, reperfüzyonun 10. dakikas›nda yine portabl doppler cihaz› ile kan ak›m›-n›n bafllam›fl oldu¤u teyit edildi. Grup 2’deki deneklere herhangi bir tedavi verilmedi. Grup 3’te iskemi olufltu-rulmadan 15 dakika önce, Grup 4’te iskemi devam ederken turnike aç›lmas›ndan 15 dakika önce 10 mg/kg N-asetil 5-Metoksitriptamin (Melatonin, 1 gr flk, Sigma Chemical Co, USA) intraperitoneal olarak uyguland›. ‹ki saatlik reperfüzyon süresi sonunda gö¤üs tüyleri t›-rafl edilerek ameliyat sahas› %10 povidin iyodin (Pol-yod, Drogsan, Türkiye) ile temizlendi. Yaln›zca insiz-yon sahas› aç›k kalacak flekilde steril olarak örtüldü ve steril aletler kullan›larak median sternotomi uyguland›. Sternum aç›ld›ktan sonra perikard insizyonu uygu-land›. Kalbe yap›lan direkt ponksiyonla 3 ml kan al›na-rak EDTA’l› (Etilendiamintetraasetik asit) tüplere ko-yuldu. Ard›ndan tüm denekler intrakardiyak %10’luk formol ile sakrifiye edildi.
Trakea kesilerek akci¤erler ve kalp blok halde ç›ka-r›ld›. Kalp apeksten kesildi ve sa¤ atriumdan sokulan kateterden verilen deiyonize su ile pulmoner arteriyel yatak, venöz dönüfl berrak oluncaya kadar y›kand›. Do-ku malondialdehit (MDA) analizinde Do-kullan›lacak olan sa¤ akci¤er, 10 ml serum fizyolojik solüsyonu içerisin-de y›kand›ktan sonra alüminyum folyo ile sar›larak ça-l›flma yap›l›ncaya kadar -70 °C de sakland›.
Histopatolojik inceleme yap›lacak olan sol akci¤er ise y›kama ifllemine tabi tutulmadan %10’luk formalde-hit solüsyonu içine koyuldu ve patoloji laboratuvar›na gönderildi.
plazma al›narak plazma MDA çal›flmas› için –20 °C’de sakland›.
Örneklerin biyokimyasal olarak incelenmesi Plazma malondialdehit tayini. Lipid peroksidasyo-nunun son ürünü olan MDA, 95 °C’de MDA’n›n tiyo-barbitürik asit ile reaksiyonu sonucu pH: 3.4 olan bir or-tamda inkübasyonuyla oluflan pembe renkli kompleksin 532 nm’de spektrofotometrik (Schimadzu UV-1201, Ja-pan) ölçülmesiyle saptand›. Ölçülen plazma MDA
de-¤eri nmol/ml olarak ifade edildi.[9,10]
Doku MDA düzeyi ölçümü. Doku MDA miktar›,
Wasowicz ve ark.n›n[11] tarif etti¤i yönteme göre yafl
gram doku bafl›na normal olarak hesapland›.
Histopatolojik de¤erlendirme. Tüm gruplar›n al›-nan sol akci¤er örnekleri %10’luk formol içinde tespit edilerek rutin takip ifllemlerinden geçirildi. Parafin bloklara gömülen dokulardan 4 µm kal›nl›¤›nda seri ke-sitler al›nd›. Al›nan keke-sitler deparafinize edilerek He-motoksilen-Eozin (H-E) ile boyanarak ›fl›k mikrosko-bunda de¤erlendirildi. Büyütme alan› içerisinde bulu-nan akci¤er dokusundaki nötrofil (PNL) yo¤unlu¤u, konjesyon ve interstisyel ödem semikantitatif olarak
de-¤erlendirildi. Daha önce Tossiopoulos ve ark.n›n[12]
kul-land›klar› skorlama sistemi modifiye edilerek akci¤er-lerde oluflan hasar›n miktar› saptand›. Buna göre 0 puan de¤ifliklik yok; 1 puan fokal, hafif de¤ifliklikler; 2 puan multifokal orta dereceli de¤ifliklikler; 3 puan multifokal belirgin de¤ifliklikler; 4 puan yayg›n belirgin de¤ifliklik-ler olarak de¤erlendirildi. Sonuçlar ortalama ± SD ola-rak ifade edildi.
