Paklitakselin saflaştırılması için yeni adsorban sentezi

(1)

T.C.

DÜZCE ÜNİVERSİTESİ

FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ

PAKLİTAKSELİN SAFLAŞTIRILMASI İÇİN

YENİ ADSORBAN SENTEZİ

BORA KARAGÜL

YÜKSEK LİSANS TEZİ

KİMYA ANABİLİM DALI

DANIŞMAN

PROF. DR. HALİL İBRAHİM UĞRAŞ

(2)

T.C.

DÜZCE ÜNİVERSİTESİ

FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ

PAKLİTAKSELİN SAFLAŞTIRILMASI İÇİN YENİ ADSORBAN

SENTEZİ

Bora KARAGÜL tarafından hazırlanan tez çalışması aşağıdaki jüri tarafından Düzce Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü Kimya Anabilim Dalı’nda YÜKSEK LİSANS TEZİ olarak kabul edilmiştir.

Tez Danışmanı

Prof. Dr. Halil İbrahim UĞRAŞ Düzce Üniversitesi

Jüri Üyeleri

Prof. Dr. Halil İbrahim UĞRAŞ

Düzce Üniversitesi _____________________

Prof. Dr. Arif BARAN

Sakarya Üniversitesi _____________________

Yrd. Doç. Dr. Ersin ORHAN

Düzce Üniversitesi _____________________

(3)

BEYAN

Bu tez çalışmasının kendi çalışmam olduğunu, tezin planlanmasından yazımına kadar bütün aşamalarda etik dışı davranışımın olmadığını, bu tezdeki bütün bilgileri akademik ve etik kurallar içinde elde ettiğimi, bu tez çalışmasıyla elde edilmeyen bütün bilgi ve yorumlara kaynak gösterdiğimi ve bu kaynakları da kaynaklar listesine aldığımı, yine bu tezin çalışılması ve yazımı sırasında patent ve telif haklarını ihlal edici bir davranışımın olmadığını beyan ederim.

21 Temmuz 2017

(4)

TEŞEKKÜR

Yüksek lisans öğrenimimde ve bu tezin hazırlanmasında gösterdiği her türlü maddi ve manevi desteklerinden dolayı yol gösterenim çok değerli hocam sayın Prof. Dr. Halil İbrahim UĞRAŞ’a en içten dileklerimle teşekkür ederim.

Tez çalışmam boyunca değerli katkılarını esirgemeyen çalışma arkadaşlarıma da şükranlarımı sunarım.

Bu çalışma boyunca yardımlarını ve desteklerini esirgemeyen sevgili aileme ve Pınar AYDIN’a sonsuz teşekkürlerimi sunarım.

Bu tez çalışması, TÜBİTAK tarafından TBAG-114Z233 nolu proje kapsamında desteklenmiştir. Hem TÜBİTAK’a hem de Düzce Üniversitesi’ne desteklerinden dolayı çok teşekkür ederiz.

(5)

İÇİNDEKİLER

Sayfa No

ŞEKİL LİSTESİ ... VIII

ÇİZELGE LİSTESİ ... XVI

KISALTMALAR ... XVII

SİMGELER ... XVIII

ÖZET ... XIX

ABSTRACT ... XX

1. GİRİŞ ... 1

1.1. GENEL BİLGİLER ... 1 1.2. PAKLİTAKSEL’İN KEŞFİ ... 2

1.3. PAKLİTAKSEL’İN YAPI VE AKTİVİTE İLİŞKİSİ ... 3

1.3.1. Paklitaksel’in Fiziksel Ve Kimyasal Özellikleri ... 3

1.3.2. Paklitaksel’in Yapısı ... 4

1.4. PAKLİTAKSEL’İN ETKİ MEKANİZMASI VE TÜBÜLİNLE ETKİLEŞİMİ ... 6

1.5. ADSORPSİYON ... 8

1.5.1. Adsorpsiyonu Etkileyen Faktörler ... 8

1.5.2. Adsorpsiyon Çeşitleri ... 9 1.6. SİKLODEKSTRİNLER ... 9 1.6.1. Siklodekstrinlerin Özellikleri... 9 1.7. AFİNİTE KROMATOĞRAFİSİ ... 11

2. MATERYAL VE YÖNTEM ... 14

2.1. ENSTRÜMANTAL EKİPMANLAR ... 14 2.2. SENTEZ REAKSİYONLARI ... 14

3. BULGULAR VE TARTIŞMA ... 15

3.1. SENTEZ ÇALIŞMA SONUÇLARI ... 15

3.1.1.Tübülinin Silikaya İmmobilizasyonu Prosedür Optimizasyon Çalışmaları ... 15

3.1.2. Tübülinin Silikaya İmmobilizasyonu ... 24

(6)

3.1.4. Silika-Glisidiloksi-β-siklodekstrin Sentezi (10) ... 32

3.1.5. β-Siklodekstrin Tosilat Sentezi (12) ... 34

3.1.6. 3-Aminopropil silikaya β-Siklodekstrinin İmmobilizasyonu–Prosedür 1 (13) ... 37

3.1.7. 3-Aminopropil silikaya β-Siklodekstrinin İmmobilizasyonu–Prosedür 2 (13) ... 39

3.1.8. Mono-6-deoksi-6-azido-β-Siklodekstrin Sentezi (14)... 42

3.1.9.Mono-6-deoksi-6-azido-β-CD’in 3-Aminopropilsilikaya İmmobilizasyonu (15) ... 45

3.2. SENTEZLENEN YENİ ADSORBANLARIN KROMATOĞRAFİK SAFLAŞTIRMA ÇALIŞMALARI ... 48

3.2.1. Standart Kalibrasyon Grafiği ve HPLC Şartları... 48

3.2.2. Çalışma Kapsamında Kullanılan Ana Stok Çözelti/Ekstraktların Verileri ... 49

3.2.3. Tübülin Immobilize Silika (5) Kolon Adsorbanı Çalışma Sonuçları ... 50

3.2.3.1. Saf Paklitaksel Standardı Çalışması Sonuçları ... 50

3.2.3.2. Taksan Standardı Karışım Çalışması Sonuçları ... 56

3.2.3.3. Sert Kabuk Ekstraktı Çalışması Sonuçları ... 62

3.2.4.Mono-6-Deoksi-6-Azido-Β-CD’i 3-Aminopropilsilikaya İmmobilizasyonu (15) Kolon Adsorbanı Çalışma Sonuçları ... 69

3.2.5. 3-Aminopropil Silikaya β-Siklodekstrin İmmobilize (13) Kolon Adsorbanı Çalışma Sonuçları ... 78

3.2.6. β-siklodekstrinin Silika-Glisidiloksi İmmobilize (10) Kolon Adsorbanı Çalışma Sonuçları ... 87

(7)

5. KAYNAKLAR ... 104

ÖZGEÇMİŞ ... 106

(8)

ŞEKİL LİSTESİ

Sayfa No

Şekil 1.1. Paklitaksel. ... 1

Şekil 1.2. Elde edilen bitki, başlangıç maddesi ve son ürün. ... 2

Şekil 1.3. PTX’i oluşturan yapılar. ... 4

Şekil 1.4. Paklitakselin numaralandırılmış yapısı. ... 5

Şekil 1.5. Mikrotübül yapısı. ... 6

Şekil 1.6. Paklitaksel ve tübülin etkileşimi. ... 7

Şekil 1.7. Paklitaksel ve tübülin etkileşimi. ... 7

Şekil 1.8. Glikopiranoz birimi. ... 10

Şekil 1.9. Siklodekstrin yapıları. ... 10

Şekil 1.10. Siklodekstrinin üç boyutlu yapısı. ... 11

Şekil 1.11. Afinite kromatoğrafisinin gösterimi. ... 12

Şekil 1.12. Hedef proteinin matriks ile temasının gösterimi. ... 13

Şekil 3.1. Tübülinin silikaya immobilizasyonunun reaksiyon gösterimi. ... 15

Şekil 3.2. Aminopropil silikanın (1) FT-IR spektrumu. ... 16

Şekil 3.3. Glutaraldehit uzantı kollu silikanın (3) FT-IR spektrumu. ... 16

Şekil 3.4. Tübülin immobilize silika (5) FT-IR spektrumu (2 saatlik reaksiyon). ... 17

Şekil 3.5. Aminopropil silika (1- kırmızı) ve glutaraldehit uzantı kollu silika (3-mavi). ... 17

Şekil 3.6. Glutaraldehit uzantı kollu silika (3- kırmızı) ve tübülin immobilize silika (5-mavi). ... 17

Şekil 3.7. Aminopropil silika (1) raman spektrumu (785 nm). ... 18

Şekil 3.8. Glutaraldehit uzantı kollu silika raman spektrumu (785 nm). ... 18

Şekil 3.9. Tübülin immobilize silika raman spektrumu (4 saatlik reaksiyon -785 nm). ... 18

Şekil 3.10. Glutaraldehit uzantılı silika (2-siyah) ve tübülin immobilize silika (3-kırmızı, 4 saatlik reaksiyon 785 nm). ... 19

Şekil 3.11. Glutaraldehit uzantılı silika (2-siyah) ve tübülin immobilize silika (3-kırmızı, 12 saatlik reaksiyon 785 nm). ... 19

Şekil 3.12. Amino bağlı silika (1-siyah) ve glutaraldehit uzantı kollu silika (2-kırmızı) Raman spektrumu (785 nm). ... 19

Şekil 3.13. Glutaraldehit uzantı kollu silika (siyah) ve tübülin immobilize silika (kırmızı 4 saatlik reaksiyon denemesi). ... 20

