ANKARA ÜNĠVERSĠTESĠ FEN BĠLĠMLERĠ ENSTĠTÜSÜ
YÜKSEK LĠSANS TEZĠ
DERĠN ÖTEKTĠK ÇÖZGEN ÖN ĠġLEMĠNĠN BUĞDAY SAMANINDAN BĠYOETANOL ÜRETĠMĠNE ETKĠSĠ
Gizem Melissa ERDEM
GIDA MÜHENDĠSLĠĞĠ ANABĠLĠM DALI
ANKARA 2020
Her hakkı saklıdır
ii ÖZET
Yüksek Lisans Tezi
DERĠN ÖTEKTĠK ÇÖZGEN ÖN ĠġLEMĠNĠN BUĞDAY SAMANINDAN BĠYOETANOL ÜRETĠMĠNE ETKĠSĠ
Gizem Melissa ERDEM Ankara Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü Gıda Mühendisliği Anabilim Dalı
DanıĢman: Doç. Dr. Aslı ĠġCĠ YAKAN
Bu çalıĢmada; lignoselülozik bir madde olan buğday samanından fosil yakıtlara alternatif yenilenebilir bir biyoyakıt olan biyoetanol eldesi için mikrodalga destekli- derin ötektik çözgen (Kolin klorür:Formik asit) ile ön iĢlem gerçekleĢtirilmiĢtir. Saman örnekleri, üç farklı mol oranı (Kolin klorür:Formik asit 1:2, 1:3, 1:4), mikrodalga gücü (270, 360, 450 W) ve ön iĢlem süresinde (2, 5, 8 dakika) iĢlenmiĢ ve bu parametrelerin samanın kompozisyonu ve enzimatik hidrolizi üzerindeki etkileri araĢtırılmıĢtır.
Örneklerdeki ksilanın ön-iĢlem boyunca sıvı fazda çözündüğü ve bu durumun örneklerdeki selüloz ve lignin içeriğinde artıĢa neden olduğu gözlemlenmiĢtir. Tüm mol oranlarında mikrodalga gücü ve ön iĢlem süresiyle enzimatik hidroliz sırasındaki Ģeker konsantrasyonlarının arttığı tespit edilmiĢtir. Toplam Ģeker miktarının en yüksek olduğu (619 mg/g iĢlenmiĢ saman) proses koĢulları; 1:3 mol oranı, 360 W mikrodalga gücü ve 8 dakika iĢlem süresidir. Optimum noktada; enzimatik hidroliz sırasındaki glikoz veriminin % 99.9 ve ksiloz veriminin ise % 85.6 olduğu belirlenmiĢtir. Bu optimum koĢullarda iĢlenmiĢ saman örnekleriyle Escherichia coli KO11 kullanılarak eĢ zamanlı sakkarifikasyon ve fermantasyon (SSF) deneyleri gerçekleĢtirmiĢ ve etanol verimi % 74.9 bulunmuĢtur. Sonuç olarak; mikrodalga destekli-derin ötektik çözgen ön iĢlem yönteminin enzimatik sindirilebilirliği arttırarak kısa sürede yüksek Ģeker verimi sağladığı gözlemlenmiĢtir.
Ocak 2020, 64 sayfa
Anahtar Kelimeler: Derin ötektik çözgen, mikrodalga. buğday samanı, eĢ zamanlı sakkarifikasyon ve fermantasyon, Escherichia coli KO11
iii ABSTRACT Master Thesis
EFFECT OF DEEP EUTECTIC SOLVENT PRETREATMENT FOR BIOETHANOL PRODUCTION FROM WHEAT STRAW
Gizem Melissa ERDEM
Ankara University
Graduate School of Natural and Applied Sciences Department of Food Engineering
Supervisor: Assoc. Prof. Aslı ĠġCĠ YAKAN
In this study; microwave-assisted-deep eutectic solvent (Choline chloride: Formic acid) pretreatment was employed for the production of bioethanol, which is a renewable biofuel, from a lignocellulosic material such as wheat straw. Straw samples were processed in three different molar ratios (Choline chloride: Formic acid 1: 2, 1: 3, 1: 4), microwave power (270, 360, 450 W) and pretreatment time (2, 5, 8 minutes). The effects of these parameters on the composition and enzymatic hydrolysis of wheat straw were investigated. The xylan in the samples was observed to dissolve in the liquid phase during the pretreatment, leading to an increase in the cellulose and lignin content in the samples. In addition, it was determined that sugar concentrations during enzymatic hydrolysis increased with an increase in microwave power and pretreatment time. The highest total sugar content (619 mg / g processed straw) was observed at 1: 3 molar ratio, 360 W microwave power and 8 minutes processing time. The glucose and xylose yields at the optimal conditions were 99.9 and 85.6 %, respectively. The wheat straw samples treated at the optimal conditions were also fermented using Escherichia coli KO11 and the ethanol yield was found as 74.9 %. As a conclusion, it has been observed that microwave assisted-deep eutectic solvent pretreatment method increases enzymatic digestibility and provides high sugar yield in a short period of time.