‹statistiksel de¤erlendirme. ‹statistiksel de¤erlen-dirmeler bilgisayarda SPSS 10.0 (Statistical Program-me Software System) program› kullan›larak yap›ld›. Grup içi de¤erlendirmede Mann Whitney U-testi, grup-lar aras› karfl›laflt›rmada ise tek yönlü varyans analizi Kruskal-Wallis testleri kullan›ld›. P<0.05 de¤erleri an-laml› kabul edildi. Elde edilen veriler ortalama ± SD olarak gösterildi.
BULGULAR
fiekil 1’de plazma MDA düzeylerinin tüm gruplar aras›ndaki karfl›laflt›r›lmalar› gösterildi. Grup 2 ile grup 4 karfl›laflt›r›ld›¤›nda aralar›nda anlaml› derecede fark saptand› (p<0.01). Grup 2 ile grup 3 aras›nda istatistik-sel olarak anlaml› fark yoktu.
fiekil 2’de akci¤er doku MDA düzeylerinin tüm gruplar aras›ndaki karfl›laflt›r›lmalar› gösterildi.
Plazma MDA (nmol/ml)
0.21±0.02a,c
0.43±0.03b
0.52±0.09c
0.29±0.07a
Grup 1 Grup 2 Grup 3 Grup 4 1
0.5
0
fiekil 1. Plazma MDA düzeyleri (a
p<0.05 grup 1 ile grup 4; b
p<0.01
grup 2 ile grup 4; cp<0.001 grup 1 ile grup 2 ve 3; grup 3 ile grup 4).
Doku MDA (nmol/g doku)
7.35±1.02c
12.86±2.37b
11.94±1.97a
8.85±2.31
Grup 1 Grup 2 Grup 3 Grup 4 0
fiekil 2. Akci¤er dokusu MDA düzeyleri (ap<0.05 grup 3 ile grup
4; bp<0.01 grup 2 ile grup 4; cp<0.001 grup 1 ile grup 2 ve 3).
18 2 4 6 8 10 12 14 16
Doku hasar› (skoru) 1.1±0.73b
2.8±0.89 2.7±0.82
1.51±0.67a
Grup 1 Grup 2 Grup 3 Grup 4 4
0
fiekil 3. Doku hasar› de¤erleri (ap<0.01 grup 4 ile grup 2 ve 3;
bp<0.001 grup 1 ile grup 2 ve 3).
2 6 8 17.1±3.2a 41.3±4.4 40.1±4.2 19.1±3.1a
Grup 1 Grup 2 Grup 3 Grup 4 0
fiekil 4. Akci¤er lökosit de¤erleri (ap<0.001 grup 1 ile grup 2 ve
3; grup 4 ile grup 2 ve 3).
10 20 30 40 50 60
Doku MDA düzeylerinin sham grubuna göre di¤er bütün gruplarda artm›fl oldu¤u görüldü. Sham grubu ile karfl›laflt›r›ld›¤›nda grup 2 ve grup 3’teki art›fl istatistik-sel olarak anlaml› iken (p<0.001), grup 4’teki art›fl›n is-tatistiksel olarak anlaml› olmad›¤› görüldü (p>0.05). ‹s-kemi-reperfüzyon uygulanan gruplardan grup 4 ile grup 2 ve grup 3 karfl›laflt›r›ld›¤›nda grup 4’teki doku MDA de¤erlerindeki art›fl›n istatistiksel olarak anlaml› dere-cede az oldu¤u saptand› (grup 2 için p<0.01 ve grup 3 için p<0.05). Grup 2 ve grup 3 aras›nda ise istatistiksel fark saptanmad› (p>0.05).
Tüm gruplar›n hasar skor puan de¤erleri ile lökosit say›lar› ve da¤›l›mlar› fiekil 3 ve 4’te görülmektedir.
Sham grubunda yap›lan histopatolojik de¤erlendir-mede normale yak›n bir akci¤er dokusu görüldü (fiekil 5). Sham grubunda daha az PNL birikimi ile alveoller septumlar›n ince oldu¤u görülürken, interstisyel ödem ve konjesyon gözlenmedi. ‹skemi-reperfüzyon grubun-da (grup 2) alveoller aras› septumgrubun-da belirgin kal›nlafl-ma, PNL say›s›nda artkal›nlafl-ma, yayg›n interstisyel ödem ve konjesyon saptand› (fiekil 6). Reperfüzyondan hemen önce melatonin verilen grupta (grup 4) ise PNL say›s›-n›n, interstisyel ödemin ve konjesyonun daha az ve al-veoller aras› septumlar›n daha ince oldu¤u görüldü (fiekil 7).