Şekil 3.14. Aminopropil silika (kırmızı) ve tübülin immobilize silika (siyah 12 saatlik reaksiyon). ... 20

Şekil 3.15. Glutaraldehit uzantı kollu silika (siyah) ve tübülin immobilize silika (kırmızı - 12 saatlik reaksiyon). ... 20

Şekil 3.16. Tübülin immobilize silika (siyah 4 saatlik reaksiyon) ve tübülin immobilize silika (kırmızı 12 saatlik reaksiyon). ... 21

Şekil 3.17. Glutaraldehit uzantı kollu silika (siyah), tübülin immobilize silika (mavi 4 saatlik reaksiyon) ve tübülin immobilize silika (kırmızı 12 saatlik reaksiyon). ... 21

Şekil 3.18. Aminopropil silika sem görüntüsü. ... 22

Şekil 3.19. Glutaraldehit uzantı kollu silika sem görüntüsü. ... 22

Şekil 3.20. Tübülin immobilize silika (4 saatlik reaksiyon) sem görüntüsü... 23

(9)

Şekil 3.22. Tübülin immobilize silika FT-IR spektrumu. ... 24

Şekil 3.23. Aminopropil silika (kırmızı) ve tübülin immobilize silika (mavi-nihai ürün) FT-IR spektrumu. ... 25

Şekil 3.24. Glutaraldehit uzantı kollu silika (kırmızı) ve tübülin immobilize silika (mavi-nihai ürün) FT-IR spektrumu. ... 25

Şekil 3.25. Aminopropil silika (kırmızı), glutaraldehit uzantı kollu silika (mavi) ve tübülin immobilize silika (yeşil-nihai ürün). ... 25

Şekil 3.26. Aminopropil silika (siyah) ve tübülin immobilize silika (kırmızı-nihai ürün) raman spektrumu. ... 26

Şekil 3.27. Glutaraldehit uzantı kollu silika (siyah) ve tübülin immobilize silika (kırmızı-nihai ürün). ... 26

Şekil 3.28. Aminopropil silika sem görüntüsü. ... 27

Şekil 3.29. Glutaraldehit uzantı kollu silika sem görüntüsü. ... 27

Şekil 3.30. Tübülin bağlı silika sem görüntüsü (1000 kat büyütülmüş) ... 28

Şekil 3.31. Tübülin bağlı silika sem görüntüsü (4000 kat büyütülmüş) ... 28

Şekil 3.32. Glisidiloksipropil silika sentezi reaksiyon gösterimi... 29

Şekil 3.33. Silikanın (6) raman spektrumu. ... 30

Şekil 3.34. Ürünün (8) raman spektrumu. ... 30

Şekil 3.35. Silika (6-mavi renkli) ve ürünün (8-kırmızı renkli) raman spektrumları. .... 30

Şekil 3.36. Silika (6) FT-IR spektrumu. ... 31

Şekil 3.37. Ürünün (8) FT-IR spektrumu. ... 31

Şekil 3.38. Silika (6-siyah) ve ürünün (8-kırmızı) karşılaştırmalı FT-IR spektrumu. .... 31

Şekil 3.39. Silika-glisidiloksi- β-siklodekstrin sentezi reaksiyon gösterimi. ... 32

Şekil 3.40. Glisidil silika bileşiği (8 ) raman spektrumu. ... 33

Şekil 3.41. Ürünün (10) raman spektrumu. ... 33

Şekil 3.42. Glisidil silika bileşiğinin (8) FT-IR spektrumu. ... 33

Şekil 3.44. Glisidil silika bileşiğinin (8-kırmızı) ve ürünün (10-yeşil) karşılaştırmalı ... 34

Şekil 3.45. β-Siklodekstrin tosilat sentezi reaksiyon gösterimi. ... 34

Şekil 3.46. Siklodekstrinin (9) FT-IR spektrumu. ... 35

Şekil 3.48. Tosil klorür (11 yeşil) ve ürünün (12 siyah) karşılaştırmalı FT-IR spektrumu. ... 36

Şekil 3.49. Siklodekstrinin (9 kırmızı) ve ürünün (12 siyah) karşılaştırmalı FT-IR spektrumu. ... 36

Şekil 3.50. 3-Aminopropil silikaya β-siklodekstrinin immobilizasyonu reaksiyon gösterimi. ... 37

Şekil 3.51. Beta siklodekstrin tosilat (12) bileşiğinin FT-IR spektrumu. ... 37

Şekil 3.54. Aminopropil silikanın (1-kırmızı) ve ürünün (13-mavi) karşılaştırmalı FT-IR spektrumu. ... 38

Şekil 3.55. Beta siklodekstrin tosilat (12-kırmızı) bileşiği ve ürünün (13-mavi) karşılaştırmalı IR spektrumu. ... 39

Şekil 3.56. Beta siklodekstrin tosilat (12-kırmızı), amino fonksiyonelize silikanın (1-mavi) ve ürünün (13-yeşil) karşılaştırmalı IR spektrumu... 39

Şekil 3.57. Beta siklodekstrin tosilat (12) bileşiğinin FT-IR spektrumu. ... 40

(10)

Şekil 3.61. Aminopropil silikanın (1-kırmızı) ve ürünün (13-mavi) IR spektrumu. ... 41

Şekil 3.62. Ts- β-CD (12-kırmızı), aminopropil silikanın (1-mavi) ve ürünün (13-yeşil) IR spektrumu. ... 41

Şekil 3.63. Mono-6-deoksi-6-azido-β-siklodekstrin sentezi reaksiyon gösterimi. ... 42

Şekil 3.64. Sodyum azidin FT-IR spektrumu. ... 43

Şekil 3.65. Beta siklodekstrin tosilat (12) FT-IR spektrumu. ... 43

Şekil 3.67. Sodyum azid (kırmızı) ile ürünün (14-mavi) FT-IR spektrumu. ... 44

Şekil 3.68. Ts-β-CD (12-mavi) ile ürünün (14-kırmızı) FT-IR spektrumu. ... 44

Şekil 3.69. Sodyum azid (kırmızı), Ts-β-CD (12-yeşil) ile ürünün (14-mavi) FT-IR spektrumu. ... 44

Şekil 3.70. Mono-6-deoksi-6-azido-β-CD’in 3-aminopropilsilika ile immobilizasyonu. ... 45

Şekil 3.71. Beta siklodekstrin azido bileşiğinin (14) FT-IR spektrumu. ... 46

Şekil 3.74. Beta siklodekstrin azido bileşiği (14-kırmızı) ile ürünün (15-mavi) FT-IR spektrumu. ... 47

Şekil 3.75. Aminopropil silika (1-kırmızı) ile ürünün (15-mavi) FTIR spektrumu. ... 47

Şekil 3.76. Amino fonksiyonelize silika (1-mavi), β-CD azido bileşiği (14-kırmızı) ile ürünün (15-yeşil) FT-IR spektrumu. ... 47

Şekil 3.77. Taksan standardı karışımının kalibrasyon grafiği. ... 48

Şekil 3.78. 5ppm’lik taksan standartları hplc kromatoğramı. ... 48

Şekil 3.79. Taksan standartları hplc kromatoğramı. ... 49

Şekil 3.80. Sert kabuk ekstraktı hplc kromatoğramı. ... 49

Şekil 3.81. Sert kabuk ekstraktı (siyah) ve taksan standartları (kırmızı) hplc kromatoğramı. ... 50

Şekil 3.82. PTX standardı 1.fraksiyonu (siyah) ve standart karışımın (kırmızı) hplc kromatoğramı. ... 51

Şekil 3.83. PTX standardı 1.fraksiyonu (siyah) ve PTX standardı 2.fraksiyonu (kırmızı) hplc kromatoğramı. ... 52

Şekil 3.84. PTX standardı 2.fraksiyonu (siyah) ve standart karışımın (kırmızı) hplc kromatoğramı. ... 52

Şekil 3.85. PTX standardı 2.fraksiyonu (siyah) ve 3.fraksiyonun (kırmızı). ... 52

Şekil 3.86. PTX standardı 3.fraksiyonu (siyah) ve standart karışımın (kırmızı) ... 53

Şekil 3.87. PTX standardı 3.fraksiyonu (siyah) ve CH₃CN/CH₃OH (80:20) yıkamasının (kırmızı) hplc kromatoğramı. ... 53

Şekil 3.88. PTX standardı CH₃CN/CH₃OH (80:20) yıkaması (siyah) ve standart karışımın (kırmızı) hplc kromatoğramı. ... 53

Şekil 3.89. PTX standardı CH₃CN/CH₃OH (80:20) yıkamasının (siyah) ve (60:40) yıkamasının (kırmızı) hplc kromatoğramı. ... 54

Şekil 3.91. PTX standardı CH₃CN/CH₃OH (60:40) yıkaması (siyah) ve (40:60) yıkamasının (kırmızı) hplc kromatoğramı. ... 54

Şekil 3.93. PTX standardı CH₃CN/CH₃OH (40:60) yıkaması (siyah) ve (20:80) yıkamasının (kırmızı) hplc kromatoğramı. ... 55 Şekil 3.94. PTX standardı CH₃CN/CH₃OH (20:80) yıkaması (siyah) ve standart

(11)

karışımın (kırmızı) hplc kromatoğramı. ... 55 Şekil 3.95. PTX standardı CH₃CN/CH₃OH (20:80) yıkaması (siyah) ve CH₃OH

yıkamasının (kırmızı) hplc kromatoğramı. ... 56 Şekil 3.96. PTX standardı CH₃OH metanol yıkaması (siyah) ve standart karışımın

