Keşşaf Biyoteknoloji Ar-Ge ve Mühendislik Hiz. San. Tic. Ltd. Şti Numuneleri Performans Değerlendirme Testi Sonuç Raporu YÖNTEM

(1)

1

Keşşaf Biyoteknoloji Ar-Ge ve Mühendislik Hiz. San. Tic. Ltd. Şti Numuneleri Performans Değerlendirme Testi Sonuç Raporu

Bu performans testi, Keşşaf Biyoteknoloji Ar-Ge ve Mühendislik Hiz. San. Tic. Ltd. Şti bünyesinde gerçekleştirmekte olunan bir ürünün mikroorganizmalar üzerindeki etkisini belirlemek amacı ile gerçekleştirilen performans testinin sonuçları aşağıda verilmiştir.

Çalışma numuneleri, E. coli ATCC 8739 mikroorganizması ve kromojenik reaksiyon gösterdiği katı besiyeri ortamı (RTA Chromogenic ECC Agar, 02013) (KA) (E. coli hücreleri yeşil renk vermektedir) Keşşaf Biyoteknoloji Ar-Ge ve Mühendislik Hiz. San. Tic. Ltd. Şti tarafından temin edilmiştir. Kromojenik agar petrileri (KA) dışında probiyotiklerin de izlenmesi amacıyla Nutrient broth agar (NBA) petrileri de kullanılmıştır.

Yapılan testler aşağıda detaylı olarak açıklanmıştır. Bu raporda yer alan tüm sonuçlar çalışılan bu numunelere ait sonuçlardır.

YÖNTEM

1. Canlı Hücre Sayımı (Kob=Cfu)

Gece boyu nutrient broth sıvı besiyerinde büyütülmüş olan E. coli kültürü 10^-1 ile 10^-8 arasında seri dilüsyon gerçekleştirilerek canlı hücre sayımı (Kob=Cfu) gerçekleştirilmiştir. Bu yapılırken her dilüsyondan 50’şer µl alınarak Nutrient Broth Agar (NBA) içeren petrilere yayılmış ve 37 ^oC’de 24 saat inkübasyona bırakılmıştır.

2. Negatif kontrol:

%70 etanol ile temizlenmiş olan 2 alana (Şekil 1), 50 µl steril tuz çözeltisi (%0,85’lik) damlatılarak, swab yardımıyla bir çok kez olacak şekilde her bir yüzeye ayrı ayrı sürtünülerek, bu alandan örnek alınmıştır. Daha sonra bu yüzeylerden birinden elde edilen ve swab ile alınan örnek Nutrient Broth Agar (NBA), diğeri ise Kromojenik Agar (KA) içeren petrideki besiyerinin tüm yüzeyine gelecek şekilde ayrı ayrı ekilmiştir. Elde edilen petriler 37 ^oC’de 24 saat inkübasyona bırakılmıştır. Yapılan çalışmalar sonucunda hem NBA hem de KA üzerindeki hücreler gözlemlenmiştir.

Şekil 1. Negatif kontrol çalışma yüzeyi

(2)

2 3. Pozitif kontrol:

2 ayrı alana (Şekil 2), her bir alan 10 cm x 7,5 cm olacak şekilde, yukarıda yoğunluğu verilen gece boyu büyütülen kültürün 1/10 (4.10⁸ hücre/ml) seyreltilmiş halinden yaklaşık olarak 250 µl püskürtme yapılmıştır. Bu alanlar kurumaya bırakılmıştır. Kuruma tamamlandıktan sonra 50 l steril tuz çözeltisi (%0,85’lik) damlatılarak, swab yardımıyla bir çok kez olacak şekilde her bir yüzeye ayrı ayrı sürtülünerek, bu alanlardaki hücrelerin swaplara geçmesi sağlanmıştır. Daha sonra bu yüzeylerden birinden elde edilen ve swab ile alınan örnek NBA, diğeri ise KA petrilerinin tüm yüzeyine gelecek şekilde ayrı ayrı ekilmiştir. Elde edilen petriler 37 ^oC’de 24 saat inkübasyona bırakılmıştır. Yapılan çalışmalar sonucunda hem NBA hem de KA üzerindeki hücreler gözlemlenmiştir.