January 2020, 64 pages
Key Words: Deep eutectic solvents, microwave, wheat straw, simultaneous saccharification and fermantation, Escherichia coli KO11
iv TEġEKKÜR
Yüksek lisans çalıĢmalarım boyunca yardımlarını ve desteğini benden esirgemeyen, bilgi ve deneyimlerini her zaman benimle paylaĢan değerli danıĢman hocam Sayın Doç.
Dr. Aslı ĠġCĠ YAKAN‘ a (Ankara Üniversitesi Gıda Mühendisliği Anabilim Dalı Öğretim Üyesi), tez çalıĢmalarımda önerilerini ve desteğini esirgemeyen Sayın hocam Doç.Dr. Özge ġAKIYAN DEMĠRKOL‘a (Ankara Üniversitesi Gıda Mühendisliği Anabilim Dalı Öğretim Üyesi), laboratuar aĢamasında ki yardımlarından dolayı sayın hocam ArĢ. Grv. Dr.Simel BAĞDER ELMACI‘ya (Ankara Üniversitesi Gıda Mühendisliği Anabilim Dalı Öğretim Üyesi) ve çalıĢmalarım boyunca desteklerini her zaman gördüğüm ArĢ. Grv. Dr. Naciye KUTLU KANTAR(Bayburt Üniversitesi Gıda Mühendisliği Anabilim Dalı) ve ArĢ. Grv.Merve Sılanur YILMAZ‘a (Ankara Üniversitesi Gıda Mühendisliği Anabilim Dalı) , desteklerini esirgemeyen arkadaĢlarıma özellikle Tuğçe ÖZ, Tuğba AÇIKSÖZ, Sevcan TURAN ve Kübra EMEKTAR‘a ve ideallerimi gerçekleĢtirmem için benim her zaman yanımda olan ve desteklerini her zaman hissettiren annem Neriman ERDEM, babam Erdal ERDEM ve canım kardeĢim Ezgi Su ERDEM‘e sonsuz teĢekkürlerimi sunarım.
Bu yüksek lisans tezi ―DERĠN ÖTEKTĠK ÇÖZGEN ĠLE ÖN-ĠġLEMĠN BĠYOETANOL ÜRETĠMĠ ĠÇĠN OPTĠMĠZASYONU‖ konulu ve 18B0443004 proje numaralı Ankara Üniversitesi Bilimsel AraĢtırma Projeleri Müdürlüğü‘nce desteklenen bağımsız proje kapsamında yürütülmüĢtür.