(kırmızı) hplc kromatoğramı. ... 56 Şekil 3.97. Taksan standardı 1. fraksiyonun (siyah) ve standart karışımın (kırmızı)

hplc kromatoğramı. ... 57 Şekil 3.98. Taksan standardı 1.fraksiyonunun (siyah) ve taksan standardı

2.fraksiyonunun (kırmızı) hplc kromatoğramı. ... 58 Şekil 3.99. Taksan standardı 2.fraksiyonunun (siyah) ve standart karışımın (kırmızı)

hplc kromatoğramı. ... 58 Şekil 3.100. Taksan standardı 2.fraksiyonunun (siyah) ve 3.fraksiyonunun (kırmızı)

hplc kromatoğramı. ... 58 Şekil 3.101. Taksan standardı 3.fraksiyonunun (siyah) ve standart karışımın

(kırmızı) hplc kromatoğramı. ... 59 Şekil 3.102. Taksan standardı 3.fraksiyonunun (siyah) ve CH₃CN/CH₃OH (80:20)

yıkamasının (kırmızı) hplc kromatoğramı. ... 59 Şekil 3.103. Taksan standardı CH₃CN/CH₃OH (80:20) yıkaması (siyah) ve standart

karışımın (kırmızı) hplc kromatoğramı. ... 59 Şekil 3.104. Taksan standardı CH₃CN/CH₃OH (80:20) yıkaması (siyah) ve (60:40)

karışımın (kırmızı) hplc kromatoğramı. ... 61 Şekil 3.110. Taksan standardı CH₃CN/CH₃OH (20:80) yıkaması (siyah) ve CH₃OH

yıkamasının (kırmızı) hplc kromatoğramı. ... 62 Şekil 3.111. Taksan standardı CH₃OH yıkaması (siyah) ve CH₃OH yıkamasının

(kırmızı) hplc kromatoğramı. ... 62 Şekil 3.112. Sert kabuk ekstraktı 1.fraksiyonu (siyah) ve standart karışımın

(kırmızı) hplc kromatoğramı. ... 63 Şekil 3.113. Sert kabuk ekstraktı stok (siyah) ve 1.fraksiyonun (kırmızı) hplc

kromatoğramı. ... 64 Şekil 3.114. Sert kabuk ekstraktı 1.fraksiyonu (siyah) ve 2.fraksiyonunun (kırmızı)

hplc kromatoğramı. ... 64 Şekil 3.115. Sert kabuk ekstraktı 2.fraksiyonu (siyah) ve standart karışımın

(kırmızı) hplc kromatoğramı. ... 64 Şekil 3.116. Sert kabuk ekstraktı 1.fraksiyonu (siyah) ve 3.fraksiyonunun (kırmızı)

(kırmızı) hplc kromatoğramı. ... 65 Şekil 3.118. Sert kabuk ekstraktı 3.fraksiyonu (siyah) ve CH₃CN/CH₃OH (80:20)

(kırmızı) yıkamasının hplc kromatoğramı. ... 65 Şekil 3.119. Sert kabuk ekstraktı CH₃CN/CH₃OH (80:20) yıkamasının (siyah) ve

(12)

standart karışımın (kırmızı) hplc kromatoğramı. ... 66 Şekil 3.120. Sert kabuk ekstraktı CH₃CN/CH₃OH (80:20) yıkamasının (siyah) ve

(60:40) yıkamasının (kırmızı) hplc kromatoğramı. ... 66 Şekil 3.121. Sert kabuk ekstraktı CH₃CN/CH₃OH (60:40) yıkamasının (siyah) ve

CH₃OH yıkamasının (kırmızı) hplc kromatoğramı. ... 68 Şekil 3.127. Sert kabuk ekstraktı CH₃OH yıkamasının (siyah) ve standart karışımın

(kırmızı) hplc kromatoğramı. ... 68 Şekil 3.128. PTX standardı 1.fraksiyonu (siyah) ve standart karışımın (kırmızı) hplc

kromatoğramı. ... 69 Şekil 3.129. PTX standardı 1.fraksiyonu (siyah) ve PTX standardı 2.fraksiyonu

kromatoğramı. ... 70 Şekil 3.131. PTX standardı 2.fraksiyonu (siyah) ve PTX standardı 3.fraksiyonun

kromatoğramı. ... 71 Şekil 3.133. PTX standardı 3.fraksiyonu (siyah) ve CH₃OH(kırmızı) yıkamasının

hplc kromatoğramı. ... 71 Şekil 3.134. PTX standardı CH₃OH yıkaması (siyah) ve standart karışımın (kırmızı)

hplc kromatoğramı. ... 71 Şekil 3.135. Taksan standardı 1. fraksiyonun (siyah) ve standart karışımın (kırmızı)

2.fraksiyonunun (kırmızı) hplc kromatoğramı. ... 73 Şekil 3.137. Taksan standardı 2.fraksiyonunun (siyah) ve standart karışımın

(kırmızı) hplc kromatoğramı. ... 73 Şekil 3.138. Taksan standardı 2.fraksiyonunun (siyah) ve 3.fraksiyonunun (kırmızı)

(kırmızı) hplc kromatoğramı. ... 74 Şekil 3.140. Taksan standardı 3.fraksiyonunun (siyah) ve CH₃OH yıkamasının

(kırmızı) hplc kromatoğramı. ... 74 Şekil 3.141. Taksan standardı CH₃OH yıkaması (siyah) ve standart karışımın

(kırmızı) hplc kromatoğramı. ... 74 Şekil 3.142. Sert kabuk ekstraktı stok (siyah) ve Sert kabuk ekstraktı 1.fraksiyon

(kırmızı) hplc kromatoğramı. ... 75 Şekil 3.143. Sert kabuk ekstraktı 1.fraksiyonu (siyah) ve standart karışımın

(13)

(kırmızı) hplc kromatoğramı. ... 77 Şekil 3.148. Sert kabuk ekstraktı 3.fraksiyonu (siyah) ve CH₃OH yıkamasının

(kırmızı) hplc kromatoğramı. ... 77 Şekil 3.149. Sert kabuk ekstraktı CH₃OH yıkamasının (siyah) ve standart karışımın

kromatoğramı. ... 79 Şekil 3.151. PTX standardı 1.fraksiyonu (siyah) ve PTX standardı 2.fraksiyonu

kromatoğramı. ... 79 Şekil 3.153. PTX standardı 2.fraksiyonu (siyah) ve PTX standardı 3.fraksiyonun

kromatoğramı. ... 80 Şekil 3.155. PTX standardı 3.fraksiyonu (siyah) ve CH₃OH yıkamasının (kırmızı)

hplc kromatoğramı. ... 80 Şekil 3.156. PTX standardı CH₃OH yıkaması (siyah) ve standart karışımın (kırmızı)

hplc kromatoğramı. ... 81 Şekil 3.157. Taksan standardı 1. fraksiyonun (siyah) ve standart karışımın (kırmızı)

hplc kromatoğramı ... 83 Şekil 3.161. Taksan standardı 3.fraksiyonunun (siyah) ve standart karışımın

(kırmızı) hplc kromatoğramı. ... 83 Şekil 3.162. Taksan standardı 3.fraksiyonunun (siyah) ve CH₃OH yıkamasının

(kırmızı) hplc kromatoğramı. ... 83 Şekil 3.163. Taksan standardı CH₃OH yıkaması (siyah) ve standart karışımın

(kırmızı) hplc kromatoğramı. ... 84 Şekil 3.164. Sert kabuk ekstraktı stok (siyah) ve 1.fraksiyonun (kırmızı) hplc

kromatoğramı. ... 85 Şekil 3.165. Sert kabuk ekstraktı 1.fraksiyonu (siyah) ve standart karışımın

(kırmızı) hplc kromatoğramı. ... 85 Şekil 3.166. Sert kabuk ekstraktı 1.fraksiyonu (siyah) ve 2.fraksiyonunun (kırmızı) .... 85 Şekil 3.167. Sert kabuk ekstraktı 2.fraksiyonu (siyah) ve standart karışımın

(14)

Şekil 3.170. Sert kabuk ekstraktı CH₃OH yıkamasının (siyah) ve standart karışımın (kırmızı) hplc kromatoğramı. ... 87 Şekil 3.171. PTX standardı 1.fraksiyonu (siyah) ve standart karışımın (kırmızı) hplc

kromatoğramı. ... 88 Şekil 3.172. PTX standardı 1.fraksiyonu (siyah) ve 2.fraksiyonu (kırmızı) hplc

kromatoğramı. ... 88 Şekil 3.173. PTX standardı 2.fraksiyonu (siyah) ve standart karışımın (kırmızı) hplc

kromatoğramı. ... 88 Şekil 3.174. PTX standardı 2. fraksiyonu (siyah) ve 3.fraksiyonun (kırmızı) hplc

kromatoğramı. ... 89 Şekil 3.175. PTX standardı 3.fraksiyonu (siyah) ve standart karışımın (kırmızı) hplc

kromatoğramı. ... 89 Şekil 3.176. PTX standardı CH₃CN/CH₃OH (80:20) yıkaması (siyah) ve standart

karışımın (kırmızı) hplc kromatoğramı. ... 89 Şekil 3.177. PTX standardı CH₃CN/CH₃OH (60:40) yıkaması (siyah) ve standart

karışımın (kırmızı) hplc kromatoğramı. ... 90 Şekil 3.180. PTX standardı CH₃OH metanol yıkaması (siyah) ve standart karışımın

(kırmızı) hplc kromatoğramı. ... 91 Şekil 3.181. Taksan standardı 1.fraksiyonun (siyah) ve standart karışımın (kırmızı)

