Sağlıklı Kan Donörlerinde Brucella canis
Seropozitifliğinin Laboratuvar Yapımı
Lam Aglütinasyon Test Antijeni ile Araştırılması
Investigation of Brucella canis Seropositivity by In-House Slide
Agglutination Test Antigen in Healthy Blood Donors
Murat SAYAN1, Sevil ERDENLİĞ2, Nilay ETİLER3 1Kocaeli Üniversitesi Tıp Fakültesi, Merkez Laboratuvarı, Kocaeli.
1Kocaeli University Faculty of Medicine, Central Laboratory, Kocaeli, Turkey.
2Pendik Veterinerlik Kontrol ve Araştırma Enstitüsü, Brucella Laboratuvarı, İstanbul.
2Pendik Veterinary Control and Research Institute, Brucella Laboratory, Istanbul, Turkey.
3Kocaeli Üniversitesi Tıp Fakültesi, Halk Sağlığı Anabilim Dalı, Kocaeli.
3 Kocaeli University Faculty of Medicine, Department of Public Health, Kocaeli, Turkey.
ÖZET
Brucella canis’in neden olduğu köpek brusellozu, insanlara enfekte köpek ve köpek salgılarıyla te-mas sonucu bulaşmaktadır. Köpek brusellozunun insandaki klinik bulguları, diğer Brucella türlerinin yol açtığı bruselloz kliniğine benzemekte; tedavi edilmeyen olgularda endokardit ya da menenjit gibi cid-di komplikasyonlar gelişebilmektecid-dir. İnsanlarda B.canis enfeksiyonu ile ilgili yapılan çalışmalar oldukça sınırlı olup, hastalığın ülkemizdeki durumunu ortaya koyacak yeterli veri bulunmamaktadır. Brucella en-feksiyonlarının serolojik tanısında klasik olarak, standart lam ve tüp aglütinasyon testleri kullanılmakta-dır. Ancak bu testlerde kullanılan antijenler “smooth” lipopolisakkarid içeren hücre duvarına sahip tür-lere (B.melitensis, B.abortus, B.suis) karşı oluşan antikorları saptamakta, “rough” lipopolisakkarid içeren hücre duvarına sahip B.canis’e karşı oluşan antikorları tespit edememektedir. Ayrıca B.canis antijeninin kullanıldığı ticari bir lam aglütinasyon testi (LAT) kiti de mevcut değildir. Bu çalışmada, laboratuvarı-mızda hazırlanan B.canis antijeni kullanılarak, sağlıklı bireylerde B.canis seropozitifliğinin LAT ile araştı-rılması ve toplumdaki B.canis enfeksiyonu prevalansına ışık tutulması amaçlanmıştır. Çalışmaya, Koca-eli ilindeki çeşitli hastanelerin kan merkezlerine Ocak 2010-Aralık 2010 tarihleri arasında başvuran 1930 kan donörü (yaş aralığı: 18-55 yıl) dahil edilmiştir. Tüm bireyler, Rose-Bengal pleyt testi (B.abortus an-tijen testi) yönünden negatiftir. Serum örnekleri ilk aşamada sulandırılmadan LAT ile taranmış; pozitif
Geliş Tarihi (Received): 28.02.2011 • Kabul Ediliş Tarihi (Accepted): 30.06.2011
İletişim (Correspondence): Dr. Murat Sayan, Kocaeli Üniversitesi Tıp Fakültesi, Merkez Laboratuvarı,
sonuç veren örnekler 1/25-1/200 dilüsyonlarda tekrar LAT ile çalışılmış ve doğrulama 2-merkaptoeta-nol (2-ME) LAT yöntemi ile yapılmıştır. Test antijeni (Alton antijeni), B.canis’in az mukoid olan M(-) var-yant suşundan hazırlanmış; pozitif kontrol olarak 1/1048 titrede pozitif köpek antiserumu kullanılmış-tır. Çalışmamızda, 1930 kan donöründen alınan serum örneklerinin 40 (%2.1)’ında LAT ile pozitiflik saptanmış; 2-ME LAT ile bu örneklerin 16’sı şüpheli pozitif (12’si 1/50, 4’ü 1/100 titrede), 15’i ise po-zitif (≥ 1/200 titrede) sonuç vermiştir. Buna göre çalışmamızda, sağlıklı bireylerdeki B.canis seropopo-zitif- seropozitif-liği %1.6 (31/1930) olarak belirlenmiştir. B.canis LAT yönteminin, özellikle bruselloz şüpheli olguların değerlendirilmesinde rutin serolojik taramalara dahil edilmesi, enfeksiyonun epidemiyolojisi ile ilgili bil-gi ve verilerin elde edilmesine olanak sağlayabilir. Sonuç olarak bu çalışmada saptadığımız %1.6 ora-nındaki B.canis seroprevalansı, enfeksiyonun ülkemizdeki durumu konusunda genel bir fikir verse de, farklı grupları (hasta, sağlıklı ve risk grupları) içeren daha geniş olgu sayıları ile yapılacak çok merkezli çalışmalara gereksinim vardır.