Şekil 2. Pozitif kontrol çalışma yüzeyi 4. Çeşme Suyu Denemesi

2 ayrı alana (Şekil 3), her bir alan 10 cm x 7,5 cm olacak şekilde, yukarıda yoğunluğu verilen gece boyu büyütülen kültürün 1/10 (4.10⁸ hücre/ml) seyreltilmiş halinden yaklaşık olarak 250 µl püskürtme yapılmıştır. Bu alanlar kurumaya bırakılmıştır. Kuruma tamamlandıktan sonra her bir alana 250 µl olacak şekilde çeşme suyu püskürtülmüş ve kağıt havlu ile 1 kez tek yönlü olarak temizlenmiştir. Bu iki alana 50 l steril tuz çözeltisi (%0,85’lik) damlatılarak, swab yardımıyla birkaç kez olacak şekilde her bir yüzeye ayrı ayrı sürtünülerek, bu alanlardan örnek alınmıştır. Daha sonra bu yüzeylerden birinden elde edilen ve swab ile alınan örnek NBA, diğeri ise KA petrilerinin tüm yüzeyine gelecek şekilde ayrı ayrı ekilmiştir. Elde edilen petriler 37 ^oC’de 24 saat inkübasyona bırakılmıştır. Yapılan çalışmalar sonucunda hem NBA hem de KA üzerindeki hücreler gözlemlenmiştir.

(3)

3

Şekil 3. Çeşme suyu denemesi çalışma yüzeyi

5. Performans Testleri

Performans testleri pürüzsüz cam yüzeyler üzerinde gerçekleştirilmiştir. Her bir alan 10 cm x 7,5 cm olacak şekilde belirlenmiştir. Temizlenmiş olan cam yüzeyler çalışma öncesinde %70’lik etanol ile temizlenmiştir. Plate testleri ise hücre yayılan besiyeri petrileri üzerine numunelerin püskürtülmesi ile gerçekleştirilmiştir.

a. Yüzey Testi

Bu testte, Keşşaf Biyoteknoloji Ar-Ge ve Mühendislik Hiz. San. Tic. Ltd. Şti tarafından temin edilen, Fibiotic Parlak Yüzey Temizleyici (1/1), Fibiotic Genel Temizleyici (1/3) ve Farklı ürün (1/1) numunelerin performans testi gerçekleştirilmiştir.

Her bir numune için 10 cm x 7,5 cm ölçülerinde 8 alan ayrılarak bu alanların, her saat örneği için 2’şer tane olacak şekilde, 0. saat, 24. saat, 48. saat ve 72. saat olarak isimlendirilmesi sağlanmıştır. Her bir alan %70’lik etanol ile silindikten sonra kurumaya bırakılmıştır. Her bir alana, yoğunluğu verilen gece boyu kültürün 1/10 (4.10⁸ hücre/ml) seyreltilmiş halinden yaklaşık olarak 250 µl püskürtme yapılmıştır. Bu alanlar kurumaya bırakılmıştır.

Kuruma tamamlandıktan sonra her bir ilgili alana belirtilen numuneler ayrı ayrı olacak şekilde 250 µl olacak şekilde püskürtülmüş ve kağıt havlu ile 1 kez tek yönlü olarak temizlenmiştir. Her bir saat örneği için (0. saat, 24.

saat, 48. saat ve 72. saat) ilgili alanlara 50 µl steril tuz çözeltisi (%0,85’lik) damlatılarak, swab yardımıyla birkaç kez olacak şekilde her bir yüzeye ayrı ayrı sürtünülerek, bu alanlardan örnek alınmıştır. Daha sonra bu yüzeylerden birinden elde edilen ve her saat örneği için iki tane olan alanlardan elde edilen ve swab ile alınan örneklerden biri NBA, diğeri ise KA petrilerinin tüm yüzeyine gelecek şekilde ayrı ayrı ekilmiştir. Elde edilen petriler 37 ^oC’de 24 saat inkübasyona bırakılmıştır. Yapılan tüm çalışmalar sonucunda hem nutrient broth agar hem de kromojenik agardaki hücreler sayılarak not edilmiştir.

(4)

4 b. Plate Testi

Bu testte, Keşşaf Biyoteknoloji Ar-Ge ve Mühendislik Hiz. San. Tic. Ltd. Şti tarafından temin edilen, Fibiotic Parlak Yüzey Temizleyici (1/1), Fibiotic Genel Temizleyici (1/3) ve Farklı ürün (1/1) numunelerin performans testi gerçekleştirilmiştir.

10^-4 dilüsyonuna kadar seyreltilen başlangıç kültüründen 50 µl steril yayıcı yardımı ile 1 adet kontrol ve 3 adet de numuler için 1’er NBA ve KA petrilerine yayılmıştır. Ardından bu petrilerin üzerine Fibiotic Parlak Yüzey Temizleyici (1/1), Fibiotic Genel Temizleyici (1/3) ve Farklı ürün (1/1) numuneleri 250 µl hacimde püskürtülmüş, kontrol petrilerine ise bir numune püskürtmesi yapılmamıştır. Elde edilen petriler 37 ^oC’de 24 saat inkübasyona bırakılmıştır. Yapılan çalışmalar sonucunda hem NBA hem de KA üzerindeki hücreler gözlemlenmiştir.