(kırmızı) hplc kromatoğramı. ... 93 Şekil 3.186. Taksan standardı CH₃CN/CH₃OH (80:20) yıkaması (siyah) ve standart

karışımın (kırmızı) hplc kromatoğramı. ... 93 Şekil 3.187. Taksan standardı CH₃CN/CH₃OH (60:40) yıkaması (siyah) ve standart

karışımın (kırmızı) hplc kromatoğramı. ... 94 Şekil 3.190. Taksan standardı CH₃OH yıkaması (siyah) ve CH₃OH yıkamasının

(kırmızı) hplc kromatoğramı. ... 95 Şekil 3.191. Sert kabuk ekstraktı stok (siyah) ve 1.fraksiyonun (kırmızı)

(kırmızı) kromatoğramı. ... 96 Şekil 3.193. Sert kabuk ekstraktı 1.fraksiyonu (siyah) ve 2.fraksiyonunun (kırmızı)

(15)

Şekil 3.195. Sert kabuk ekstraktı 2.fraksiyonu (siyah) ve 3.fraksiyonunun (kırmızı) hplc kromatoğramı. ... 97 Şekil 3.196. Sert kabuk ekstraktı 3.fraksiyonu (siyah) ve standart karışımın

(kırmızı) hplc kromatoğramı. ... 97 Şekil 3.197. Sert kabuk ekstraktı 3.fraksiyonu (siyah) ve CH₃CN/CH₃OH (80:20)

(kırmızı) yıkamasının hplc kromatoğramı. ... 98 Şekil 3.198. Sert kabuk ekstraktı CH₃CN/CH₃OH (80:20) yıkamasının (siyah) ve

CH₃OH yıkamasının (kırmızı) hplc kromatoğramı. ... 100 Şekil 3.206. Sert kabuk ekstraktı CH₃OH yıkamasının (siyah) ve standart karışımın

(16)

ÇİZELGE LİSTESİ

Sayfa No

Çizelge 1.1. Paklitakselin tarihsel keşfi. ... 3

Çizelge 1.2. Farklı çözücülerde PTX’in yaklaşık çözünürlük değerleri [10] ... 4

Çizelge 1.3. α-CD, β-CD, γ-CD’lerin özellikleri ... 10

Çizelge 3.1 5 ppm’lik taksan standardının ppm cinsinden değerleri ... 48

Çizelge 3.2. Ana stok ekstraktların konsantrasyon (ppm) değerleri. ... 50

Çizelge 3.3. Saf paklitaksel standardı çalışması geri kazanım (ppm) değerleri. ... 51

Çizelge 3.4. Taksan standardı çalışması geri kazanım (ppm) değerleri. ... 57

Çizelge 3.5. Sert kabuk ekstraktı çalışması geri kazanım (ppm) değerleri. ... 63

(17)

KISALTMALAR

Arg Arjinin Asp Aspartat CD Siklodekstrin CNBr Siyanojenbromür DMF Dimetil Formamid

FTIR Fourier Dönüşümlü Infrared Spektrofotometre

G-PEM General Tübülin Tamponu

His Histidin

HPLC Yüksek Basınçlı Sıvı Kromatoğrafisi

KBr Potasyum Bromür

NaOH Sodyum Hidroksit

NCI Amerikan Ulusal Kanser Enstitüsü

ODS-3 Oktadesil (C18)

Ppm mg çözünen / kg veya litre çözelti

PTX Paklitaksel

SAR Yapı-Aktivite İlişkisi

SEM Taramalı Elektron Mikroskopu

Ts-β-CD β-Siklodekstrin Tosilat

THF Tetrahidrofuran

β-CD β-Siklodekstrin

USDA Amerikan Tarım Bakanlığı

UV Ultraviyole ışın

(18)

SİMGELER

α Alfa Å Ångström ( 0,1 nm) β Beta ɣ Gama μm Mikrometre nm Nanometre kJ Kilojoule mg Miligram ml Mililitre

(19)

ÖZET

PAKLİTAKSELİN SAFLAŞTIRILMASI İÇİN YENİ ADSORBAN SENTEZİ

Bora KARAGÜL Düzce Üniversitesi

Fen Bilimleri Enstitüsü, Kimya Anabilim Dalı Yüksek Lisans Tezi

Danışman: Prof. Dr. Halil İbrahim UĞRAŞ Temmuz 2017, 105 sayfa

Paklitaksel en etkin kemoterapi ilacıdır. Saflaştırılması ve elde edilmesi oldukça zor ve maliyetlidir. Bu yüzden saflaştırılması için tübülin ile olan etkileşimini temel alarak yeni adsorbanlar sentezledik. Tübülin ve paklitaksel spesifik olarak etkileşmektedir. Sentezlediğimiz ürünler sadece paklitaksel için değil aynı zamanda diğer safsızlık giderimlerinde de adsorban olarak kullanılabilir. Amaçlarımızdan biri de bu sentezleri literatüre kazandırmak ve başka alanlarda değerlendirilmesini sağlamaktır. Paklitakselin saflaştırma süreci uzun süredir endüstride ciddi sıkıntılı bir konu olmaktadır. Paklitakselin saflaştırma ve izolasyon işlemleri genel olarak birden fazla basamak içermektedir; biyokütlenin organik solvent ile ekstraksiyonu, safsızlıkların giderilmesi için bir veya daha fazla zenginleştirilmiş basamaklar ve çoklu kromatoğrafik saflaştırma basamaklarıdır. Ayrıca, bitki ekstraktından kaynaklanan yüksek seviyedeki katran, yağımsı, fenolik ve mumsu bileşenler gibi safsızlıklar fazla organik çözücü tüketilmesine ve HPLC kolon ömrünün azalmasına neden olabilmektedir. Bu yüzden, farmasötik derecede paklitakselin endüstride ön saflaştırma işlemleri HPLC çalışmaları öncesinde hayati rol oynamaktadır. Bu çoğunlukla başlangıçtaki ekstraktların istenmeyen bileşenlerinin giderilmesiyle ham saflığı iyileştiren bazı adsorbentlerin kullanılmasını gerektirir, sonuçta saflık ve verim artar ve aynı zamanda nihai paklitaksel ürünlerin maliyeti düşer. Bu çalışmada sentezlediğimiz adsorbanlar paklitakselin saflaştırılmasında kullanılmak üzere etkileri incelenmiştir.

(20)

ABSTRACT

SYNTHESIS OF NEW ADSORBENT FOR PURIFICATION OF PACLITAXEL

Bora KARAGÜL Düzce University

Graduate School of Natural and Applied Sciences, Department of Chemistry Master’s Thesis

Supervisor: Prof. Dr. Halil İbrahim UĞRAŞ July 2017, 105 pages

Paclitaxel is the most effective chemotherapy drug. Purification and acquisition are very difficult and costly. Therefore we have synthesized new adsorbents that based on their interaction with tubulin for purification. Tubulin and paclitaxel are interact specially. The products that we synthesize can be used not only as paclitaxel but also as an adsorbent in other impurity removers. One of our aims is to bring these syntheses to the literature and to be evaluated in other fields. Purification of paclitaxel has been a issue of serious problem in industry for a long time. Purification and isolation of paclitaxel contains usually more than one step; biomass extraction with organic solvent, one or more enriched steps for remove impurities or multiple chromatographic for purification. In addition, impurities such as high levels of tar, oily, phenolic and waxy components resulting from plant extract can cause excessive organic solvent consumption and reduced HPLC column life. Therefore, pharmaceutical preparations of paclitaxel pre-purification play a crucial role in prior to HPLC studies. This often requires the use of certain adsorbents that improve purity of raw purity by removing unwanted components of the initial extracts resulting in increased purity and yield and decreasing the cost of the final paclitaxel products. In this study,we investigated the effects of the adsorbents synthesized in the purification of paclitaxel.

(21)

1. GİRİŞ

1.1. GENEL BİLGİLER

İnsanlığın varoluşundan beri pek çok ölümcül hastalık baş göstermiştir. İnsanoğlu gerek bitkisel ilaçlar kullanarak gerekte sentetik ilaçlar kullanarak bu hastalıklarla mücadele etmektedir. Çağımızın en ölümcül hastalıkları olarak kalp damar hastalıkları ve kanser insan sağlığını ciddi şekilde tehdit etmektedir. Kanser ile mücadelede kullanılan birçok tedavi yöntemi olmasına rağmen en fazla kullanılan yöntem kemoterapidir. Bu yöntemde tümörlü hücrelere karşı anti tümör aktiviteye sahip ilaç etken maddeler veya karışımları kullanılmaktadır. Bu ilaç etken maddeler arasında dünyada en etkili ve en fazla kullanılan maddelerden birisi paklitakseldir ( PTX ) [1].

O O O O OH O O O HO NH OH O O O O H Şekil 1.1.Paklitaksel.

(22)

1.2. PAKLİTAKSEL’İN KEŞFİ

1962 yılında geniş çaplı tarama programı çerçevesinde Amerika Tarım Bakanlığı (USDA) tarafından birçok sayıda bitki örneği toplatılarak bu bitkilerin ekstraktları Amerikan Ulusal Kanser Enstitüsü’ne (NCI) teslim edilmiştir. Başlangıçta suda çözünürlüğü az olduğu ve etki mekanizmasının tam olarak bilinmemesi nedeni ile üzerine fazla durulmayan PTX, Amerikan Kanser Enstitüsü (NCI) tarafından incelemeye alınmıştır [2]. 1971 yılında Wani ve Wall tarafından oldukça yüksek potansiyelde anti kanser ajanı olan PTX’i ticari adıyla Taxol’u keşfetmişlerdir. Doğal ürünlerden elde edilen en önemli kanser etken maddesidir [3]. 1856 yılında Alman eczacı Lucas’ın taksanların karışımını elde etmeye başlayan çalışmaları bu bileşiklerin metabolit olarak kullanılması ile ilgili kimyasal çalışmaların başlangıcını oluşturmuştur. Bulduğu bu bileşiklere Taxine adını vermiştir [4].