Anahtar sözcükler: Brucella canis; antijen; seroprevalans; lam aglütinasyon testi; kan donörü.
ABSTRACT
Canine brucellosis which is due to Brucella canis, is transmitted to man by infected dogs or their secretions. The symptoms of canine brucellosis are similar to the symptoms of brucellosis caused by other Brucella species and endocarditis or meningitis may develop in untreated cases. There is limited data regarding B.canis infections in man and the current status of the disease is insufficiently evaluated in our country. Serological diagnosis of brucellosis is classically based on standard slide and tube agg-lutination tests. However, the antigens used in these tests detect antibodies that develop against spe-cies (B.melitensis, B.abortus, B.suis) with “smooth” lipopolysaccharides in their cell wall. B.canis has “ro-ugh” lipopolysaccharide in its cell wall and thus these classical tests can not detect antibodies against B.canis. Besides there is no commercial slide agglutination test which uses B.canis antigens. The aim of this study was to investigate the B.canis seropositivity by slide agglutination test (SAT), using home-made B.canis antigen, in healthy subjects and to determine the prevalence of B.canis infection in our population. A total of 1930 blood donors (age range: 18-55 years) who were admitted to the blood donation centers of different hospitals in Kocaeli province (located at Northwestern part of Turkey) between January-December 2010, have been included in the study. All of the subjects were negative in terms of Rose-Bengal plate test (B.abortus antigen test). Undiluted serum samples were initially screened by SAT, and those which were found positive were retested by SAT in the dilutions of 1/25 -1/200. Confirmation of the positive results was performed by using 2-mercaptoethanol (2-ME) SAT. The test antigen (Alton antigen) was prepared from the less mucoid M(-) variant of B.canis, and 1/1048 titered dog antiserum was used as positive control. Of the 1930 blood donors’ sera, 40 (2.1%) were found positive with SAT, whereas 16 of them yielded equivocal positive (12 were 1/50, 4 were 1/100 titers) and 15 yielded positive (≥ 1/200 titer) results with 2-ME SAT. As a result, B.canis seropo-sitivity rate in the healthy subjects in this study was estimated as 1.6% (31/1930). The integration of B.canis SAT to the routine serological tests applied for brucellosis diagnosis might aid to the data rela-ted to brucellosis epidemiology. B.canis seroprevalence determined as 1.6% in this study supplied a basic data about the infection in our country. However, larger scale, multicenter studies with different patient and risk groups should be conducted to further evaluate the epidemiology of B.canis infecti-ons in Turkey.