Akci¤erlerdeki patolojik de¤iflikliklerin derecesini ifade edebilmek için kullan›lan semikantitatif de¤erlen-dirmede hesaplanan hasar skor puan›nda en düflük de-¤erin sham grubunda (grup 1) oldu¤u görüldü. Bu gru-bun hasar skor puan› 1.1 olarak bulundu. ‹skemi-reper-füzyon grubunda (grup 2) hasar skor puan› 2.8, grup 3’de ise 2.7 olarak hesapland›. Sham grubu ile grup 2 ve grup 3 hasar skor puanlar› yönünden karfl›laflt›r›ld›kla-r›nda aralakarfl›laflt›r›ld›kla-r›nda istatistiksel olarak anlaml› fark saptan-d› (p<0.001). Reperfüzyondan önce melatonin verilen grupta (grup 4) hasar skor puan› 1.51 olarak bulundu. grup 4 ile grup 2 ve grup 3 karfl›laflt›r›ld›¤›nda yine is-tatistiksel olarak anlaml› fark oldu¤u görüldü (p<0.01).
TARTIfiMA
Ekstremite iskemisi periferik vasküler cerrahi, aort cerrahisi, ekstremitelerin reimplantasyonu, crush injuri, periferal vasküler yaralanmalar ya da akut arteriyel t›-kan›kl›klar s›ras›nda karfl›lafl›lan bir durumdur.
Akut ekstremite iskemisi kollaterallerin geliflmifl ol-du¤u kronik ateroskleroz varl›¤›nda bile ciddi mortalite ve morbiditeye yol açabilen klinik bir sorundur. Ekstre-mite reperfüzyonu tam olarak sa¤lansa bile ekstreEkstre-mite kayb›na, akut böbrek ve solunum yetmezli¤ine yol aça-bilir. Kalp, ba¤›rsak, beyin, dalak gibi dokularda
fonk-siyon bozuklu¤u geliflebilir.[13,14] Cerrahi müdahalenin
gecikmesi bu riskleri daha da art›r›r.
Alt ekstremitelerde oluflan geçici iskemi-reperfüz-yon hasar› sonucunda di¤er hedef organlarda oldu¤u gi-bi akci¤erlerde de önemli ölçüde patolojik
de¤ifliklikle-rin olufltu¤u çeflitli çal›flmalarda gösterilmifltir.[15-17] Bu
durum baz› olgularda uzam›fl ventilatör ve inotropik
destek gereksinimine neden olabilmektedir.[3]
Akci¤er-deki de¤iflikliklerin akut respiratuvar distres sendromlu hastalarda görülenlere benzer ve multipl organ
yetmez-li¤inin bir parças› oldu¤u belirtilmifltir.[1,18] Oluflan bu
patolojik de¤iflikliklere reperfüzyona ba¤l› olarak geli-flen toksik maddelerin neden olduklar› ileri sürülmekte fiekil 5. Grup 1 (sham) deneklere ait akci¤er dokusu (H-E x 100).
fiekil 6. Grup 2 (iskemi / reperfüzyon = kontrol grubu) denekle-re ait akci¤er dokusu (H-E x 100).