12 kg kuru porsuk ağacı kabuğundan ve yapraklarından %0.004 verimle 0,5 g saf olarak ile elde edilmiştir. Taksan iskeleti ve bazı hidroksil grupları içerdiği için Taxol olarak isimlendirilmiştir. Taxol’ün doğada sınırlı miktarda bulunmasına karşın, Taxus Baccata bitkisinden elde edilen 10-Deasetilbaccatin III’ün başlangıç maddesi olarak kullanılması Taxol’ün kimyasal sentezine büyük bir avantaj sağlamıştır.

Şekil 1.2. Elde edilen bitki, başlangıç maddesi ve son ürün.

1989’da PTX’in kanser üzerindeki iyileştirici rolü raporlanmıştır. Bristol-Myers Co. 1993’te pazarlamaya başlanmış ve 1998’de yıllık 1 milyar dolarlık satış tutarına ulaşmıştır. 2000 yılında 1,5 milyar dolarlık satışıyla, PTX tarihteki en önemli anti kanser ilacı olduğunu kanıtlamıştır [5].

(23)

Çizelge 1.1. Paklitakselin tarihsel keşfi.

1.3. PAKLİTAKSEL’İN YAPI VE AKTİVİTE İLİŞKİSİ 1.3.1. Paklitaksel’in Fiziksel Ve Kimyasal Özellikleri

Moleküler formülü C47H51NO14 olan PTX güçlü antineoplastik aktivite gösteren doğal

kemoterapötik bir ajandır. PTX moleküler ağırlığı 853,9 g/mol’dür, erime noktası 216-217 oC’dir. PTX beyaz kristal toz şeklindedir. Lipofilik özelliktedir, suda çözünmez, polar organik solventlerde (metanol, etanol, asetonitril, kloroform, diklorometan) kolaylıkla çözünür. Molekül yapısında, benzen halkaları ve suda çözünememesine yol açan hidrofobik yapılar bulunur [9].

PTX’in sudaki zayıf çözünürlüğünden dolayı, Taxol® (Bristol-Myers Squibb) ticari preparatında, Cremophor EL (polietoksillenmiş hintyağı):dehidrate alkol karışımı (1:1, h/h) içermektedir. Fakat Cremophor EL aşırı duyarlılık reaksiyonu, nefrotoksisite, nörotoksisite ve kardiotoksisite gibi bir çok yan etkilere yol açmaktadır [10].

YIL BAŞARI

1856 T.Baccata’dan taksin eldesi

1971 T.Bevifolia’dan elde edilen paklitakselin yapısının aydınlatılması

1974 Hücre bitki kültürü denemeleri

1979 Mikrotübüllerin mekanizmasının keşfi

1989 Klinik çalışmaların sonuçların yayınlaması

1989 Hücre süspansiyon kültürü ve T.Bevifolia hücre bitkisinden üretilen paklitaksel

1991 T.Bevifolia hücre kültüründen paklitaksel üretimi üzerine patent alınması

1992 Taxus Cuspidata’dan paklitaksel eldesi

1993 Paklitaksel eldesinde patent çalışmaları devamı

1996 T. Media üzerine hücre kültürü çalışmaları

(24)

Çizelge 1.2. Farklı çözücülerde PTX’in yaklaşık çözünürlük değerleri [10] Çözücü Çözünürlük ( mg / mL ) Diklorometan ≥ 19 Asetonitril ≤ 22 n-Heptan < 1 Etanol ~ 39 İzopropanol ~ 12 %75 Propilen glikol < 1,4 %75 Proetilen glikol 31 Soya Yağı 0,3 Triasetin 75 1.3.2. Paklitaksel’in Yapısı

PTX’in yapısı Şekil 1.3’te gösterildiği gibi ana çekirdek yapı ve yan zincirden oluşmaktadır.

(25)

Yapı aktivite çalışmaları için bileşik Kingston’nın kullandığı sınıflandırmaya göre üç bölgeye bölünmüştür: Yan zincir, merkez çekirdeği kapsayan kuzey (C-12 den C-6'ya kadar olan bölge) ve güney yarıküre (C-l den C-5 kadar olan bölge) PTX ; A, B, C ve D halkalarını içeren Bakkatin (III) ve yan zincir olarak isimlendirilen N-benzil-3-Fenil izoserin’den oluşmaktadır. PTX’in aktivitesi için yan zincirin tamamı gereklidir. Serbest 2-hidroksil grubu veya hidrolize olabilen esterlerin varlığı mutlaka gereklidir. C-3' fenil grubu veya yakın bir analoğu esastır. N-açil grubu gereklidir. Değişik açil grupları taşıyan taksanların tümü aktiftir.

Şekil 1.4. Paklitakselin numaralandırılmış yapısı.

Kuzey yarıküre olarak adlandırılan bölgede sübstitüent aktiviteyi belirgin olarak değiştirmemektedir. 7-OH grubunda önemli bir aktivite kaybı olmaksızın esterifikasyon, epimerizasyon veya grubun ayrılması olabilir. C-10'da asetil veya asetoksi gruplarının ayrılması aktivite kaybına neden olur.

Güney yarıküre olarak adlandırılan bölge ise aktivite açısından önemlidir. 2-benzoiloksi grubu gereklidir. Aromatik halka üzerinde m-sübstütüsyon aktiviteyi bir hayli arttırır. 4,5-oksetan halkası kesinlikle gereklidir. C-4 asetat grubu aktivite için gereklidir. C-1 hidroksil grubunun aktivite üzerindeki etkisi hakkında bilgi yoktur. 14-OH grubu aktivite üzerinde oldukça etkindir [11].

(26)

1.4. PAKLİTAKSEL’İN ETKİ MEKANİZMASI VE TÜBÜLİNLE ETKİLEŞİMİ Mikrotübüller ökaryotik hücre sitoplazmasında yer alan, 25 nm çapında, 25-200μm uzunluğunda olan içleri boş silindirik şekilde çubuklardır. Mikrotübüller tübülin adı verilen globüler proteinlerinden oluşur. Tübülin dimer yapıda olup, α ve β tübülinlerden meydana gelir. Mikrotübüller hücreye biçim verip, onu desteklemelerinin yanı sıra organellerin hareket etmesinde de rol alırlar. Ayrıca mikrotübüller hücre bölünmesi sırasında kromozomların ayrılmasından da sorumludurlar [12].

Şekil 1.5. Mikrotübül yapısı.

PTX tübülinlerin ve mikrotübülinlerin arasına girerek sitotoksik olarak onları etkileyip fonksiyonlarını durdurmaktadır. Mikrotübüller, hücrelerin sitoplazmasında bulunan ve birçok hücre aktivitesinde önemli rol oynayan aktif polimerik yapılardır. Mikrotübüllerin görevleri arasında en önemli olanı hücre bölünmesinde hayati rol oynamalarıdır. Hasta hücrelerin hızla çoğalması kanserin nedenlerinden biri olduğu için hücre bölünmesinin engellenmesi kemoterapi açısından son derece önemlidir. PTX’in bu çok büyük önemine karşın bütün kanser ilaçlarında olduğu gibi yan etkileri zaman zaman ölümcül düzeylerde olabilmektedir [13].

Mikrotübüller anti mitotik yani hücre bölünmesini durduran ilaçlara karşı son derece reaktiftirler. Bu ilaçların başında ise paklitaksel gelmektedir.

PTX mikrotübül yapısındaki beta tübülinlere bağlanarak polimerizasyonu durdurarak mikrotübül oluşumunu destekler ve oluşan sonuç mikrotübül yapılarının kararlılığının artmasına yardımcı olur. Bu özelliği ile moleküllerin daha çok hızlı bölünen hücreler üzerinde yıkıcı etki göstermesini sağlar.

(27)

Taksolün mikrotübüllere bağlanması bir moleküller arası kuvvetli bir etkileşim olup geri dönüşümlüdür [14]. PTX mikrotübül yapısındaki beta tübüline stokiyometrik olarak başka hiçbir kofaktörün olmadığı ortamda bağlanır.

Bu bağlanma mikrotübül yapısında konformasyonel düzensizliklere ve akabinde mikrotübül yapısının değişmesine sebep olur. Bu mikrotübül polimerizasyonunu durması yani mikrotübüllerin kararlı hale gelmesi anlamına gelmektedir. Bu aynı zamanda mitoz bölünmenin ilk aşamalarının durması yani tümör hücresinin bölünmesinin durması anlamına da gelmektedir [15].

PTX ile ilgili yapılan SAR(Structure Activity Relationship) yani yapı-aktivite ilişkisi çalışmaları. Bu çalışmalar sayesinde PTX’in kanserli hücreye etki mekanizmasının anlaşılmasında önemli rol oynamıştır. Bu konuda özellikle tübülin ile etkileşimde hangi konformasyonların önemli olduğuna dair önemli bulgulara rastlanmıştır. PTX’in tübülin etkileşimi aşağıda gösterilmiştir.

Şekil 1.6. Paklitaksel ve tübülin etkileşimi.