GİRİŞ
İlk olarak 1966 yılında Amerika Birleşik Devletleri (ABD)’nde tanımlanan köpek brusel-lozu, dünya genelinde köpeklerde görülen abortus ve infertilitenin önemli bir nedenidir1. Etken olan Brucella canis’in insana bulaşı, enfekte köpek ya da köpek salgılarıyla temas ve laboratuvar enfeksiyonu sonucu gerçekleşir. Köpek brusellozunun insandaki klinik bulgu-ları, diğer Brucella türlerinin yol açtığı bruselloz kliniğine benzemektedir2. Tedavi edilme-yen olgularda endokardit ya da menenjit komplikasyonları nedeniyle %2-5 oranında ölüm görülebilmektedir. Öte yandan klinik olarak sağlıklı görünen köpeklerde veneral bu-laşmanın en az iki yıl daha devam edebilmesi nedeniyle, hastalığın bulaşmasını önleyici tedbirlerin alınmasının ve erken teşhis edilmesinin önemi ortaya çıkmaktadır3.
Brucella Rose-Bengal pleyt testi (RBPT) antijeni, S-LPS (smooth lipopolysaccharide) hücre duvarına sahip B.melitensis, B.abortus ve B.suis enfeksiyonlarının serolojik tanısında tarama amaçlı kullanılmaktadır. Ancak “rough” LPS (R-LPS) hücre duvarına sahip B.canis ve B.ovis enfeksiyonların tanısı için benzer standart bir lam aglütinasyon testi (LAT) anti-jeni mevcut değildir. Bu çalışmada, laboratuvarımızda hazırlanan B.canis LAT antianti-jeni kul-lanılarak Kocaeli ilinde kan merkezlerine başvuran sağlıklı bireylerde B.canis seropozitifli-ğinin saptanması ve toplumdaki B.canis enfeksiyonu prevalansına ışık tutulması amaçlan-mıştır.
GEREÇ ve YÖNTEM Çalışma Grubu
B.canis prevalansının %2 olduğu varsayılarak α= 0.05 ve β= 0.20 olarak alındığında, Kocaeli ilinde, araştırmaya alınması gereken en az kişi sayısı 1537 olarak hesaplandı4. Bu-na göre çalışma grubu, Kocaeli ilinde çeşitli hastanelerin kan bankalarıBu-na Ocak 2010-Aralık 2010 tarihleri arasında başvuran 1930 sağlıklı bireyden (yaş aralığı: 18-55 yıl) oluş-turuldu. Tüm örneklerde RBPT (B.abortus antijen testi) negatifti.
Çalışma Reaktifleri ve B.canis LAT Antijeninin Hazırlanması
Stok reaktifler, Alton5yöntemi dikkate alınarak hazırlandı. Buna göre, stok 1: forma-linli tuzlu su solüsyonu [10 ml formaldehid (%37-40), 90 ml tuzlu su (%0.85 NaCl)]; stok 2: tuzlu su solüsyonu (%3.5); stok 3: PBS (phosphate-buffered saline) tamponu (pH: 7.0) ve stok 4: B.canis antijeni (Alton antijeni) içermekte idi. Stok 4’ün hazırlanma-sı için, B.canis M(-) suşunun fermentördeki 96 saatlik kültürünün 70°C’de bir saat inak-tivasyonundan sonra, kültür 10.000 g’da 30 dakika santrifüj edildi. Süpernatan atıldı ve kültür %0.5 formalinli PBS (95 ml PBS + 5 ml stok 1) ile üç kez yıkandı. Antijenin yoğun-luğu %4.5 olacak şekilde ayarlanarak +4°C’de saklandı5. Çalışmada kullanılan antijen süspansiyonu (%3.5 NaCl, %0.06 formalin ve %0.2 hücre), 100 ml’lik ana solüsyondan (0.6 ml stok 1 + 99.4 ml stok 2) 4.4 ml atılması ve aynı miktarda stok 4’ün ilave edilme-siyle hazırlandı.
