β-siklodekstrinin Silika-Glisidiloksi İmmobilize (10) Kolon Adsorbanı

3.2.6.1. Saf Paklitaksel Standardı Çalışması Sonuçları

Kolonda toplamda 3 adet 10’ar ml fraksiyon ve 1,5 ml’ lik CH₃CN: CH₃OH ile 80:20, 60:40, 40:60, 20:80 ve %100 CH₃OH yıkaması gerçekleştirilerek toplama işlemi yapılmıştır. Yürütücü faz olarak CH₃CN/H2O (1:1) elüenti kullanılmıştır. Kolona 40µL

10 ppm’lik paklitaksel standardı enjekte edilmiştir. Toplanan her fraksiyon evapore edilip elde edilen katı 2 ml CH₃OH çözeltisi ile çözdürülüp akabinde 0.20 µm filtreden süzülerek viallenmiştir.

Çizelge 3.12. Saf paklitaksel standardı çalışması geri kazanım (ppm) değerleri.

10-DAB III Bakkatin III Sefalomannin Paklitaksel CH₃CN/H2O 1.fraksiyon 0,0637 0,0701 0,0776 0,1327 CH₃CN/H2O 2.fraksiyon 0,0656 0,0376 - - CH₃CN/H2O 3.fraksiyon 0,0481 0,0618 0,0481 - CH₃CN/CH₃OH (80:20) 0,1698 - - - CH₃CN/CH₃OH (60:40) - - - - CH₃CN/CH₃OH (40:60) - - - - CH₃CN/CH₃OH (20:80) - - - - CH₃OH Yıkama - - - -

Şekil 3.171. PTX standardı 1.fraksiyonu (siyah) ve standart karışımın (kırmızı) hplc kromatoğramı.

Şekil 3.172. PTX standardı 1.fraksiyonu (siyah) ve 2.fraksiyonu (kırmızı) hplc kromatoğramı.

Şekil 3.173. PTX standardı 2.fraksiyonu (siyah) ve standart karışımın (kırmızı) hplc kromatoğramı.

Şekil 3.174. PTX standardı 2. fraksiyonu (siyah) ve 3.fraksiyonun (kırmızı) hplc kromatoğramı.

Şekil 3.175. PTX standardı 3.fraksiyonu (siyah) ve standart karışımın (kırmızı) hplc kromatoğramı.

Şekil 3.176. PTX standardı CH₃CN/CH₃OH (80:20) yıkaması (siyah) ve standart karışımın (kırmızı) hplc kromatoğramı.

Şekil 3.177. PTX standardı CH₃CN/CH₃OH (60:40) yıkaması (siyah) ve standart karışımın (kırmızı) hplc kromatoğramı.

Şekil 3.178. PTX standardı CH₃CN/CH₃OH (40:60) yıkaması (siyah) ve standart karışımın (kırmızı) hplc kromatoğramı.

Şekil 3.179. PTX standardı CH₃CN/CH₃OH (20:80) yıkaması (siyah) ve standart karışımın (kırmızı) hplc kromatoğramı.

Şekil 3.180. PTX standardı CH₃OH metanol yıkaması (siyah) ve standart karışımın (kırmızı) hplc kromatoğramı.

3.2.6.2. Taksan Standardı Karışım Çalışması Sonuçları

Kolonda toplamda 3 adet 10’ar ml fraksiyon ve 1,5 ml’lik CH₃CN:CH₃OH ile 80:20, 60:40, 40:60, 20:80 ve %100 CH₃OH yıkaması gerçekleştirilerek toplama işlemi yapılmıştır. Yürütücü faz olarak CH₃CN/H2O (1:1) elüenti kullanılmıştır. Kolona 40µL

10 ppm’lik taksan standardı enjekte edilmiştir. Toplanan her fraksiyon evapore edilip elde edilen katı 2 ml CH₃OH çözeltisi ile çözdürülüp akabinde 0.20 µm filtreden süzülerek viallenmiştir.

Çizelge 3.13. Taksan standardı çalışması geri kazanım (ppm) değerleri.