ve bu toksik maddelerin ortadan kald›r›lmas›n› da içe-ren bir çok tedavi yöntemi iskemi-reperfüzyona ba¤l›
doku hasar›n› önlemek için kullan›lmaktad›r.[18]
Akci¤er hasar›na neden olan proçesler akci¤erden tamamen uzak bir alanda bafllar. ‹skemi reperfüzyon ha-sar›n›n temelinde reperfüzyon s›ras›nda dokunun oksi-jenizasyonu sonucu ortaya ç›kan oksijen radikalleri
bu-lunmaktad›r.[19] Reaktif oksijen radikalleri birçok
kay-naktan sal›nabilirken bunlar›n aras›nda en önemli olan›
aktive olmufl nötrofillerdir.[18,20] Reperfüzyon süreci,
is-kemik alanda oluflan serbest radikallerin sistemik dola-fl›ma kar›flmas›na neden olur. Bunlar da ya direkt olarak hasar› bafllat›r ya da indirekt olarak nötrofillerin akti-vasyonu ve sitokinlerin üretimi için bir stimulan etki gösterir. Bu mediatörlerin ço¤u nötrofil-endotel etkile-flimini sa¤layarak nötrofillerin dokulara migrasyonuna yol açmakta ve göç eden nötrofiller degranüle olarak
dokuya hasar vermektedir.[18,21,22] Degranülasyon
sonra-s›nda artan serbest oksijen radikalleri ile proteazlar ak-ci¤er endotel hasar›na ve buna ba¤l› olarak artm›fl
pul-moner kapiller permeabiliteye sebep olurlar.[23]
Günümüzde iskemi-reperfüzyon sonras›nda ortaya ç›kan serbest oksijen radikallerinin olumsuz etkilerini ortadan kald›rmak için süperoksit dismutaz, allopüri-nol, katalaz, mannitol, vitamin C, pravastatin, alfa toko-ferol, L-karnitin, pentoksifilin gibi çeflitli maddeler te-davide denenmifl ve etkili olduklar› gösterilmifltir. Bu antioksidan maddelerin ya pulmoner mikrovasküler permeabilite art›fl› ve nötrofil akümülasyonunu önleye-rek ya da antioksidan sistemi aktive etmek suretiyle, is-kemi-reperfüzyon sonras›nda ortaya ç›kan uzak doku-organ hasar›na karfl› koruyucu etkiye sahip olduklar› gösterilmifltir.[24-29]
Bu çal›flmam›zda antioksidan etkisi çeflitli çal›flma-larda kan›tlanm›fl olan melatoninin, iskelet kas› iskemi-reperfüzyon hasar›n› azalt›c› etkisi ve vücutta nötrofil havuzunun %50-60’›n› ihtiva etmesi nedeniyle de alt ekstremite iskemi-reperfüzyon hasar›ndan en çok etki-lenen uzak organ olarak bilinen akci¤erler üzerine koru-yucu etkisinin olup olmad›¤›n› araflt›rd›k.
Melatonin direkt radikal giderici bir antioksidand›r. Hidroksil radikali, singlet oksijen, peroksil radikali ve sü-peroksit anyonu gibi organizma için toksik olan serbest oksijen radikalleri ile reaksiyona girerek, bunlar› vücut
için zarars›z olan maddelere dönüfltürür.[7,30,31] Melatonin
hem ya¤da hem de suda çözünebildi¤inden dolay› vücu-dun her hücresine, sitozole ve mitokondri gibi hücre içerisindeki di¤er yap›lara kolayl›kla girer. Bu özelli¤i nedeniyle vitamin ve mineral antioksidanlara göre çok daha etkilidir. Melatoninin E vitamininden iki kat ve glu-tatyona göre befl kat daha etkili antioksidan oldu¤u
gös-terilmifltir.[4,32]Ayr›ca melatonin süperoksit dismutaz,
glu-tatyon peroksidaz, gluglu-tatyon redüktaz, glukoz-6-fosfat
dehidrojenaz gibi antioksidan enzimleri uyararak ve nit-rik oksit sentetaz gibi prooksidatif enzimleri bask›layarak
dolayl› antioksidan etki göstermektedir.[32]
‹skelet kas› iskemi-reperfüzyon hasar› ile akci¤erler-de oluflan uzak organ hasar›n›n gösterilmesi amac›yla
s›kl›kla turnike yöntemi kullan›lmaktad›r.[33-35] Deneysel
iskelet kas› iskemisi çal›flmalar›nda turnike uygulamas›-n›n yan› s›ra aort ve femoral arterlerde geçici olarak kan ak›m›n›n engellenmesi gibi çeflitli yöntemler de kullan›l-m›flt›r.[36]
Ancak bu yöntemlerle tam bir iskeminin sa¤-lanmas› için kollateral damarlar›n tek tek ligasyonu ge-rekmekte bu da ço¤u zaman mümkün olamamaktad›r. Turnike modeli ise alt ekstremiteye olan kan ak›m›n›
to-tale yak›n (%98) engellemektedir.[37]Arteriyel ak›mdaki
bu submaksimal azalman›n insandaki akut arteriyel t›-kanma ile benzerlik gösterdi¤i düflünülmektedir. Biz de çal›flmam›zda total iskemi oluflturmas› ve uygulama ko-layl›¤› olmas› nedeniyle turnike modelini kulland›k.