2); 2 no’lu dilüent ise 100 ml hazırlanmış ana solüsyondan (0.6 ml stok 1 + 99.4 ml stok 2) 0.7 ml atılıp aynı miktarda 2-merkaptoetanol (2-ME) ilavesiyle hazırlanan 2-ME ilave-li solüsyon (%3.5 NaCl, %0.06 formailave-lin, 0.1M 2-ME) idi.
LAT’ın Uygulanması ve Değerlendirilmesi
Çalışmaya alınan tüm serum örnekleri, ilk aşamada sulandırım yapılmaksızın LAT ile tarandı. Bu amaçla, lam üzerine bir damla (0.05 ml) serum örneği konularak aynı hacim-de çalışma antijeni eklendi. Karışım üç dakika boyunca nazikçe çalkalanarak aglütinasyon yönünden incelendi. Sonuçlar negatif, tam olan ve tam olmayan aglütinasyon olarak de-ğerlendirildi. Tam olan ve tam olmayan aglütinasyon veren örneklerin 1/25, 1/50, 1/100 ve 1/200 dilüsyonları, hem 1 no’lu hem de 2 no’lu (2-ME ilaveli) dilüent kullanılarak ay-rı ayay-rı hazırlandı. Daha sonra dilüsyonlu örneklerin tekrar LAT ile titrasyonu ve 2-ME LAT ile doğrulaması yapıldı. 2-ME’li test sonuçlarının değerlendirilmesinde, 1/50’nin altında-ki tam ve tam olmayan aglütinasyonlar negatif; 1/50-1/100 arasındaaltında-ki aglütinasyon ile 1/200’de tam olmayan aglütinasyonlar şüpheli; 1/200 dilüsyonda tam aglütinasyon gö-rülmesi ise pozitif olarak kabul edildi6.
Çalışmada pozitif kontrol olarak 1/1048 titrede pozitif köpek antiserumu kullanıldı ve aynı şekilde (1/25, 1/50, 1/100 ve 1/200) sulandırılarak her çalışmada test edildi.
BULGULAR
Çalışmamızda, 1930 kan donöründen alınan serum örneklerinin 40 (%2.1)’ında LAT ile pozitiflik saptanmış; pozitif örnekler 2-ME LAT ile doğrulamaya alındığında, 9 örnek negatif, 16 örnek şüpheli pozitif ve 15 örnek pozitif sonuç vermiştir (Tablo I). Çalışma grubunun ayrıntılı sonuçları Tablo II’de gösterilmiştir. Buna göre sağlıklı bireylerde B.ca-nis enfeksiyonu seroprevalansı %1.6 (31/1930) olarak belirlenmiştir.
TARTIŞMA
Brucella enfeksiyonları ile ilgili oldukça kapsamlı bilgi ve bulgu olmasına rağmen, in-sanlarda B.canis enfeksiyonları ile ilgili yapılan çalışmalar son derece sınırlı olup, hastalı-ğın ülkemizdeki mevcut durumunu ortaya koyacak yeterli veri bulunmamaktadır. Sağlık-lı bireylerde B.canis enfeksiyonunun seroprevalansını belirlemek, enfeksiyonun toplum-daki varlığını ve kaynağını göstermesi bakımından önemli olabilir. Bu çalışmada, brusel-loz benzeri semptomu olmayan sağlıklı yetişkinlerde B.canis enfeksiyonunun seropreva-lansı %1.6 (31/1930) olarak belirlenmiştir. Yaptığımız diğer bir çalışmada da, ülkemizin tüm bölgelerinden elde edilen RBPT negatif ancak bruselloz benzeri semptomlu 1746
Tablo I. Sağlıklı Bireylerde LAT ve 2-ME LAT ile Saptanan B.canis Antikor Titrelerinin Dağılımı Titre
Yöntem 1/25 1/50 1/100 1/200 > 1/200 Toplam
LAT 6 1 5 5 23 40
2-ME LAT - 12 (ŞP) 4 (ŞP) 10 5 31
Tablo II.