(28)

Bu bağlanma mekanizmalarının anlaşılması ve açıklanmasında floresan moleküller kullanılarak ve fotoetiketleme deneylerinden faydalanılmıştır. Bu yapılan çalışmalar neticesinde PTX’in C-2 grubunun beta tübülinin Asp 224 ve His 227 ile etkileşirken, son yıllarda yapılan fotoetiketleme çalışmalarında, beta tübülindeki Arg 288 ile PTX direkt bir etkileşimde olduğu ortaya çıkmıştır. Bu çalışmalar yine yapısına floresan gruplar takılmış yeni PTX türevleri gerçekleştirilmiştir.

1.5. ADSORPSİYON

Bir katı veya bir sıvının yüzeyine atom, iyon veya moleküllerin tutunması sonucu oluşan derişim değişmesine adsorpsiyon denir. Bir başka ifade ile adsorpsiyon, taneciklerin yüzeye tutunmasıdır. Tutunan maddeye adsorbat (adsorplanan), onu tutan yüzeye ise adsorban adı ile ifade edilir. Bu olayın tersi olan tutunan taneciklerin yüzeyden ayrılmasına desorpsiyon denir.

1.5.1. Adsorpsiyonu Etkileyen Faktörler

Çözeltinin derişimi ya da gazın basıncı: Adsorpsiyon, çözeltiler için derişimle ve gazlar için basınçla artış gösterir. Bu artış miktarı, adsorban üzerinde denge derişimine ulaşıncaya kadar sürer. Adsorban doyduğunda gazın basıncının ya da çözeltinin derişiminin artması, adsorplanan madde miktarında herhangi bir değişikliğe yol açmaz.

Ortamın sıcaklığı: Adsorpsiyon için sıcaklık önemli bir parametre olup adsorpsiyon hızını etkilemektedir. Adsorpsiyonun sıcaklığa bağlılığı endotermik veya ekzotermik olarak gerçekleşir. Genellikle, adsorpsiyon da sıcaklık arttığında reaksiyon hızının arttığı düşünülmektedir [14].

Ortamın pH’sı: Adsorpsiyonu etkileyen en önemli etmenlerden biri de pH'dır. Çünkü ortamın pH’sı hem adsorbanın yapısını hem de adsorbatın iyonlaşmasını etkiler. Polar olmayan bir yapının üzerine asit ve bazların adsorpsiyonu, ortamın pH’sını da etkilenir. Hidrojen ve hidroksil iyonları kuvvetle adsorbe olurlar. Bu durum, çözeltideki diğer iyonların adsorpsiyonunu etkiler.

Adsorbanın ve adsorbatın fiziksel ve kimyasal özellikleri: Adsorban ve adsorbatın hem fiziksel hem de kimyasal özellikleri adsorpsiyonu etkiler. Bu özellikler arasında adsorbanın gözenek yapısı, adsorbanın yüzey alanı, adsorbatın tanecik yapısı, adsorbanın yüzey özellikleri, ve polaritesi gibi özellikler örnek olarak gösterilebilir.

(29)

1.5.2. Adsorpsiyon Çeşitleri

Yüzeyde meydana gelen adsorpsiyon olayı fiziksel, kimyasal ve iyonik adsorpsiyon olmak üzere üç başlıkta inceleyebiliriz.

Fiziksel adsorpsiyon: Fiziksel adsorpsiyonda yüzeye tutunmayı sağlayan, zayıf Van der Waals kuvvetleridir. Bu adsorpsiyon türü, katı yüzey ile adsorplanan madde molekülleri arasındaki çekim kuvvetlerinin etkisiyle gerçekleşir. Adsorpsiyon sonucu, ekzotermik olarak yoğunlaşma enerjisinden biraz fazla ısı açığa çıkar. Fiziksel adsorpsiyonun entalpi değeri kimyasal adsorpsiyona göre oldukça düşük olup, genel olarak 20 kJ/mol düzeyindedir. Aktivasyon enerjisi düşük, bağlar tersinir ve zayıftır

Kimyasal adsorpsiyon: Kimyasal adsorpsiyon sırasında taneciklerle katı yüzey arasında bir kimyasal bağ ve genellikle de kovalent bağ oluşmaktadır. Entalpi değeri fiziksel adsorpsiyona göre çok büyüktür ve genel olarak 200 kJ/mol düzeyindedir. Kimyasal adsorpsiyonlar tersinmezdir ve kimyasal adsorpsiyonun hızını aktivasyon enerjisi belirler. Kimyasal adsorpsiyon sıcaklıkla artar.

İyonik adsorpsiyon: Elektrostatik çekim kuvvetlerinin etkisi ile iyonlar yüzeydeki yüklü bölgelere tutunmaktadır. Burada adsorplayan ile adsorplananın iyonik güçleri önemlidir. İyonlar eş yüklü ise daha küçük olan tercihli olarak yüzeye tutulur [14].

1.6. SİKLODEKSTRİNLER 1.6.1. Siklodekstrinlerin Özellikleri

Siklodekstrinler(CD) nişaştanın siklodekstrin glukanotranferaz enzimiyle hidrolizi sonucunda oluşan halkalı yapıya sahip oligosakkaritlerdir. Bu halkalı yapılar 6, 7 ve 8 glikoz molekülünün -(1-4)-glikozidik bağlı α-(D-)glikopiranoz birimlerinden meydana gelmiştir. 6 glikoz biriminden oluşan -CD, 7 glikoz biriminden oluşan -CD ve 8 glikoz biriminden meydana gelen ise  -CD’dir. CD’in iç boşluğu hidrofobik, dış kısmı ise hidrofilik karakterdedir.

(30)

Şekil 1.8. Glikopiranoz birimi.

Şekil 1.9. Siklodekstrin yapıları.

Çizelge 1.3. α-CD, β-CD, γ-CD’lerin özellikleri

Özellik α-CD β-CD γ-CD Glikoz Sayısı 6 7 8 Molekül kütlesi 972 1135 1297 25 o_{C’ de suda} çözünürlük (% w/v) 14.5 1.85 23.2 Dış çap (Å) 14.6 15.4 17.5 Boşluk çapı (Å) 4.7–5.3 6.0–6.5 7.5–8.3 Yükseklik (Å) 7.9 7.9 7.9 Boşluk hacmi (Å3₎ ₁₇₄ ₂₆₂ ₄₂₇

(31)

CD’lerin yapısını aydınlatmak için X-ışınları ile yapılan çalışmalarda, yapılarındaki C2 ve C3 sekonder hidroksil gruplarının, halkanın geniş olan kenarında, C6 primer hidroksil gruplarının ise dar olan diğer kenarında bulunduğu, apolar C3 ve C5 hidrojenleri ve glikozidik oksijen köprülerinin molekülün iç kısmında, hidroksil gruplarının ise dış kısmında olduğu saptanmıştır. Bu yapısından dolayı molekülün dış kısmı suda çözünen hidrofilik, iç boşluk kısmı ise hidrofobik özellikte bir mikro heterojen ortam olarak tanımlanmıştır. Şekil 1.10’da CD molekülün üç boyutlu yapısı gösterilmektedir. CD boşluğunun apolar özelliğinden dolayı birçok hidrofobik moleküllerle konakçı-konuk tipinde inklüzyon kompleksleri oluşturabilmektedir. Bu inklüzyon komplekslerinde konuk molekül CD molekülünün iç boşluğuna alınır. Kompleks oluşumu konuk molekülü ve konakçı molekül boşluğu arasındaki boyutsal bir uyumdan ibarettir. CD moleküllerinin hidrofobik boşlukları, içerisine uygun boyuta sahip apolar grupların inklüzyon bileşikleri oluşturmak üzere girebildiği mikro ortam sağlar [15]-[17].

Şekil 1.10. Siklodekstrinin üç boyutlu yapısı.

1.7. AFİNİTE KROMATOĞRAFİSİ

Bir biyolojik ligand veya onun sentetik bir analogu ile saflaştırılmak istenen molekül üzerindeki komplementer bağlama bölgesi arasındaki spesifik etkileşimi esas alan, güçlü bir protein saflaştırma tekniğidir. Biyolojik ligandlar arasında substrat, koenzim, hormon, antikor, nükleik asit gibi yapılar örnek olarak verilebilir. Bu yöntem sayesinde çok yorucu, zor ve bazı hallerde imkânsız olan birçok ayırma ve saflaştırma işlemi kısa

(32)

zamanda gerçekleştirilebilir ve yüksek verimde binlerce kez saflaştırılmış bileşikler elde edilebilir. Afinite kromatografisinin ve son zamanlarda da hidrofobik adsorpsiyon kromatografisinin biyolojik moleküllerin saflaştırılmasında ve izolasyonunda güçlü teknikler olduğu ispatlanmıştır. Afinite kromotografisi ilk defa 1910 yılında amilazın çözünmeyen nişastaya adsorpsiyonu sonucu izolasyonunda kullanılmıştır. Fakat, kovalent olarak ligandların bağlanabileceği dayanıklı matrikslerin bulunmayışından, bu tekniğin yaygın halde uygulanması 1967 den sonra gerçekleşebilmiştir. Bu tarihte, primer amino grubuna sahip bileşiklerin siyano bromür (CNBr) ile aktifleştirilmiş polisakkarit matriks üzerine kovalent bağlanabileceği gösterilmiştir. Literatürde afinite jelleri için kullanılan matrikslerin aktivasyonu için, CNBr aktifleştirmesi dışında, oksiran ve karbodiimid aktifleştirilmesi gibi değişik aktifleştirme yöntemleri de bulunmaktadır. Afinite kromatografisinin yaygınlaşmasından sonra, yöntemin avantajlarından ve modifikasyonlara açık olmasından yararlanılarak, biyospesifik ligandlarla antikorlar, enzimler, bazı taşıyıcı proteinler, nükleik asitler ve çok saf halde elde edilmeye başlanmıştır. Afinite kromatografisinde, katı destek materyaline “ligand” adı verilen özel bir molekül immobilize edilir. Bu molekül saflaştırılmak istenen materyale karşı spesifik bir biyolojik ilgi duyarak onu belirli bir kuvvette dönüşümlü bir şekilde bağlamalıdır.