Genel olarak turnike ile iskemi oluflturulan model-lerde, iskemi süresi ortalama 2-6 saat, reperfüzyon
sü-resi ise ortalama 1-4 saat aras›nda tutulmufltur.[36,38,39]
Bi-zim çal›flmam›zda da iskemi süresi dört saat, reperfüz-yon süresi ise iki saat olarak uyguland›.
‹skemi-reperfüzyonda oluflan serbest radikaller yük-sek reaktiviteleri nedeniyle membranlardaki lipidlere sald›rarak lipid peroksidasyonunu bafllat›rlar. Akci¤er-de iskemi-reperfüzyon hasar› s›ras›nda akümüle olan li-pid peroksidasyon ürünü MDA’n›n tiyobarbitürik asit reaktif maddeleri (TBARS) ile verdi¤i reaksiyon spekt-rofotometrik olarak ölçülerek akci¤er hasar›n›n
derece-si hakk›nda fikir edinilebilir.[40] Çal›flmam›zda ‹-R
gru-bunda (grup 2) MDA de¤erinin grup1’e göre anlaml› olarak artt›¤›, grup 4’te ise anlaml› bir art›fl olmad›¤› görüldü. Grup 4’teki art›fl›n grup 2 ve grup 3’e göre an-laml› derecede düflük oldu¤u saptan›rken, grup 2 ile grup 3 aras›nda anlaml› bir fark yoktu.
Akci¤er dokusu MDA düzeylerinde grup 1 (sham) ile karfl›laflt›r›ld›¤›nda grup 4’te (prereperfüzyon) belir-gin bir art›fl olmazken grup 2 ve grup 3’te ise istatistik-sel olarak ileri derecede anlaml› art›fl oldu¤u görüldü (p<0.001). Çal›flmam›zda tavflanlar›n iki tarafl› alt ekst-remitelerinde oluflturulan iskemi ve reperfüzyon, akci-¤er dokusunda MDA seviyelerinin yükselmesine sebep olmufltur. Kontrol grubundaki artm›fl MDA düzeyleri, histopatolojik çal›flmada saptanan hasar skor puanlar›y-la iyi bir iliflki göstermifltir. Bu bulgupuanlar›y-lar reperfüzyondan hemen önce melatonin uygulamas›n›n iskemi-reperfüz-yon hasar›n›n kan ve akci¤er üzerindeki etkilerini azalt-t›¤›n›, iskemiden önce uygulanan melatoninin ise bu ha-sar› azaltmada etkisiz kald›¤›n› göstermektedir.
Okutan ve ark.[41]
ver-dikleri s›çanlarda akci¤erlerde nötrofil infiltrasyonunun göstergesi olan miyeloperoksidaz ve doku MDA düzey-lerinin A‹R grubuna göre istatistiksel olarak anlaml›
de-recede düflük oldu¤unu saptam›fllard›r. Çelik ve ark.[42]
deneysel adneksiyal iskemi-reperfüzyon çal›flmalar›n-da, reperfüzyondan hemen önce melatonin uygulad›kla-r› guinea piglerde, kontrol grubuna göre plazma ve ak-ci¤er doku MDA düzeylerinin istatistiksel olarak
an-laml› flekilde azald›¤›n› saptam›fllard›r. ‹nci ve ark.[43]
ise s›çanlarda deneysel akci¤er iskemi-reperfüzyon çal›fl-malar›nda reperfüzyondan 10 dakika önce intraperito-neal 10 mg/kg melatonin uygulanmas›yla doku MDA düzeylerinde azalma oldu¤unu göstermifllerdir.