B.canis Antikor Pozitifliği Saptanan Sağlıklı Bireylerde LA
Tablo II.
B.canis Antikor Pozitifliği Saptanan Sağlıklı Bireylerde LA
T ve 2-ME LA T Sonuçları (devamı) 1/25 1/50 1/100 1/200 Serum no LA T 2-ME LA T L A T 2-ME LA T L A T 2-ME LA T L A T 2-ME LA T S onuç 22 +++ + + + + + + -1/100 ŞP 23 ++ + + + + + -1/100 ŞP 24 ++++ ++ ++++ ++ ++++ ++ ++ + 1/200 P 25 ++++ ++++ ++++ ++++ ++++ ++++ ++++ + 1/200 P 26 ++++ ++ ++++ ++ ++++ + ++++ + 1/200 P 27 ++++ ++ ++++ ++ ++++ + ++++ + 1/200 P 28 ++++ ++++ ++++ ++++ ++++ +++ ++++ + 1/200 P 29 ++++ ++ ++++ + ++++ -++++ -1/50 ŞP 30 ++++ -+++ -+ + -++ -N 31 ++++ + ++++ + ++++ -++++ -1/50 ŞP 32 ++++ + ++++ + ++++ -++++ -1/50 ŞP 33 ++++ ++ ++++ ++ ++++ + ++++ + 1/200 P 34 ++++ + ++++ + ++++ + ++++ -1/100 ŞP 35 ++++ + ++++ + ++++ -++++ -1/50 ŞP 36 +++ + + + + + -1/50 ŞP 37 ++++ ++ ++++ + ++++ -++++ -1/50 ŞP 38 ++++ + ++++ + ++++ -++++ -1/50 ŞP 39 + - -N 40 ++++ + ++++ + ++++ -++++ -1/50 ŞP PK ++++ ++++ ++++ ++++ ++++ ++++ ++++ ++++ > 1/200 P LA T:
Lam aglütinasyon testi, 2-ME LA
T:
2-merkaptoetanol ile yapılan lam aglütinasyon testi, P: Pozitif, N: Negatif, ŞP: Şüphel
i pozitif, PK: Pozitif kontrol (1/1048 titrede
hastada B.canis enfeksiyonu seroprevalansı %3.7 oranında saptanmıştır (henüz yayınlan-mamış veri). Bu durum, ülkemizde, insanlarda B.canis’e bağlı gelişen enfeksiyonun, bil-dirilen olgulardan daha fazla olduğunu akla getirmektedir. Bunun önemli bir nedeni, brusellozun rutin serolojik tanısında kullanılan antijenin B.canis enfeksiyonunu saptaya-mamasıdır. Öte yandan insanlarda rutin bruselloz tanısında B.canis’in sebep olduğu bru-sellozun akla gelmemesi de bir diğer neden olabilir. İnsanlarda B.canis’e karşı oluşan an-tikorlar, S-LPS B.abortus S99 suşu ile çapraz reaksiyon vermemektedir. Bu nedenle bru-selloz benzeri semptomlu ve RBPT ile negatif reaksiyon veren hastalarda B.canis’e bağlı enfeksiyon olasılığı akla gelmelidir. Bu hastalara ait örneklerin R-LPS içeren suşlar ile ha-zırlanan LAT ile değerlendirilmesi B.canis brusellozunun insanlarda tanısı açısından önemli olabilir2. Diğer yandan bizim çalışmamızda %1.6 olarak saptanan B.canis sıklığı, toplumdaki sağlıklı bireylerin ve çoğunlukla kentsel bölgede yaşayan kişilerin araştırma-ya alınmasından dolayı iyimser bir tahmindir. Çalışmanın toplumu temsil eden, kır ve kent dağılımını da göz önünde bulunduran bir örnek üzerinde yapılması durumunda sık-lığın daha fazla çıkması beklenmelidir. Bu çalışmanın sonuçlarını önceki çalışmamızla kar-şılaştırdığımızda, bruselloz benzeri semptomları olanlarda asemptomatik kişilere göre 2.3 kat daha fazla seropozitiflik olduğu görülmektedir.