Şekil 1.11. Afinite kromatoğrafisinin gösterimi.

Sephadex veya Sepharose gibi katı destek materyallerinden birine, uygun yöntemlerle ligandın bağlanarak hazırlanması sonucu oluşturulan bir afinite kolonundan saflaştırılması düşünülen bir molekül karışımı geçirildiğinde, sadece saflaştırılması istenilen molekül ligandla etkileşerek kolonda tutulur. İstenmeyen bütün safsızlıklar

(33)

kolondan uygun bir tampon (yıkama tamponu) geçirilerek uzaklaştırılır. Kolonda tutulan ilgili molekül spesifik elüsyon tamponuyla kolondan alınır. Spesifik elüsyon, ilgili moleküle liganttan daha fazla afiniteye sahip madde içeren bu tampon çözelti ile gerçekleştirilir. Bu yöntemle tek basamakta yüzlerce kat saflaştırma yapılabilir [18]-[19].

(34)

2. MATERYAL VE YÖNTEM

2.1. ENSTRÜMANTAL EKİPMANLAR

Çalışmamızda sentezlenen tüm ürünlerin çözücüleri HPLC grade saflıkta çözücüler ile gerçekleştirilmiştir. Ürün karakterizasyonları Raman (Thermo Scientific DXR™ Raman Microscope), FT-IR (Shimadzu IRPrestige 21 - Agilent, Cary 630 FT-IR) ve elementel analiz cihazı (Thermo Scientific Flash 2000) ile gerçekleştirilmiştir ve bazı numunelerimizin IR spektrumları KBr (Shimadzu IRPrestige 21 cihazı) ile alınmıştır. Ancak akabinde KBr kullandığımız cihazda meydana gelen arıza neticesinde ATR li cihaz (Agilent, Cary 630 FT-IR) sisteminde analizlere devam edilmiştir. SEM dataları FEI marka cihaz Quanta FEG 250 modeli elde edilmiştir.

2.2. SENTEZ REAKSİYONLARI

Tez çalışmamız kapsamında sentezi amaçlanan, tübülinin aminopropil silika glutaraldehit üzerinden silikaya immobilizasyonu, glisidiloksipropil silika sentezi üzerinden beta siklodekstirin immobilizasyonu, β-siklodekstrininin mono tosilatı ve üzerinden aminopropil silikaya immobilizasyonu, β-siklodekstrininin mono azidosu üzerinden aminopropil silikaya immobilizasyonu, sentezleri başarıyla gerçekleştirilmiştir.

(35)

3. BULGULAR VE TARTIŞMA

3.1. SENTEZ ÇALIŞMA SONUÇLARI

3.1.1. Tübülinin Silikaya İmmobilizasyonu Prosedür Optimizasyon Çalışmaları

Şekil 3.1. Tübülinin silikaya immobilizasyonunun reaksiyon gösterimi.

0,12 g aminopropil silika (1) 3 ml %2.5 glutaraldehit (2) içeren 0.05 M Na2HPO4

tamponu ekleyerek pH 7.0’e ayarlandıktan sonra 2 saat boyunca reaksiyon karıştırıldı. Çözelti ortamında renk değişimi gözlendi. Akabinde Büchner hunisinden çift katlı mavi süzgeç kâğıdı ile süzüldü ve ultra saf su ile yıkandı. Elde edilen katı ürün (3) direkt olarak ikinci aşamada kullanıldı. Katı ürünün gramı başına 1 mg/ml tübülin (4) olacak şekilde G-PEM tampon çözeltisi içerisinde eklendi ve oda sıcaklığında gece boyunca karıştırıldı. Farklı sürelerde reaksiyon ortamından alınan numuneler vasıtası ile reaksiyon takip edildi. Yapılan analiz sonuçlarında en uygun sürenin gece boyunca gerçekleşmesi halinde elde edildiği görüldü. Bir sonraki aşamada gece boyunca sürdürülen reaksiyon tekrarlanarak sonuç teyit edildi. Farklı sürelerde elde edilen ürün (5) örnekleri ultra saf su ile yıkandı. FT-IR, Raman ve SEM ile sonuçlar kontrol edildi.

(36)

FT-IR ν[cm-1_]:

(1): 442 (o), 449 (o), 793 (o), 1041 (k), 3678(z), 3597(z)

(3): 3344(k), 1637(o), 1654(o), 1050 (k), 779(z)

(5): 3368(k), 1636(o), 1037(k), 780(z) Raman ν[cm-1_]:

(1): 121 (z), 178(z), 434(o), 795(z), 857(z), 952(z), 1062(z), 1210(z), 1365(k), 1415(k), 1453(k), 2899(o), 2969(z)

(2): 166(z), 187(o), 326(z), 421(o), 1086(z), 1198(z), 1345(o), 1370(o), 1718(z)

(3): 192(z), 226(z), 433(z), 463(z), 726(z)

Şekil 3.2. Aminopropil silikanın (1) FT-IR spektrumu.

(37)

Şekil 3.4. Tübülin immobilize silika (5) FT-IR spektrumu (2 saatlik reaksiyon).

Şekil 3.5. Aminopropil silika (1- kırmızı) ve glutaraldehit uzantı kollu silika (3-mavi).

Şekil 3.6. Glutaraldehit uzantı kollu silika (3- kırmızı) ve tübülin immobilize silika (5-mavi).

(38)

Şekil 3.7. Aminopropil silika (1) raman spektrumu (785 nm).

Şekil 3.8. Glutaraldehit uzantı kollu silika raman spektrumu (785 nm).

(39)

Şekil 3.10. Glutaraldehit uzantılı silika (2-siyah) ve tübülin immobilize silika (3-kırmızı, 4 saatlik reaksiyon 785 nm).

Şekil 3.11. Glutaraldehit uzantılı silika (2-siyah) ve tübülin immobilize silika (3-kırmızı, 12 saatlik reaksiyon 785 nm).

Şekil 3.12. Amino bağlı silika (1-siyah) ve glutaraldehit uzantı kollu silika (2-kırmızı) Raman spektrumu (785 nm).

(40)

Şekil 3.13. Glutaraldehit uzantı kollu silika (siyah) ve tübülin immobilize silika (kırmızı 4 saatlik reaksiyon denemesi).

Şekil 3.14. Aminopropil silika (kırmızı) ve tübülin immobilize silika (siyah 12 saatlik reaksiyon).

(41)

Şekil 3.16. Tübülin immobilize silika (siyah 4 saatlik reaksiyon) ve tübülin immobilize silika (kırmızı 12 saatlik reaksiyon).

Şekil 3.17. Glutaraldehit uzantı kollu silika (siyah), tübülin immobilize silika (mavi 4 saatlik reaksiyon) ve tübülin immobilize silika (kırmızı 12 saatlik reaksiyon).

(42)

Şekil 3.18. Aminopropil silika sem görüntüsü.

(43)

Şekil 3.20. Tübülin immobilize silika (4 saatlik reaksiyon) sem görüntüsü.

(44)

3.1.2. Tübülinin Silikaya İmmobilizasyonu

0,12 g aminopropil silika (1) 1 ml %2.5 glutaraldehit (2) içeren sıcak DMF (10 ml) eklenerek 2 saat boyunca refluks sistemi altında azot gazında reaksiyon karıştırıldı. Çözelti ortamında renk değişimi gözlendi. Çözelti oda sıcaklığında soğutuldu ve akabinde Büchner hunisinden çift katlı mavi süzgeç kâğıdı ile süzüldü ve ultra saf su, DMF ile yıkandı. Elde edilen katı ürün (3) direkt olarak ikinci aşamada kullanıldı. 1 mg/ml tübülin (4) olacak şekilde G-PEM tampon çözeltisi içerisinde hazırlandı ve 10mL DMF: G-PEM çözeltisi (9:6) ile oda sıcaklığında gece boyunca azot gazı altında karıştırıldı. Elde edilen ürün (5) ultra saf su ve GTP tamponu ile yıkandı. Elde edilen kahverengi ürün N2 gazı ile inert ortamda -20 oC’ de saklandı. FT-IR, Raman ve SEM

ile sonuçları ürünün gerçekleştiğini göstermiştir.

FT-IR ν[cm-1]:

(5): 3363(k), 1647(k) C=N, 1419(z), 1436(z), 1391(o) proteine ait pikler, 1040(k) C-N, 775(z), 662(z)

(45)

Şekil 3.23. Aminopropil silika (kırmızı) ve tübülin immobilize silika (mavi-nihai ürün) FT-IR spektrumu.

Şekil 3.24. Glutaraldehit uzantı kollu silika (kırmızı) ve tübülin immobilize silika (mavi-nihai ürün) FT-IR spektrumu.

Şekil 3.25. Aminopropil silika (kırmızı), glutaraldehit uzantı kollu silika (mavi) ve tübülin immobilize silika (yeşil-nihai ürün).

(46)

Şekil 3.26. Aminopropil silika (siyah) ve tübülin immobilize silika (kırmızı-nihai ürün) raman spektrumu.

Şekil 3.27. Glutaraldehit uzantı kollu silika (siyah) ve tübülin immobilize silika (kırmızı-nihai ürün).