Şekil 4. Numune püskürtme şişeleri

Şekil 5. Numune çalışma yüzeyleri

(5)

5

Şekil 6. Swablama ve petriye yayma çalışmasının görsel gösterimi

SONUÇLAR

1. Canlı Hücre Sayımı (Kob=Cfu)

Yapılan bu çalışma sonunda Bu analize göre kültürdeki bakteri yoğunluğu; 4.10⁹ hücre/ml olarak belirlenmiştir.

Şekil 7. Seri dilüsyon sonucu elde edilen örnek petri gösterimi (NBA) 2. Negatif kontrol

Negatif kontrolde hem NBA, hem de KA’da herhangi bir bakteri kolonisine rastlanmamıştır. (Şekil 8)

Şekil 8. Negatif Kontrol petrileri. Soldaki KA, sağdaki ise NBA petrisidir. Sağdaki petride koloni gibi gözüken noktalar inkübasyon sırasında besiyeri üzerinde oluşmuş hava kabarcıklarıdır.

(6)

6 3. Pozitif kontrol

Pozitif kontrol’de Nutrient broth agar hem de kromojenik agarda sayılamayacak kadar çok bakteri kolonisi elde edilmiştir. (Şekil 9)

Şekil 9. Pozitif Kontrol. Soldaki KA, sağdaki ise NBA petrisidir.

4. Çeşme suyu denemesi

Çeşme suyu tek başına yüzeydeki kirlilikleri uzaklaştırmaya yetmeyebileceği gibi kendisi kirlilik kaynağı oluşturabilmektedir. Elde edilen petrilerde, NBA’da koloni gözlenirken, KA’da sadece 1 adet koloni gözlenmiştir.

.

Şekil 10. Çeşme Suyu Denemesi. Soldaki KA, sağdaki ise NBA petrisidir.

(7)

7

5. Numunelerin Yüzey ve Plate Üzerinde Ayrı Ayrı Denenmesi

a. Yüzey Test Sonuçları

Numune Adı: Fibiotic Genel Temizlik (1/3)

Bu numuneye ait 0.saat örneklerinde (Şekil 11) , NBA’da nemden dolayı birleşmiş halde olduklarından net bir şekilde sayılamasalar bile, çokça koloni olduğu söylenebilmektedir. KA’da ise herhangi bir koloni oluşumuna rastlanmamıştır. 24.saat örneklerinde (Şekil 12), NBA’da 3 koloni gözlemlenmiştir. KA’da ise herhangi bir koloni oluşumuna rastlanmamıştır. 48.saat örneklerinde (Şekil 13), NBA’da 1 koloni gözlemlenmiştir. KA’da ise herhangi bir koloni oluşumuna rastlanmamıştır. Son olarak 72.saat örneklerinde (Şekil 14), NBA’da yine 1 koloni gözlemlenmiştir. KA’da ise herhangi bir koloni oluşumuna rastlanmamıştır. Buna göre tüm KA petrilerinde E. coli oluşumu gözlenemezken, NBA üzerinde gözlenen koloni sayıları özelinde ise en çok 0. saatte gözlenirken, 24.

saatte azalmış, 48. ve 72. saat örneklerinde ise 1 koloniye düşmüştür.

Şekil 11. Fibiotic Genel Temizlik (1/3) 0. saat petrileri. Soldaki KA, sağdaki ise NBA petrisidir.

(8)

8

Şekil 13. Fibiotic Genel Temizlik (1/3) 48. Saat petrileri. Soldaki KA, sağdaki ise NBA petrisidir.

Numune Adı: Fibiotic Parlak Yüzey Temizleyicisi (1/1)