Akci¤erde oluflan iskemi-reperfüzyon hasar›n› gös-terme yöntemlerinden bir di¤eri de, histopatolojik pre-paratlar›n hematoksilen eozin ile boyand›ktan sonra ›fl›k
mikroskobuyla incelenmesidir.[12,44]Kapiller yata¤a
nöt-rofillerin akümülasyonu ile birlikte nötrofil birikimi, in-terstisyel ödem, alveolar septumlarda kal›nlaflma, alve-oler hava boflluklar› içerisinde protein içeren eksuda varl›¤› s›kt›r. Ayn› flekilde haz›rlanan preparatlarda 10 ya da 20 de¤iflik sahan›n büyük büyütme alt›nda incele-nip polimorfonükleer lökosit say›larak kantitatif olarak
da hasar tespiti mümkün olmaktad›r.[45]Tassiopoulos ve
ark.[12] alt ekstremite iskemi-reperfüzyon modelinde
deksametazon, aminoguanidin verilen s›çanlarda, kont-rol grubuna oranla akci¤er PNL say›lar›n›n azalm›fl ol-du¤unu gösterdiler. Ayn› çal›flmada tedavi uygulanan gruplarda interstisyel ödemin ve konjesyonun kontrol grubuna göre daha az oldu¤u saptand›. Çeflitli iskemi-reperfüzyon modellerinde melatoninin akci¤er PNL
akümülasyonunu azaltt›¤› gösterilmifltir.[41-43] Bu
çal›fl-mada tavflan akci¤er örneklerini hematoksilen eozin ile boyad›ktan sonra inceledi¤imizde; PNL yo¤unlaflmas›, ödem ve konjesyon ile belirlenen hasar skorunun iske-mi-reperfüzyon grubunda (grup 2) en yüksek oldu¤unu (2.8), melatonin verilen grup 4’te ise bu de¤erin (1.5) grup 2’ye göre anlaml› olarak düflük oldu¤unu saptad›k. Bu durum daha önceki çal›flmalarla paralellik göstere-rek melatoninin iskemi-reperfüzyon sonras› oluflan lö-kosit infiltrasyonunu azaltarak reperfüzyonun uzak or-gan hasar›n› önlemede yard›mc› oldu¤unu göstermekte-dir. Ancak melatoninin iskemiden önce verildi¤i grup 3’te elde edilen hasar skoru (2.7), grup 2’den farkl› de-¤ildi. Bu durumun melatoninin yar›lanma ömrünün 30 dakika olmas› nedeniyle verdi¤imiz dozun etkisiz kal-mas›ndan kaynakland›¤›n› düflünmekteyiz.
Yap›lan bu çal›flma sonucunda görülmektedir ki tur-nike ile alt ekstremitenin iskemi reperfüzyona u¤rat›l-mas› uzak organ olan akci¤erlerde konjesyon, lökosit infiltrasyonu ve interstisyel ödem ile karakterize incin-meye, lipid peroksidasyonunda artmaya yol açmaktad›r. Reperfüzyon öncesinde melatonin kullan›m› akci¤erler-deki bu reperfüzyon hasar›n› önlemektedir. Bunu da
li-pid peroksidasyonunu önleyerek ve nötrofil infiltrasyo-nunu azaltarak gerçeklefltirmektedir. Ayr›ca melatoni-nin uygun zamanda ve yeterli dozda verilmesi antioksi-dan etkisinin oluflmas› için flartt›r.
KAYNAKLAR
1. Grace PA. Ischaemia-reperfusion injury. Br J Surg 1994; 81:637-47.
2. Blaisdell FW. The pathophysiology of skeletal muscle ischemia and the reperfusion syndrome: a review. Cardiovasc Surg 2002;10:620-30.
3. Rocker GM. Ischaemia/reperfusion, inflammatory responses and acute lung injury. Thorax 1997;52:841-2.
4. Kelefltimur H. ‹nsanda pineal bezin fonksiyonlar›. F›rat Üni-versitesi Sa¤l›k Bilimleri Dergisi 1996;10:141-7.
5. Erlich SS, Apuzzo ML. The pineal gland: anatomy, physiol-ogy, and clinical significance. J Neurosurg 1985;63:321-41. 6. Mor M, Plazzi PV, Spadoni G, Tarzia G. Melatonin. Curr
Med Chem 1999;6:501-18.
7. Cuzzocrea S, Reiter RJ. Pharmacological action of melatonin in shock, inflammation and ischemia/reperfusion injury. Eur J Pharmacol 2001;426:1-10.
8. Hardy SC, Homer-Vanniasinkam S, Gough MJ. The triphasic pattern of skeletal muscle blood flow in reperfusion injury: an experimental model with implications for surgery on the acute-ly ischaemic lower limb. Eur J Vasc Surg 1990;4:587-90. 9. Satoh K. Serum lipid peroxide in cerebrovascular disorders
determined by a new colorimetric method. Clin Chim Acta 1978;90:37-43.