Gizem Melissa ERDEM Ankara, Ocak 2020
v
ĠÇĠNDEKĠLER
TEZ ONAY SAYFASI
ETĠK ... i
ÖZET ... ii
ABSTRACT ... iii
TEġEKKÜR ... iv
SĠMGELER DĠZĠNĠ ... vii
ġEKĠLLER DĠZĠNĠ ... viii
ÇĠZELGELER DĠZĠNĠ ... x
1. GĠRĠġ ... 1
2. KURAMSAL TEMELLER ve/veya KAYNAK ÖZETLERĠ ... 3
2.1 Hammadde ve BileĢenleri ... 3
2.1.1 Selüloz ... 3
2.1.2 Hemiselüloz ... 4
2.1.3 Lignin ... 5
2.2 Alternatif Biyoyakıt: Biyoetanol ... 6
2.3 Lignoselülozik Biyokütlenin DönüĢümü ... 7
2.3.1 Hidroliz ... 7
2.3.2 Fermantasyon ... 9
2.3.3 Lignoselülozik biyokütlede ön iĢlem ... 10
2.4 Derin Ötektik Çözgen ... 13
2.5 Mikrodalga ön iĢlemi ... 17
2.6 Kaynak Özetleri ... 17
3. MATERYAL ve YÖNTEM ... 22
3.1 Materyal ... 22
3.2 Yöntemler... 22
3.2.1 Derin ötektik çözgenin hazırlanması ... 22
3.2.2 Geleneksel ön iĢlem ... 23
3.2.3 Mikrodalga destekli ön iĢlem ... 23
3.2.4 Enzimatik Hidroliz ... 24
3.2.5 Fermantasyon ... 25
3.2.6 Analizler ... 26
3.2.6.1 Kompozisyon analizi ... 26
3.2.6.2 HPLC analizleri ... 27
3.2.6.3 Ġstatistik analizler ... 27
4. BULGULAR ve TARTIġMALAR ... 28
4.1 Mikrodalga Destekli Derin Ötektik Çözgen Ön ĠĢlemi ... 29
4.1.1 Ön iĢlem sonrası biyokütlenin geri kazanımı ... 29
4.1.2 Ön iĢlemin biyokütlenin kompozisyonu üzerine etkisi ... 30
4.1.3 Derin ötektik çözgen ön iĢleminin hidroliz üzerine etkisi... 34
4.1.4 Derin ötektik çözgen ön iĢleminin toplam Ģeker üzerine etkisi ... 37
4.1.5 Derin ötektik çözgen ön iĢleminin verim üzerine etkisi ... 41
4.1.6 Geleneksel Ön ĠĢlem ... 43
4.1.7 Derin ötektik çözgen ön iĢleminin fermantasyon üzerine etkisi ... 45
5. SONUÇLAR ... 46
KAYNAKLAR ... 48
vi
EKLER ... 53
EK 1 GLĠKOZ VE KSĠLOZ STANDART KURVELERĠ ... 54
EK 2 ETANOL STANDART KURVESĠ ... 55
EK 3 KATININ GERĠ KAZANIMI ... 56
EK 4 ENZĠMATĠK HĠDROLĠZ MĠKTARLARI ... 57
EK 5 KOMPOZĠSYON SONUÇLARI ... 58
EK 6 GLĠKOZ MĠKTARI ANOVA TABLOSU ... 59
EK 7 KSĠLOZ MĠKTARI ANOVA TABLOSU ... 60
EK 8 TOPLAM ġEKER MĠKTARI ANOVA TABLOSU ... 61
EK 9 GLĠKOZ VERĠM ANOVA TABLOSU ... 62
EK 10 KSĠLOZ VERĠM ANOVA TABLOSU ... 63
ÖZGEÇMĠġ ... 63
vii
SĠMGELER DĠZĠNĠ
w/w Ağırlıkça α Alfa β Beta G Gram v/v Hacimce Kg Kilogram L Litre μL Mikrolittre mL Mililitre mM Milimolar
°С Santigrat
% Yüzde
Kısaltmalar
ABD Amerika BirleĢik Devletleri
HPLC Yüksek Performanslı Sıvı Kromatografisi NaOH Sodyum hidroksit
SHF EĢ zamanlı sakkarifikasyon ve fermantasyon SSF Ayrı hidroliz ve fermantasyon
AFE Amonyak Lif atlaması DES Derin ötektik çözgen ChCl Kolin klorür
viii
ġEKĠLLER DĠZĠNĠ
ġekil 2. 1 Tek selüloz molekülünün yapısı ... 4
ġekil 2. 2 Hemiselülozun yapısı ve içerdiği bileĢikler ... 5
ġekil 2. 3 Selülozun enzimatik hidrolizi ... 9
ġekil 2. 4 Ön iĢlemin lignoselülozik biyokütle üzerinde etkisi ... 11
ġekil 2.5 DES sentezinde sıklıkla kullanılan halojen tuzları ve hidrojen bağ donörleri………..15
ġekil 3.1 Mikrodalga destekli derin ötektik çözgen ön iĢlemi sonrası saman örneği……… 24
ġekil 4.1 Farklı ön iĢlem koĢullarında(1:4 mol oranında) DES ile iĢlenmiĢ saman örneklerinin kompozisyonu (farklı proses koĢulları çizelge 4.1‘ de belirtilmiĢtir)………....32
ġekil 4.2 Farklı ön iĢlem koĢullarında (1:3 mol oranında) DES ile iĢlenmiĢ saman örneklerinin kompozisyonu (farklı proses koĢulları çizelge 4.1‘ de belirtilmiĢtir) ... 32
ġekil 4.3 Farklı ön iĢlem koĢullarıında (1:2 mol oranında) DES ile iĢlenmiĢ saman örneklerinin kompozisyonu (farklı proses koĢulları çizelge 4.1‘ de belirtilmiĢtir) ... 33