Bu numuneye ait 0.saat örneklerinde (Şekil 15) , NBA’da nemden dolayı birleşmiş halde olduklarından net bir şekilde sayılamasalar bile, çokça koloni olduğu söylenebilmektedir. KA’da ise herhangi bir koloni oluşumuna rastlanmamıştır. 24.saat örneklerinde (Şekil 16), NBA’da sayılamayacak kadar çok koloni gözlemlenmiştir. KA’da ise herhangi bir koloni oluşumuna rastlanmamıştır. 48.saat örneklerinde (Şekil 17), NBA’da 4 koloni gözlemlenmiştir ve bu kolonilerin farklı morfolojide olduğu görülmektedir. Bu nedenle kolonilerin numunelerden mi kaynaklı olduğu konusunda farklı detaylı bir test yapılması uygun olacaktır. Bunun yanında aynı örneğe ait KA’da ise herhangi bir koloni oluşumuna rastlanmamıştır. Son olarak 72.saat örneklerinde (Şekil 18), NBA’da yine 25 koloni gözlemlenmiştir. KA’da ise herhangi bir koloni oluşumuna rastlanmamıştır. Buna göre tüm KA petrilerinde E. coli oluşumu gözlenemezken, NBA üzerinde gözlenen koloni sayıları özelinde ise en çok 24. saatte gözlenirken, 0. saatten 24. saat örneFklerinde gözle görünür bir artış göstermiştir. 48. saatte azalmış ve 72. Saat örneklerinde ise koloni sayısı tekrar artmış olarak gözlemlenmiştir.

(9)

9

Şekil 15. Fibiotic Parlak Yüzey Temizleyicisi (1/1) 0. saat petrileri. Soldaki KA, sağdaki ise NBA petrisidir.

(10)

10

Numune Adı: Farklı ürün

Bu numuneye ait 0.saat örneklerinde (Şekil 19), hem NBA hem de KA’da herhangi bir koloni oluşumuna rastlanmamıştır. 24.saat örneklerinde (Şekil 20), NBA’da 1 koloni gözlemlenmiş, KA’da ise herhangi bir koloni oluşumuna rastlanmamıştır. 48.saat örneklerinde (Şekil 21), hem NBA hem de KA’da herhangi bir koloni oluşumuna rastlanmamıştır. Son olarak 72.saat örneklerinde (Şekil 22), NBA’da yine 5 koloni gözlemlenmiştir.

KA’da ise herhangi bir koloni oluşumuna rastlanmamıştır. Buna göre tüm KA petrilerinde E. coli oluşumu gözlenemezken, NBA üzerinde gözlenen koloni sayıları özelinde, 0. Saatte hiç koloni gözlenmezken, 24. saatte 1 tane olarak gözlenen koloni sayısı, 72. saatte artarak 5 tane olarak gözlemlenmiştir.

Şekil 19. Farklı ürün 0. saat petrileri. Soldaki KA, sağdaki ise NBA petrisidir.

(11)

11

Şekil 21. Farklı ürün 48. saat petrileri. Soldaki KA, sağdaki ise NBA petrisidir. Sağdaki petride koloni gibi gözüken noktalar inkübasyon sırasında besiyeri üzerinde oluşmuş hava kabarcıklarıdır.

b. Plate test sonuçları

Pozitif Kontrol

Plate testi sonucunda, kontrol petrilerinde hem nutrient broth agar kromojenik agarda sayılamyacak kadar çok koloni oluşumu gözlenmiştir. (Şekil 23)

(12)

12

Şekil 23. Kontrol petrileri. Soldaki KA, sağdaki ise NBA petrisidir.

Numune Adı: Fibiotic Genel Temizlik (1/3)

Plate testi sonucunda, püskürtülen numuneler de göz önüne alındığında, bu numune için NBA ve KA petrilerinin her yerinde olmak üzere, sayılamayacak kadar koloni oluşumu gerçekleşmiştir. (Şekil 24)

Şekil 24. Fibiotic Genel Temizlik (1/3) petrileri. Soldaki KA, sağdaki ise NBA petrisidir.

Numune Adı: Fibiotic Parlak Yüzey Temizleyicisi (1/1)

Plate testi sonucunda, püskürtülen numuneler de göz önüne alındığında, bu numune için NBA’da sadece kenar kısmında çok sayıda koloni gözlemlenmiştir. KA’da ise petrinin tüm kenar kısımlarında büyüme gözlemlenmiştir.

İki petride de orta kısımda bir koloni oluşumu gözlenmemiştir. (Şekil 25)

Şekil 25. Fibiotic Parlak Yüzey Temizleyicisi (1/1) petrileri. Soldaki KA, sağdaki ise NBA petrisidir.

(13)

13 Numune Adı: Farklı Ürün (1/1)

Plate testi sonucunda, püskürtülen numuneler de göz önüne alındığında, bu numune için NBA’da birkaç koloni gözlemlenmiştir. KA’da ise petrinin ortalarındaki belirli bir alan hariç çok sayıda koloni gözlemlenmiştir. (Şekil 26)

Şekil 26. Farklı ürün petrileri. Soldaki KA, sağdaki ise NBA petrisidir.

Prof. Dr. Dilek KAZAN Arş. Gör. Dr. Orkun PİNAR Marmara Üniversitesi Marmara Üniversitesi Biyomühendislik Bölümü Biyomühendislik Bölümü