B.canis seroprevalans oranlarının Meksika, Orta ve Güney Amerika’da oldukça yüksek (%20-30) olduğu bildirilmekte; hastalığın dünya genelinde görülmesine rağmen gerçek prevalansının birçok ülkede tam olarak bilinmediği ifade edilmektedir1,2. Ülkemizde B.ca-nis enfeksiyonu ile ilgili, genellikle tüp aglütinasyon testi (TAT) ile yapılmış az sayıda se-rolojik tarama çalışması bulunmaktadır. Köpeklerde yapılan çalışmalarda, 2-ME TAT yön-temi ile Ankara ilinde 1983 yılında 134 sağlıklı köpeğin %6.7’sinde, 1987 yılında 222 kö-peğin %6.3’ünde; İzmir ve İstanbul illerinde ise 2005 yılında toplam 362 kökö-peğin %7.7’sinde seropozitiflik saptanmıştır7-9. Ancak ülkemizde, insanlarda B.canis seropreva-lansı ile ilgili yapılan çalışmalar oldukça sınırlıdır. Diker ve arkadaşlarının10 çalışmasında, Bursa bölgesinde 123 hastanın 2 (%1.6)’sinde 2-ME TAT yöntemi ile B.canis seropozitif-liği bildirilmiştir. Köksal ve arkadaşları11ise Adana’da aynı yöntemle yaptıkları çalışmada, bruselloz şüphesi ile değerlendirilen hastalarda B.canis seropozitifliğini %8.3 (43/514) olarak tespit etmişlerdir. Konya ilinde risk altında bulunan 76 kişide B.canis enfeksiyonu seroprevalansının araştırıldığı bir çalışmada pozitiflik oranı %9.2 olarak rapor edilmiştir12. Buna karşın ülkemizde sağlıklı bireylerde B.canis seropozitifliğinin araştırıldığı bir çalışma-ya rastlanmamıştır.
B.canis enfeksiyonunun serolojik tanısında yaygın olarak kullanılan testler LAT, TAT ve 2-ME TAT yöntemleridir5. LAT, son derece duyarlı (≥ 99), hızlı, ekonomik ve değerlendir-mesi kolay pratik bir tarama testidir1,6,14. LAT ile B.canis enfeksiyonu, erken dönemde olu-şan yüksek IgM düzeyleri nedeniyle, 1-2 hafta içinde saptanabilir. LAT için en önemli de-zavantaj, görece olarak düşük özgüllüğü sebebiyle saptadığı çok sayıda yanlış pozitif ol-gulardır5. Ancak LAT’ın merkaptoetanol modifikasyonu, yalancı pozitif sonuca yol açan heterolog IgM antikorlarını gidermede oldukça başarılıdır ve testin özgüllüğünü artırmak-tadır6. 2-ME LAT’ın bir diğer modifikasyonu, B.ovis yerine B.canis’in daha az mukoid olan M(-) varyant suşunun antijen olarak kullanılmasıdır. Bu testte yalancı pozitiflik oranı %50’den %12’ye düşerken testin duyarlılığında bir değişiklik olmamaktadır1. Bizim çalış-mamızda da B.canis LAT antijeni M(-) suşundan hazırlanmış ve LAT ile pozitif sonuç veren 40 serumun 31 (%77.5)’i 2-ME LAT yöntemiyle doğrulanmıştır. TAT ve 2-ME TAT testleri ise, enfeksiyondan 3-6 hafta kadar sonra antikor titrelerini tespit edebilmektedir. Ancak bu testlerin en büyük dezavantajı, otoaglütinasyon oluşturması nedeniyle hemoliz olmuş se-rumların kullanılamaması, kronik evrelerde ya da henüz bakteriyeminin gelişmediği erken evrelerde antikor titrelerini saptamadaki yetersizlikler ve prezon fenomenidir6.