10. Yagi K. Assay for blood plasma or serum. Methods Enzymol 1984;105:328-31.
11. Wasowicz W, Neve J, Peretz A. Optimized steps in fluoro-metric determination of thiobarbituric acid-reactive sub-stances in serum: importance of extraction pH and influence of sample preservation and storage. Clin Chem 1993; 39:2522-6.
12. Tassiopoulos AK, Carlin RE, Gao Y, Pedoto A, Finck CM, Landas SK, et al. Role of nitric oxide and tumor necrosis fac-tor on lung injury caused by ischemia/reperfusion of the lower extremities. J Vasc Surg 1997;26:647-56.
14. Hobson II RW, Milazzo VJ, Duran WN. Pathophysiology of skeletal muscle ischemia - reperfusion injury. In Haimovici H, editor. Vascular Surgery. New York: Blackwell Science; 1996. p. 497-508.
15. Nelson K, Herndon B, Reisz G. Pulmonary effects of ischemic limb reperfusion: evidence for a role for oxygen-derived radicals. Crit Care Med 1991;19:360-3.
16. ‹flbir S, Akgün S, Ak K, Civelek A, Tekeli A, Çobano¤lu A ve ark. Akut alt extremite iskemi/reperfüzyon hasar›n›n akci-¤er serbest oksijen radikalleri üzerine olan etkisi. Türk Gö-¤üs Kalp Damar Cer Derg 2000;8:632-4.
17. Harkin DW, Barros D'Sa AA, McCallion K, Hoper M, Campbell FC. Ischemic preconditioning before lower limb ischemia--reperfusion protects against acute lung injury. J Vasc Surg 2002;35:1264-73.
18. Pararajasingam R, Nicholson ML, Bell PR, Sayers RD. Non-cardiogenic pulmonary oedema in vascular surgery. Eur J Vasc Endovasc Surg 1999;17:93-105.
ischemia/reperfusion injury in the rat hind limb model. Am J Surg 1999;178:147-50.
20. Cavanagh SP, Gough MJ, Homer-Vanniasinkam S. The role of the neutrophil in ischaemia-reperfusion injury: potential therapeutic interventions. Cardiovasc Surg 1998;6:112-8. 21. Carden D, Xiao F, Moak C, Willis BH, Robinson-Jackson S,
Alexander S. Neutrophil elastase promotes lung microvascu-lar injury and proteolysis of endothelial cadherins. Am J Physiol 1998;275:H385-92.
22. Windsor AC, Mullen PG, Fowler AA, Sugerman HJ. Role of the neutrophil in adult respiratory distress syndrome. Br J Surg 1993;80:10-7.
23. Bengisun J, Koksoy C, Bengisun JS, Bayraktaroglu G, Camur A, Aras N. Ischemia and reperfusion injury: preven-tion of pulmonary hypertension and leukosequestrapreven-tion fol-lowing lower limb ischemia. Prostaglandins Leukot Essent Fatty Acids 1997;56:117-20.
24. Kearns SR, Kelly CJ, Barry M, Abdih H, Condron C, Leahy A, et al. Vitamin C reduces ischaemia-reperfusion-induced acute lung injury. Eur J Vasc Endovasc Surg 1999;17:533-6. 25. Berkan Ö, Güneç F, Katranc›o¤lu N, Günay ‹, Do¤an K, Y›l-d›z E. ‹skemi ve reperfüzyona ba¤l› olarak ortaya ç›kan akci-¤er hasar›n› önlemede pentoksifilin, karnitin ve askorbik asi-din etkileri. Türk Gö¤üs Kalp Damar Cer Derg 2002;10:92-5. 26. Yeniterzi M, Yefliltay M, Vatansev H, Görmüfl N, ‹skelet kas› iskemi reperfüzyon hasar›n›n önlenmesinde mannitol etkili mi? Selçuk Üniversitesi T›p Fakültesi Dergisi 2001;17:231-4. 27. Joyce M, Kelly CJ, Chen G, Bouchier-Hayes DJ. Pravastatin attenuates lower torso ischaemia-reperfusion-induced lung injury by upregulating constitutive endothelial nitric oxide synthase. Eur J Vasc Endovasc Surg 2001;21:295-300. 28. fienkaya I, Ökten B, Saba D, Güven H, Özer Z, Dirican M ve
ark. ‹skelet kas› iskemi reperfüzyon hasar›n›n azalt›lmas›nda tiklopidin. Türk Gö¤üs Kalp Damar Cerrahisi Dergisi 1999; 7:405-10.