10-DAB III Bakkatin III Sefalomanni n Paklitaksel CH₃CN/H2O 1.fraksiyon 0,0896 0,0595 0,0696 - CH₃CN/H2O 2.fraksiyon 0,1344 0,0711 0,0431 - CH₃CN/H2O 3.fraksiyon 0,1064 0,0726 0,0474 - CH₃CN/CH₃OH (80:20) Yıkama - 0,1308 - - CH₃CN/CH₃OH (60:40) Yıkama - - 0,0708 0,1880 CH₃CN/CH₃OH (40:60) Yıkama - - - 0,2145 CH₃CN/CH₃OH (20:80) Yıkama - 0,0650 - - CH₃OH Yıkama - 0,0815 - -

Şekil 3.181. Taksan standardı 1.fraksiyonun (siyah) ve standart karışımın (kırmızı) hplc kromatoğramı.

Şekil 3.182. Taksan standardı 1.fraksiyonunun (siyah) ve taksan standardı 2.fraksiyonunun (kırmızı) hplc kromatoğramı.

Şekil 3.183. Taksan standardı 2.fraksiyonunun (siyah) ve standart karışımın (kırmızı) hplc kromatoğramı.

Şekil 3.184. Taksan standardı 2.fraksiyonunun (siyah) ve 3.fraksiyonunun (kırmızı) hplc kromatoğramı.

Şekil 3.185. Taksan standardı 3.fraksiyonunun (siyah) ve standart karışımın (kırmızı) hplc kromatoğramı.

Şekil 3.186. Taksan standardı CH₃CN/CH₃OH (80:20) yıkaması (siyah) ve standart karışımın (kırmızı) hplc kromatoğramı.

Şekil 3.187. Taksan standardı CH₃CN/CH₃OH (60:40) yıkaması (siyah) ve standart karışımın (kırmızı) hplc kromatoğramı.

Şekil 3.188. Taksan standardı CH₃CN/CH₃OH (40:60) yıkaması (siyah) ve standart karışımın (kırmızı) hplc kromatoğramı.

Şekil 3.189. Taksan standardı CH₃CN/CH₃OH (20:80) yıkaması (siyah) ve standart karışımın (kırmızı) hplc kromatoğramı.

Şekil 3.190. Taksan standardı CH₃OH yıkaması (siyah) ve CH₃OH yıkamasının (kırmızı) hplc kromatoğramı.

3.2.6.3. Sert Kabuk Ekstraktı Çalışması Sonuçları

Kolonda toplamda 3 adet 10’ar ml fraksiyon ve 1,5 ml’lik CH₃CN:CH₃OH ile 80:20, 60:40, 40:60, 20:80 ve %100 CH₃OH yıkaması gerçekleştirilerek toplama işlemi yapılmıştır. Yürütücü faz olarak CH₃CN/H2O (1:1) elüenti kullanılmıştır. Kolona 40µL

sert kabuk ekstraktı enjekte edilmiştir. Toplanan her fraksiyon evapore edilip elde edilen katı 2 ml CH₃OH çözeltisi ile çözdürülüp akabinde 0.20 µm filtreden süzülerek viallenmiştir.

Çizelge 3.14. Sert kabuk ekstraktı çalışması geri kazanım (ppm) değerleri.

10-DAB III Bakkatin III Sefalomannin Paklitaksel CH₃CN/H2O 1.fraksiyon 1,2508 0,3640 - - CH₃CN/H2O 2.fraksiyon 0,0957 0,0640 - - CH₃CN/H2O 3.fraksiyon 0,0701 0,0329 - - CH₃CN/CH₃OH (80:20) Yıkama 0,0527 - - - CH₃CN/CH₃OH (60:40) Yıkama - 0,0456 - - CH₃CN/CH₃OH (40:60) Yıkama - 0,1263 - - CH₃CN/CH₃OH (20:80) Yıkama - 0,1352 - - CH₃OH Yıkama - - - -

Şekil 3.191. Sert kabuk ekstraktı stok (siyah) ve 1.fraksiyonun (kırmızı) kromatoğramı.

Şekil 3.192. Sert kabuk ekstraktı 1.fraksiyonu (siyah) ve standart karışımın (kırmızı) kromatoğramı.

Şekil 3.193. Sert kabuk ekstraktı 1.fraksiyonu (siyah) ve 2.fraksiyonunun (kırmızı) kromatoğramı.

Şekil 3.194. Sert kabuk ekstraktı 2.fraksiyonu (siyah) ve standart karışımın (kırmızı) hplc kromatoğramı.

Şekil 3.195. Sert kabuk ekstraktı 2.fraksiyonu (siyah) ve 3.fraksiyonunun (kırmızı) hplc kromatoğramı.