(47)

Şekil 3.28. Aminopropil silika sem görüntüsü.

(48)

Şekil 3.30. Tübülin bağlı silika sem görüntüsü (1000 kat büyütülmüş)

(49)

3.1.3. Glisidiloksipropil Silika Sentezi (8)

Şekil 3.32. Glisidiloksipropil silika sentezi reaksiyon gösterimi.

100 ml’lik bir balona 5,0 g silika (150 oC’de aktive edilmiş- 6) alınır ve 50 ml toluende süspansiyon oluşturması için 20 dakika boyunca karıştırıldı. Oluşan süspansiyon çözeltisine 2,2 ml (3.3 mmol) 3-glycidyloxypropyltrimethoxysilane(GPTS-7) çapraz bağlayıcı eklendi ve 115 o_{C’ de 24 saat boyunca refluks uygulandı. Elde edilen jel}

kıvamındaki madde süzüldü ve saflaştırılmak üzere toluen, etanol, toluen, dietileter kullanılarak sırasıyla yıkandı. Etüvde 65 o_{C’ de gece boyunca kurutulmaya bırakıldı.}

Beyaz katı toz (8) olarak elde edildi.

FT-IRν[cm-1_]:

(6): 418(z), 457(o), 470(o), 545(z), 798(o), 972(z), 1093(k), 1338(z), 1519(z), 1616(z), 1990(z), 2357(o), 3012(z), 3464(o)

(7): 374(z), 418(z), 457(o), 470(o), 688(z), 802(o), 1143(o), 1338(z), 2320(o), 2353(o), 2881(z), 2945(o), 3091(z), 3520(o)

Raman ν[cm-1_]:

(8): 770(z), 857(z), 912(o), 1137(k) (oksirandaki CH2 hareketleri), 1259(k) epoksi

halkası, [1620-1351] CH2,O-CH3 veya O-CH2’de ki C-H, 2930,2933(o), 2877(o), CH2

(50)

Şekil 3.33. Silikanın (6) raman spektrumu.

Şekil 3.34. Ürünün (8) raman spektrumu.

(51)

Şekil 3.36. Silika (6) FT-IR spektrumu.

Şekil 3.37. Ürünün (8) FT-IR spektrumu.

(52)

3.1.4. Silika-Glisidiloksi-β-siklodekstrin Sentezi (10)

Şekil 3.39. Silika-glisidiloksi- β-siklodekstrin sentezi reaksiyon gösterimi.

100 ml’lik balona 8 numaralı bileşiğin (2,0 g) 40 ml susuz DMF içerisinde süspansiyonu geri soğutucu altında karıştırıldı. Başka bir balonda 2 g (1.7 mmol) β-CD (9) 25 mL DMF’ de tamamen çözülene kadar karıştırıldı ve üzerine 1 g (41.0mmol) NaH eklendi bu işlemler azot gazı altında gerçekleştirildi. 20 dakika karıştırıldıktan sonra NaH aşırısı süzülerek ayrıldı. Elde edilen süzüntü β-CD ‘in sodyum tuzunu içerir, bu çözelti hızlıca diğer balona aktarıldı ve 2 saat boyunca geri soğutucu altında kaynatıldı. Karışım oda sıcaklığında soğutularak süzüldü ve elde edilen katı sırasıyla DMF, MeOH, Toluen, MeOH, H2O ve MeOH olmak üzere yıkandı. Etüvde 60 oC’ de 2

saat boyunca kurutuldu. 2.0714 g beyaz katı (10) madde elde edildi.

FT-IRν[cm-1]:

(9): 576(o), 756(z), 856(z), 937(z), 999(z), 1006(k), 1080(o), 1157(k), 2308(o), 2922(o), 3300(o)

(10): 381(z), 399(z), 457(o), 648(z), 798(o), 1099(k), 1635(o), 1645(o), 2330(z), 2341(z), 2358(o), 2885(z), 2941(z), 3419(o), 3444(o)

Raman v[cm-1] :

(53)

Şekil 3.40. Glisidil silika bileşiği (8) raman spektrumu.

Şekil 3.41. Ürünün (10) raman spektrumu.

(54)

Şekil 3.44. Glisidil silika bileşiğinin (8-kırmızı) ve ürünün (10-yeşil) karşılaştırmalı FT-IR spektrumu

3.1.5. β-Siklodekstrin Tosilat Sentezi (12)

Şekil 3.45. β-Siklodekstrin tosilat sentezi reaksiyon gösterimi.

(55)

0-5 o_{C’de olan buz banyosunda çözelti soğutuldu. Çözelti soğutulduktan sonra 2 saat}

boyunca azar azar olmak üzere p-toluensulfonil klorür (11) ( 4 g, 13,4 mmol) ilave edildi. Manyetik karıştırıcıda 0-5 oC’ de kuvvetli bir şekilde karıştırılarak reaksiyon gerçekleştirildi. Karışıma p-toluensulfonil klorür (6 g, 20 mmol) parçalar halinde eklendi ve 3 saat daha karıştırıldı. Karışım 0-5 oC’ de süzüldü, bu esnada reaksiyona girmeyen aşırı p-toluensulfonil klorür ayrıldı. Süzüntüye %10’ luk HCL (75 mL) eklendi ve buzdolabında gece boyunca (0 oC’ de) bekletildi. Süzülerek ayrılan madde 40-50 ml kaynar suda kristallendirildi. Elde edilen madde beyaz renkli katıdır. 4,22 g madde elde edildi. Ts-β-CD (12) diğer prosedürlerimizde başlangıç maddesi olarak kullanılmaktadır. Erime noktası 165-168 °C Verim: 3.55 g (2.93 mmol, 29 %) Elementel analiz: teorik: C, 45.65; H, 5.94; O, 45.92; S, 2.49; deneysel: C, %45,905; H %6,015; O, 45,69; S %2,39.

FT-IR ν [cm-1]:

(9): 576 (z), 756 (z), 856 (z), 937 (z), 999 (z), 1028(k), 1080(z), 1157(o), 2308(z), 2922 (z), 3325(k)

(11): 397(z), 418(z), 474(z), 545(k), 567(k), 651(k), 810(k), 842(o), 960(z), 1014(z), 1043(z), 1078(o), 1117(k), 1186(o), 1294(o), 1338(z), 1365(k), 1591(k), 2249(z), 2308(z), 2382(z), 2736(z), 2922(z), 3059(z), 3091(z), 3167(z)

(12): 518 (z), 574 (o), 651 (z), 812 (z) S=O-Ar, 937 (z), 1028 (k), 1078(o), 1157 (o), 1361 (o) S=O, 2330 (o), 2358(k), 2927 (o), 3196 (o), 3325 (k)

(56)

Şekil 3.48. Tosil klorür (11 yeşil) ve ürünün (12 siyah) karşılaştırmalı FT-IR spektrumu.

Şekil 3.49. Siklodekstrinin (9 kırmızı) ve ürünün (12 siyah) karşılaştırmalı FT-IR spektrumu.

(57)

3.1.6. 3-Aminopropil silikaya β-Siklodekstrinin İmmobilizasyonu–Prosedür 1 (13)

Şekil 3.50. 3-Aminopropil silikaya β-siklodekstrinin immobilizasyonu reaksiyon gösterimi.

1 g (1.0 mmol ) 3-aminopropilsilika (1) 30 ml DMF’ de çözülür ve oda sıcaklığındaki refluks sistemine yerleştirildi üzerine 0,25 g Ts-β-CD (12) 10 ml DMF’ de çözülerek ilave edildi ve 60 oC’de 7 saat boyunca azot gazı altında reaksiyon gerçekleştirildi. Reaksiyon karışımı gece boyunca oda sıcaklığında bekletildi. Çöken katı alınarak DMF ve aseton ile yıkandı. Vakum altında kurutuldu. Beyaz katı madde (13) elde edildi.(0,99 g) Elementel Analiz: N %0.61 (reaksiyonun olup olmadığı ve azotun bağlanıp bağlanmadığının tespiti amacıyla bakılmıştır).

FT-IR ν [cm-1]:

(13): 447(z), 790 (o), 1046(k), 1388(z), 1654(o)

(58)

Şekil 3.52. Aminopropil silikanın (1) FT-IR spektrumu.

(59)

Şekil 3.55. Beta siklodekstrin tosilat (12-kırmızı) bileşiği ve ürünün (13-mavi) karşılaştırmalı IR spektrumu.

Şekil 3.56. Beta siklodekstrin tosilat (12-kırmızı), amino fonksiyonelize silikanın (1-mavi) ve ürünün (13-yeşil) karşılaştırmalı IR spektrumu.

3.1.7. 3-Aminopropil silikaya β-Siklodekstrinin İmmobilizasyonu–Prosedür 2 (13) 1 g (0.77 mmol) Ts-β-CD (12) 20 ml DMF’ de çözüldü ve 0,5 g sodyum karbonat ilave edildi akabinde 1.16 g(~1 mmol/g NH2) 3-aminopropil silika ilave edildi ve manyetik

karıştırıcıda 24 saat boyunca 70 o_{C’ de azot gazı altında karıştırıldı. Elde edilen katı}

ürün süzülerek ayrıldı ve saflaştırılmak için DMF, MeOH, Toluen, MeOH, H2O ve

MeOH ile yıkandı. Elde edilen ürün beyaz renkli (13) katıdır.(1,40 g) Elementel Analiz: N %0.58, (reaksiyonun olup olmadığı ve azotun bağlanıp bağlanmadığının tespiti amacıyla bakılmıştır) Bu prosedür de bir önceki prosedüre nazaran daha yüksek verim elde edilmiştir.