29. Novelli GP, Adembri C, Gandini E, Orlandini SZ, Papucci L, Formigli L, et al. Vitamin E protects human skeletal muscle from damage during surgical ischemia-reperfusion. Am J Surg 1997;173:206-9.
30. Reiter RJ, Tan DX, Acuña-Castroviejo D, Burkhardt S, Karbownik, M. Melatonin: mechanisms and actions as an antioxidant. Curr Top Biophys 2000;24:171-83.
31. Gündüz B. Hidroksil temizleyici bir hormon olarak melato-nin. Gülhane T›p Dergisi 1999;41:252-7.
32. Reiter R, Tang L, Garcia JJ, Munoz-Hoyos A. Pharmacological actions of melatonin in oxygen radical pathophysiology. Life Sci 1997;60:2255-71.
33. Yassin MM, Harkin DW, Barros D'Sa AA, Halliday MI, Rowlands BJ. Lower limb ischemia-reperfusion injury
trig-gers a systemic inflammatory response and multiple organ dysfunction. World J Surg 2002;26:115-21.
34. Herbert KJ, Hickey MJ, Lepore DA, Knight KR, Morrison WA, Stewart AG. Effects of the endothelin receptor antago-nist Bosentan on ischaemia/reperfusion injury in rat skeletal muscle. Eur J Pharmacol 2001;424:59-67.
35. Tekeli A, Akgün S, Civelek A, ‹flbir S, Ak K, Çobano¤lu A ve ark. Alt ekstremite iskemi reperfüzyonu sonucunda geliflen akci¤er hasar›n›n önlenmesinde farkl› bir ajan: FK 506 (tak-rolimus). Türk Gö¤üs Kalp Damar Cer Derg 2001;9:242-6. 36. fiirin H, Sar›bülbül O, Cerraho¤lu M, Aksoy Ö, Baltalarl› A,
Saçar M. Alt ekstremite iskemi reperfüzyonunun yol açt›¤› pulmoner hasarda aprotininin koruyucu etkinli¤i. Türk Gö-¤üs Kalp Damar Cer Derg 2001;9:233-7.
37. Göktürk EA, Seber S, Özakçe H, Uslu B, Paflao¤lu Ö, Önder E. ‹skelet kas› iskemi-reperfüzyon zedelemesinde dimethyl sulfo-xide’in koruyucu etkisi. Anadolu T›p Dergisi 1989;11:173-89. 38. Yassin MM, Barros D'Sa AA, Parks G, Abdulkadir AS,
Halliday I, Rowlands BJ. Mortality following lower limb ischemia-reperfusion: a systemic inflammatory response? World J Surg 1996;20:961-6.
39. Akar H, Sarac A, Konuralp C, Yildiz L, Kolbakir F. Comparison of histopathologic effects of carnitine and ascor-bic acid on reperfusion injury. Eur J Cardiothorac Surg 2001; 19:500-6.
40. Sakamaki F, Hoffmann H, Muller C, Dienemann H, Messmer K, Schildberg FW. Reduced lipid peroxidation and ischemia-reperfusion injury after lung transplantation using low-potas-sium dextran solution for lung preservation. Am J Respir Crit Care Med 1997;156(4 Pt 1):1073-81.
41. Okutan H, Savas C, Delibas N. The antioxidant effect of melatonin in lung injury after aortic occlusion–reperfusion. Interactive Cardiovasc and Thorac Surg 2004;3:519-22. 42. Celik H, Ayar A, Tug N, Simsek M, Ozercan I, Cikim G, et
al. Effects of melatonin on noncardiogenic pulmonary edema secondary to adnexial ischemia-reperfusion in guinea pig. Neuro Endocrinol Lett 2002;23:115-8.
43. Inci I, Inci D, Dutly A, Boehler A, Weder W. Melatonin attenuates posttransplant lung ischemia-reperfusion injury. Ann Thorac Surg 2002;73:220-5.
44. Wagner FM, Weber AT, Ploetze K, Schubert F, Pfeiffer S, Albrecht S, et al. Do vitamins C and E attenuate the effects of reactive oxygen species during pulmonary reperfusion and thereby prevent injury? Ann Thorac Surg 2002;74:811-7; discussion 817-8.