Şekil 3.196. Sert kabuk ekstraktı 3.fraksiyonu (siyah) ve standart karışımın (kırmızı) hplc kromatoğramı.

Şekil 3.197. Sert kabuk ekstraktı 3.fraksiyonu (siyah) ve CH₃CN/CH₃OH (80:20) (kırmızı) yıkamasının hplc kromatoğramı.

Şekil 3.198. Sert kabuk ekstraktı CH₃CN/CH₃OH (80:20) yıkamasının (siyah) ve standart karışımın (kırmızı) hplc kromatoğramı.

Şekil 3.199. Sert kabuk ekstraktı CH₃CN/CH₃OH (80:20) yıkamasının (siyah) ve (60:40) yıkamasının (kırmızı) hplc kromatoğramı.

Şekil 3.200. Sert kabuk ekstraktı CH₃CN/CH₃OH (60:40) yıkamasının (siyah) ve standart karışımın (kırmızı) hplc kromatoğramı.

Şekil 3.201. Sert kabuk ekstraktı CH₃CN/CH₃OH (60:40) yıkamasının (siyah) ve (40:60) yıkamasının (kırmızı) hplc kromatoğramı.

Şekil 3.202. Sert kabuk ekstraktı CH₃CN/CH₃OH (40:60) yıkamasının (siyah) ve standart karışımın (kırmızı) hplc kromatoğramı.

Şekil 3.203. Sert kabuk ekstraktı CH₃CN/CH₃OH (40:60) yıkamasının (siyah) ve (20:80) yıkamasının (kırmızı) hplc kromatoğramı.

Şekil 3.204. Sert kabuk ekstraktı CH₃CN/CH₃OH (20:80) yıkamasının (siyah) ve standart karışımın (kırmızı) hplc kromatoğramı.

Şekil 3.205. Sert kabuk ekstraktı CH₃CN/CH₃OH (80:20) yıkamasının (siyah) ve CH₃OH yıkamasının (kırmızı) hplc kromatoğramı.

Şekil 3.206. Sert kabuk ekstraktı CH₃OH yıkamasının (siyah) ve standart karışımın (kırmızı) hplc kromatoğramı.

4. SONUÇ VE ÖNERİ

Sentez çalışmalarının akabinde elde ettiğimiz afinite adsorbanların uygulama çalışmaları gerçekleştirilmiştir. Bu bağlamda sentezlenen Tübülin immobilize silika (5), Mono-6-deoksi-6-azido-β-siklodekstrinin 3-Aminopropilsilikaya immobilizasyonu (15), 3-Aminopropil silikaya β-Siklodekstrin immobilizasyonu (13), β-siklodekstrinin Silika- Glisidiloksiye immobilizasyonu (10) adsorbanlarının saf paklitaksel, paklitakselinde içinde bulunduğu taksan standartları karışımı, sert kabuk ekstraktlarındaki paklitakselin saflaştırılmasına olan etkisi incelenmiştir. Elde edilen sonuçlara baktığımızda;

Tübülin immobilize silika (5), kolonunda yapılmış olan paklitakselin içinde bulunduğu standart karışım sonuçlarında paklitakselin %10’u eluantlarda tayin edilirken, saf paklitakselde ise bu oranın %1 olduğu, geri kalan miktarların ise kolonda tutulu olduğu görülmüştür. Aynı kolonda fındık sert kabuğu ekstraktı çalışmasında paklitakselin metanol yıkaması ile birlikte %16’sının eluantlarda tayin edildiği görülmüştür.

Mono-6-deoksi-6-azido-β-siklodekstrinin 3-Aminopropilsilikaya immobilizasyonu (15), kolonunda yapılmış olan hem saf paklitaksel hem de paklitakselinde içinde bulunduğu standart karışım sonuçlarına baktığımızda; stok konsantrasyonu 10 ppm iken eluentlerin geri kazanımı karışım için toplam 0,1453 ppm, saf paklitaksel de 0,310 şeklinde bulunmuştur. Saf metanol ile yıkmada dahi paklitakselin tespit edilemediği görülmüştür. Bu durumda paklitakselin kolonda kuvvetli etkileşimle tutunduğu saf metanole bile geri kazanılamadığı görülmektedir. Kolonda paklitakselin tutunma yüzdesi hem karışım için hem de saf paklitaksel için %98 olarak hesaplanmıştır. Aynı kolonda fındık sert kabuğu ekstraktı çalışmasında ise eluant toplamada %7’si tayin edilmiş, %93’nün ise kolonda tutulu olduğu anlaşılmıştır.