ġekil 4.4 Farklı ön iĢlem koĢullarında DES ile iĢlenmiĢ saman örneklerinin glukan ve lignin içeriklerinin (%) ve örnekteki ksilan miktarı (%) ile değiĢimi ... 33
ġekil 4.5 Farklı ön iĢlem koĢullarının (1:4 mol oranında) enzimatik hidroliz sırasında elde edilen glikoz ve ksiloz miktarları (mg/mL) üzerine etkisi (farklı proses koĢulları çizelge 4.1‘ de belirtilmiĢtir) ... 36
ġekil 4.6 Farklı ön iĢlem koĢullarının (1:3 mol oranında) enzimatik hidroliz sırasında elde edilen glikoz ve ksiloz miktarları (mg/mL) üzerine etkisi (farklı proses koĢulları çizelge 4.1‘ de belirtilmiĢtir) ... 37
ġekil 4.7 Farklı ön iĢlem koĢullarının (1:2 mol oranında) enzimatik hidroliz sırasında elde edilen glikoz ve ksiloz miktarları (mg/mL) üzerine etkisi (farklı proses koĢulları çizelge 4.1‘ de belirtilmiĢtir) ... 37
ġekil 4.8 Farklı ön iĢlem koĢullarının (1:4 mol oranında) enzimatik hidroliz sırasında elde edilen toplam Ģeker miktarı (mg Ģeker/ g iĢlenmiĢ saman) üzerine etkisi (farklı proses koĢulları çizelge 4.1‘ de belirtilmiĢtir) ... 39
ġekil 4.9 Farklı ön iĢlem koĢullarının (1:3 mol oranında) enzimatik hidroliz sırasında elde edilen toplam Ģeker miktarı (mg Ģeker/ g iĢlenmiĢ saman) üzerine etkisi (farklı proses koĢulları çizelge 4.1‘ de belirtilmiĢtir) ... 39
ġekil 4.10 Farklı ön iĢlem koĢullarının (1:2 mol oranında) enzimatik hidroliz sırasında elde edilen toplam Ģeker miktarı (mg Ģeker/ g iĢlenmiĢ saman) üzerine etkisi (farklı proses koĢulları çizelge 4.1‘ de belirtilmiĢtir) ... 40
ix
ġekil 4.11 Proses parametrelerinin enzimatik hidroliz sırasında elde edilen toplam Ģeker miktarı (mg Ģeker/ g iĢlenmiĢ saman) üzerine etkisi ... 40 ġekil 4.12 Geleneksel yöntem ile iĢlenmiĢ samanın enzimatik hidroliz süresince
glikoz ve ksiloz miktarlarındaki değiĢim (Ön iĢlem koĢulları: 80 °С su
banyosunda 24 saat, 1:3 mol oranı)... 44 ġekil 4.13 Optimum koĢullarda (1:3 mol oranı, 360W mikrodalga gücü, 8 dakika
ön iĢlem süresi) MW-DES yöntemiyle iĢlenmiĢ samandan üretilen etanol miktarının (mg/mL) fermantasyon süresi boyunca değiĢimi ... 45
x
ÇĠZELGELER DĠZĠNĠ
Çizelge 2.1 Farklı lignoselülozik materyallerin selüloz, hemiselüloz ve lignin
içerikleri. ... 3
Çizelge 2. 2 Asit ve enzimatik hidrolizin özellikleri ... 8
Çizelge 2.3 Biyoetanol üretiminde kullanılan ve pentozları da fermente edebilen bazı mikroorganizmalar ve özellikleri ... 10
Çizelge 2. 4 Bazı ön iĢlem metotlarının özellikleri ... 12
Çizelge 2. 5 DES sınıflandırılması . ... 16
Çizelge 4. 1 Proses koĢullarının isimlendirilmesi………...28
Çizelge 4.2 Mikrodalga destekli derin ötektik çözgen ön iĢlemi sonrası biyokütlenin geri kazanımı sonuçları (farklı proses koĢulları çizelge 4.1‘de belirtilmiĢtir) ... 30
Çizelge 4.3 Farklı proses parametrelerinde glikoz ve ksiloz verimleri (farklı proses koĢulları çizelge 4.1‘ de belirtilmiĢtir) ... 43
1 1. GĠRĠġ
Küresel petrol rezervlerinin tükenmesi ve fosil yakıtlarla ilgili çevresel sorunlar, yenilenebilen enerjiye gerekliliği arttırmaktadır. Lignoselülozik materyellerin bol miktarda bulunabilirliği ve yakıt dönüĢümüne elveriĢliliği sebebi ile enerji üretiminde uygun kaynaklardan biri olarak nitelendirilmektedir. Lignoselülozdan yenilenebilen enerji üretimi; kırsal ekonomiyi ve tarımsal atık yönetimini geliĢtirmektedir ve hem teknolojik hem de ekonomik ilerlemeyi sağlamaktadır (Gunny vd.2015).