Sonuç olarak; sağlıklı erişkin bireylerde saptadığımız %1.6 oranındaki B.canis seropo-zitifliği, enfeksiyonun ülkemizdeki durumu konusunda genel bir fikir verebilir. B.canis an-tijeninin kullanıldığı ticari bir LAT kiti mevcut olmadığından, konu ile ilgili yapılacak olan diğer araştırmalara ışık tutabilmek amacıyla çalışmamızda, B.canis LAT antijeninin hazır-lanması ve yöntemin uyguhazır-lanması ile ilgili bilgiler açık olarak verilmiş ve B.canis aglüti-nasyon testlerinin yaygın bir şekilde yapılabilmesi hedeflenmiştir. Dolayısıyla B.canis LAT yönteminin, özellikle bruselloz şüpheli olguların değerlendirilmesinde rutin serolojik ta-ramalara dahil edilmesi, insanlarda enfeksiyonun epidemiyolojisine ilişkin çalışmaların artmasına ve risk gruplarında hastalıkla ilgili daha sağlıklı verilerin elde edilmesine olanak sağlayacaktır.
KAYNAKLAR
1. Carmicheal LE. Brucella canis, pp: 335-50. In: Nielsen K, Duncan JR (eds), Animal Brucellosis. 1990, CRC Press, Boca Raton, FL.
2. Polt SS, Dismukes WE. Human brucellosis caused by Brucella canis. Ann Intern Med 1982; 97(5): 717-9. 3. Centers for Disease Control and Prevention (CDC). Brucellosis. Available at
http://www.cdc.gov/nci-dod/dbmd/diseaseinfo/ brucellosis_t.html
4. Dawson-Saunders B, Trap RG. Basic & Clinical Biostatistics. 1994, 2nded. Appleton & Lange, Norwalk, CT.
5. Alton GG, Jones LM, Angus RD, Verger JM. Brucella canis, pp: 169-74. In: Techniques for the Brucellosis La-boratory. 1988, Institut National de la Recherche Agronomique, Paris, France.
6. Badakhsh FF, Carmicheal LE, Douglass JA. Improved rapid slide agglutination test for presumptive diagno-sis of canine brucellodiagno-sis. J Clin Microbiol 1982; 15(2): 286-9.
7. Istanbulluoglu E, Diker S. An serological analysis of Brucella canis. Ankara Univ Vet Fak Derg 1983; 30(1): 14-8.
9. Öncel T, Akan M, Sareyyüpoğlu B, Tel OY, Çiftçi A. Seroprevalence of Brucella canis infection of dogs in two provinces in Turkey. Turk J Vet Anim Sci 2005; 29(3): 779-83.
10. Diker S, Istanbulluoğlu E, Ayhan H, Soysal G. A serologic study of human Brucella canis infections in the Bur-sa region. Mikrobiyol Bul 1984; 18(4): 203-7.
11. Köksal F, Akan E, Başlamişli L, Diker S, Yiğit S, Ozcan K. Antibody levels to B.abortus, B.canis and C.burnetti in the sera of patients with brucellosis-like symptoms. Mikrobiyol Bul 1988; 22(2): 132-41.
12. Köylü Ö, Aras Z, Uçan US. Konya ilinde risk altında bulunan insanlarda Brucella canis infeksiyonu seropreva-lansı. İnfeksiyon Derg 2009; 23(2): 73-7.
13. OIE - World Organisation for Animal Health. Manual of Diagnostic Tests and Vaccines for Terrestrial Animals 2011. Bovine brucellosis, Chapter 2.4.3. Available at: http://www.oie.int/international-standard-setting/ter-restrial-manual/access-online