3-Aminopropil silikaya β-Siklodekstrin immobilizasyonu (13), kolonundayapılmış olan hem saf paklitaksel hem de paklitakselinde içinde bulunduğu standart karışım sonuçlarına baktığımızda; stok konsantrasyonu 10 ppm iken eluentlerin geri kazanımı karışım için toplam 5,99 ppm, saf paklitaksel de 3,97 ppm şeklinde bulunmuştur. Saf metanol ile yıkamada karışımdan kazanılan paklitakselin 1,96 ppm, saf paklitakselden kazanılan 2,07 ppm tespit edildiği görülmüştür. Paklitakselin kolonda tutunma yüzdesi karışım için %40 iken saf paklitaksel için %60 olarak hesaplanmıştır. Aynı kolonda

fındık sert kabuğu ekstraktı çalışmasında paklitaksel hem eluant toplamada hem de geri yıkama da paklitaksel tayin edilememiş olup tamamı kolonda tutunmuştur.

β-siklodekstrinin Silika-Glisidiloksiye immobilizasyonu (10), kolonunda yapılmış olan hem saf paklitaksel hem de paklitakselinde içinde bulunduğu standart karışım sonuçlarına baktığımızda; CH₃CN/CH₃OH (60:40) ile yıkamadan itibaren paklitakselin eluantlarda tayin edildiği görülmüştür. Eluantlarda toplanan paklitakselin %4 olduğu, geri kalan %96’nın ise kolonda tutulu kaldığı görülmüştür. Saf paklitakselin kolonda yürütülmesinde ise %98’inini tutulu kaldığı görülmektedir. Aynı kolonda fındık sert kabuğu ekstraktı çalışmasında paklitaksel için hem eluant toplamada hem de geri yıkama da paklitaksel tayin edilememiş olup tamamının kolonda tutulduğu anlaşılmıştır.

Sentezlenen ürünlerin ara basamakları ve son ürünleri piyasada çok yüksek maliyetlidir. Başlangıç ürünlerinden sentezlenerek ekonomik anlamda da bir kazanç sağlanmıştır. Elde edilen ürünlerin literatürde özgün olması da ayrıca bu tez çalışması için önemli bir sonuç olmuştur. Ülke ekonomisine böylesine ekonomik ve faydalı adsorbanları kazandırdığımız için kıvanç duyuyoruz.

5. KAYNAKLAR

[1] A. Sudhakar, “History of Cancer, Ancient and Modern Treatment Methods,” Manuscript and M. T. Methods, NIH Public Access, vol. 1, no. 2, pp. 1–4, 2010.

[2] J.-J. Zhong, “Plant cell culture for production of paclitaxel and other taxanes,”

Journal of Bioscience and Bioengineering, vol. 94, no. 6, pp. 591–599, 2002.

[3] M. Miele and A. Maria, “Hazel and other sources of paclitaxel and related compounds,” Phytochemistry reviews, vol. 11, no. 3, pp. 211–225, 2012.

[4] P. Landre, R. Hocquemiller, G. Parc, and D. Chriqui, “Production of taxoids with biological activity by plants and callus culture from selected taxus genotypes,”

Phytochemistry, vol. 59, pp. 725–730, 2002.

[5] M. K. Uludağ, “Antikanser etkili bazı indol türevlerinin araştırılması,” Doktora tezi, Farmöstik Kimya Bölümü, Erciyes Üniversitesi, Kayseri, Türkiye, 2012.

[6] Heinstein, P.F, Chang, C. "Taxol" Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol, vol. 45, pp. 663-674, 1994.

[7] J. D. Adams, K. P. Flora, B. R. Goldspiel, J. W. Wilson and R. Finley, “Taxol: a history of pharmaceutical development and current pharmaceutical concerns,” Journal

of the National Cancer Institute Monographs, vol. 15, pp. 141–147, 1993.

[8] Kingston. D.G.I, Ganesh, T, Guza, R.C., Ravindra, R., Shanker, N., Lakdawala, A. S., Snyder, J. P. ‘The bioactive taxol conformation on β-tubulin: experimental evidence from highly active constrained analogs’ PNAS. vol. 101, pp. 10006-10011, 2004.

[9] Malcos. J.L, Hancock. W.O. “Engineering tubulin: microtubule functionalization approaches for nanoscale device applications.” Appl Microbiol

Biotechnol, vol. 90, pp. 1–10, 2011.