Lignoselülozik biyokütle; ısı ve elektrik enerjisi üretiminde birincil yakıt olarak kullanılabilmektedir. Aynı zamanda; biyoetanol, biyogaz, biyohidrojen ve biyodizel gibi farklı biyoyakıtları da üretebilmektedir. Lignoselülozik biyokütle; bitkiler (enerji bitkileri, çok yıllık bitkiler ve su bitkileri), tarımsal atıklar (yaprak, sap, saman, küspe vb.), orman biyokütlesi (yumuĢak ağaç ve sert ağaç) ve endüstriyel atıklar olarak farklı sınıflarda incelenebilmektedir (Zabed vd.2017).
En fazla üretilen tarımsal atıklardan biri dünyada üretimi en çok yapılan buğdayın samanıdır. Avrupa, Çin, Hindistan, ABD ve Kanada‘da üretim potansiyeli oldukça fazladır (Anonymous 2019a). Tarımsal atıkların biyoenerjide değerlendirilmesi literatürde birçok çalıĢmanın odak noktası haline gelmiĢtir. Bitkisel biyokütlenin dünyada ki yıllık üretimi 200×109 tondur ve bunun 8-20×109 tonluk kısmının biyoyakıt üretiminde kullanılabileceği belirtilmiĢtir (Zabed vd. 2017). Türkiye‘nin büyük bir tarım ülkesi olarak potansiyeli fazla olup yıllık tarımsal atık miktarının yaklaĢık 21 milyon ton (kuru ağırlıkta) olduğu ifade edilmektedir (Isci vd. 2012).
Günümüzde derin ötektik çözgenlerin birçok alanda kullanılabilir oldukları belirtilmiĢtir. Ġki farklı bileĢiğin erime noktasından daha düĢük organik bileĢenlerin karıĢımı olarak ifade edilen derin ötektik çözgenler; ekstraksiyon ve biyokütleninin ön iĢlemi gibi alanlarda kolaylıkla kullanılabilmektedir. Derin ötektik çözgen ile yapılan ön iĢlemler; DES‘lerin kolay sentezlenmesi, biyolojik olarak parçalanabilir oluĢu ve çevre dostu olması nedeni ile ilgi çekmektedir (Zhang vd. 2012).
2
Bu tez çalıĢmasının amacı, buğday samanının yeni bir ön iĢlem metodu ile (mikrodalga destekli derin ötektik çözgen) proses edilmesi ve ön iĢlem parametrelerinin, kompozisyon enzimatik hidroliz ve enzimatik verim sonuçlarına etkisinin incelenmesidir. Ayrıca, enzimatik hidroliz sırasında açığa çıkan toplam Ģeker miktarının en yüksek olduğu proses koĢulları belirlenerek bu koĢullarda iĢlenmiĢ samandan biyoetanol üretimi de hedeflenmiĢtir.
3
2. KURAMSAL TEMELLER ve/veya KAYNAK ÖZETLERĠ
2.1 Hammadde ve BileĢenleri
Lignoselülozik materyal; 3 ana polimerden (selüloz (%40-60), hemiselüloz (%20-40), ve lignin (%10-25)) oluĢmaktadır. Farklı lignoselülozik materyallerin selüloz, hemiselüloz ve lignin içerikleri çizelge 2.1‘ de belirtilmiĢtir (Saini vd. 2015).