[10] Parness, J.; Horwitz, S. B. “Taxol binds of polymerized tubulin in vitro” J. Cell.

Biol.,” vol. 91, pp. 479, 1981.

[11] Ibrahim NK, Desai N, Legha S, Soon-Shiong P, Theriault RL, Rivera E, et al. “Phase I and pharmacokinetic study of ABI-007, a Cremophorfree, protein-stabilized, nanoparticle formulation of paclitaxel.” Clin Cancer Res; vol. 8: pp. 1038–44, 2002. [12] Rao S.; He, L. F; Chakravarty, S.; Ojima, I.; Orr, G. A.; Horwitz, S. B. “Characterization of the Taxol binding site on the microtubule. identification of Arg(282) in beta-tubulin as the site of photoincorporation of a 7-benzophenone analogue of taxol.” Journal of Biological Chemistry, vol. 274, pp. 37990-37994, 1999. [13] Berkem. A. R. Baykut, S. Berkem, M. L. “Fizikokimya,” İstanbul, Türkiye: Gazi Üniversitesi Basımevi, 1994

[14] Sarıkaya Y. “Fizikokimya,” Ankara, Türkiye: Gazi Büro Kitabevi,. 1993.

[15] Loftsson T., Jarho P., Másson M. and Järvinen T., “Cyclodextrins in drug delivery, Expert Opin.”Drug Deliv. vol. 2, pp. 335-351, 2005.

[16] Yamamoto, Y. and Tagawa, S., “Radiolytically prepared poly(vinyl alcohol) hydrogel containing α-cyclodextrin,” Radiation Physics and Chemistry, vol. 69, pp. 347–349, 2004.

[17] Del Valle, E.M.M. “Cyclodextrins and their uses: a review,” Process

Biochemistry, vol. 39, pp. 1033–1046, 2004.

[18] Arslan O, “Glaucoma tedavisinde kullanılmaya aday karbonik anhidraz inhibitörlerinin sentezi ve inhibisyon etkilerinin araştırılması”, Doktora tezi, Atatürk Üniversitesi, Fen Bilimleri Enstitüsü Kimya Anabilim Dalı, Erzurum, 1994.

[19] Arslan O., “Biyomoleküller teori ve uygulamaları,” Balıkesir, Türkiye: Onur Kitabevi., 2007.

[20] A. Ponchel, S. Abramson, J. Quartararo, D. Bormann, Y. Barbaux, E. Monflier “Cyclodextrin silica-based materials: advanced characterizations and study of their complexing behavior by diffuse reflectance UV-Vis spectroscopy, ” Microporous and

Mesoporous Materials, Elsevier, vol. 75, pp. 261, 2004.

[21] Bernadette Brady, Nuala Lynam, Thomas O'Sullivan, Cormac Ahern, and Raphael Darcy, “6A-O-p-toluenesulfonyl-β-cyclodextrin,” Org. Synth., vol. 77, pp. 220, 2000.

[22] L. Chena, L. Zhang, C. Ching, Siu-Choon Ng,“ Synthesis and chromatographic properties of a novel chiral stationary phase derived from heptakis(6-azido-6-deoxy-2,3- di-O-phenylcarbamoylated)-b-cyclodextrin immobilized onto amino-functionalized silica gel via multiple urea linkages,” Journal of Chromatography A, vol. 950, pp. 65– 74, 2002.

[23] Abu Zayed Md Badruddoza, “Beta-cyclodextrin Conjugated Magnetic Nanoparticles for Bio-and Environmental Applications,” Doktora tezi, Chemical & Biomolecular Engineering, National University of Singapore, Singapore, 2011.

[24] H.İbrahim Uğraş, “Paklitaksel Saflaştırılması İçin Yeni Yöntemler Ve Fındık Kabuğunda Uygulamaları,” yayınlanmamış rapor.

ÖZGEÇMİŞ

Adı Soyadı : Bora KARAGÜL

Doğum Tarihi ve Yeri : 13.12.1990 Kadıköy

Yabancı Dili : İngilizce

E-posta : borakaragul7@gmail.com

ÖĞRENİM DURUMU

Derece Alan Okul/Üniversite Mezuniyet Yılı

Y. Lisans Kimya Bölümü Düzce Üniversitesi 2017

Lisans Kimya Bölümü Düzce Üniversitesi 2014

Lise Matematik-Fen

Prof. Faik Somer Anadolu