Çizelge 2. 1 Farklı lignoselülozik materyallerin selüloz, hemiselüloz ve lignin içerikleri (McMillan 1994, Saini vd. 2015)
Materyal (%)Selüloz (%)Hemiselüloz (%)Lignin (%)Kül
Sert ağaç 45 ± 2 30 ± 5 20 ± 4 0.6 ± 0.2
YumuĢak ağaç 42 ± 2 27 ± 2 28 ± 3 0.5 ± 0.1
Mısır koçanı 39–47 26–31 3–5 12–16
Sorgum sapları 27 25 11 –
Küspe 32–48 19–24 23–32 1.5–5
Pirinç samanı 28–36 23–28 12–14 14–20
Buğday samanı 33–38 26–32 17–19 6–8
Arpa samanı 31–45 27–38 14–19 2–7
Sorgum samanı 32 24 13 12
Tatlı sorgum küspesi 34–45 18–28 14–22 –
2.1.1 Selüloz
Selüloz; sellobiyoz β-1,4-poliasetalidir. Sellobiyoz iki molekül glikoz içerdiğinden, selüloz genellikle glikoz polimeri olarak kabul edilmektedir. Selülozun kimyasal formülü (C6H5O5)n ve polimerin tek zincirdeki yapısı Ģekil 2.1‘de gösterilmiĢtir.
Selülozun birçok özelliği glikoz ünitesi sayısı yani polimerizasyon derecesi (DP) ile açıklanmakta olup; bu değer genellikle 800-10000 ünite arasında değiĢmektedir (Harmsen vd. 2010). Glikoz molekülleri arasındaki β-1,4 glikozit bağının niteliği, polimerin uzun düz zincirler oluĢturmasına izin vermektedir (Foulon vd. 1994).
4
ġekil 2.1 Tek selüloz molekülünün yapısı (Harmsen vd. 2010)
Selüloz higroskopik yapıya sahip olsa da; kimyasal olarak kararlı ve mekanik olarak sağlam oluĢu suda veya düĢük sıcaklıkta ki seyreltik asit çözeltilerinde çözünmesini zorlaĢtırmaktadır. Polimerin çözünebilirliği; hidrolizi etkileyen faktörlere bağlıdır.
Konsantre asitlerde selüloz çözünebilmektedir, ancak konsantre asitler polimerin bozunmasına da sebep olmaktadır. Alkali çözeltiler; polimerin, düĢük DP değerlerinde parçalanmasının yanı sıra; selülozun ĢiĢmesine de neden olmaktadır (Krassig ve Schurz 2002).
2.1.2 Hemiselüloz
Hemiselüloz (C5H8O4); kısa, doğrusal ve çok dallı zincirlerden oluĢan birçok monomeri içeren heteropolimer bir yapıdadır. Polimer; heksozların (β-D-glukoz, α-D-galaktoz ve β-D-mannoz) ve pentozların (β-D-ksiloz ve α-L-arabinoz) yanı sıra α-D-glukuronik, α- D-galakturonik ve α-D-4-O-metilgalakturonik asit gibi üronik asitleri de az miktarda içermektedir. Hemiselülozun en önemli özelliği; polimer zincire bağlı asetil grupların varlığı ve dallanmıĢ yapısı nedeni ile kristal yapıda olmamasıdır (Harmsen vd. 2010, McMillan 1994).
Hemiselüloz; selüloza göre daha düĢük molekül ağırlığa sahiptir ve kolayca hidrolize edilebilen kısa zincirli yan dallara sahiptir. Saman ve ot gibi tarımsal biyokütlede hemiselülozun ana zinciri ksilandan oluĢurken; yumuĢak ağaçta çoğunlukla glukomannan bulunmaktadır. Hemiselülozun genel yapısı Ģekil 2.2‘de gösterilmiĢtir.
Birçok bitkide ksilan; 1,4 bağlı β-D-ksilopiranoz ünitelerinden oluĢan bir
5
heteropolisakkarittir. Ksiloza ek olarak, arabinoz, glukuronik asit veya bunun 4-O-metil eteri, asetik asit, ferulik ve p-kumarik asitleri de içerebilmektedir (Fengel ve Wegener 1984).
ġekil 2.2 Hemiselülozun yapısı ve içerdiği bileĢikler (Fengel ve Wegener 1984)
2.1.3 Lignin
Lignin; hemiselüloz ve selülozdan sonra doğada en çok bulunan polimerlerden biridir ve hücre duvarında bulunur. Üç farklı fenilpropan ünitesinin (p-kumaril, koniferil ve sinapil alkol) birbirine farklı bağlar ile bağlanmasıyla oluĢan amorf bir heteropolimerdir. Ligninin ana amacı bitkiye yapısal destek oluĢturmak, mikrobiyel saldırı ve oksidatif strese karĢı direnç göstermektir. Suda çözünmez ve optik olarak inaktiftir ki bu da ligninin parçalanmasını zorlaĢtırmaktadır (Fengel ve Wegener 1984).
Lignin; özellikle odunsu türlerin hücre duvarlarında, çok dallanmıĢ ve aromatik polimer bileĢenlerden oluĢan bir yapıdadır. YumuĢak ağaç ve sert ağaçlarda; kuru madde bazında lignin içeriği genellikle ağırlıkça %20-40; küspe, mısır koçanı, yer fıstığı
6
kabuğu, pirinç samanı gibi otsu bitkilerde ise ağırlıkça %10-40 arasında değiĢmektedir (Yaman 2004).
Biyokütlenin parçalanabilmesi ve içerisinde bulunan polimerik Ģekerlerin hidrolize olabilmesi; yapısındaki ligninin parçalanmasına ve uzaklaĢtırılmasına doğrudan bağlıdır. Delignifikasyon (ligninin yapıdan uzaklaĢtırılması); biyokütlenin ĢiĢmesine, ligninin yapısının bozulmasına, iç yüzey alanının artmasına ve selüloz liflerine selulotik enzimlerin ulaĢılabilirliğinin artmasına neden olmaktadır (Agbor vd. 2011).
2.2 Alternatif Biyoyakıt: Biyoetanol
Dünyada ki enerji kaynaklarının büyük bir bölümü; baĢta petrol olmak üzere doğal gaz ve kömür gibi fosil yakıtlara dayanmaktadır. Dünya genelinde hızlı nüfus artıĢı ve ekonomik geliĢmeler ile enerji tüketiminin artması; bu kaynakların yenilenememesinden dolayı yakın gelecekte tükenmesine sebep olacaktır. Bu durum;
yenilenebilen, temiz, güvenilir ve ekonomik yeni bir enerji kaynağı arayıĢına neden olmuĢtur (Gui vd. 2008). Biyoenerji de bu özelliklere sahip enerjilerden biridir.
Biyoenerji; biyokütleden (biyolojik ham maddeler) elde edilen katı, sıvı ve gaz enerji içeriğini ifade etmektedir. Bu; taĢımacılık için kullanılan biyoyakıtları (biyoetanol ve biyodizel), elektik ve ısı üretmek için kullanılan ürünleri ve endüstriyel atıklardan biyolojik maddelerin iĢlenmesi ile üretilen biyogazı (biyometan ve biyohidrojen) kapsamaktadır (Anonymous 2019b). Günümüzde; biyokütle toplam küresel enerjinin
%10‘unu oluĢturmaktadır (Anonymous 2019b). Biyoenerjinin; 2035 yılına kadar toplam enerjinin %20-30‘unu sağlayacağı düĢünülmektedir (Anonymous 2013).
Yenilenebilir enerji kaynağı olan biyoyakıtlar (özellikle sıvı biyoyakıtlar); taĢınabilen ve depolanabilen enerji kaynağı olmaları, fosil yakıtlara kıyasla karbondioksit, mikro kirletici ve partikül madde emisyonlarını büyük ölçüde azaltmaları, enerji güvenliğinin arttırılmasını ve enerji piyasasının stabilizasyonunu sağlamaları ve atık biyokütlenin kazanımından yeni bir ekonomik döngünün geliĢtirilebilmesine olanak tanımaları gibi bazı olumlu özelliklere sahiptir (Callegari vd. 2019).
7
Üretilme teknolojilerine ve kökenlerine bağlı olarak biyoyakıtlar genel olarak birinci, ikinci ve üçüncü nesil olarak sınıflandırılır. Birinci nesil yakıtlar; basit Ģekerler, yağlar ve niĢasta gibi enerji içeriği yüksek moleküllerden elde edilen yakıtları içermektedir.
Ġkinci nesil biyoyakıtlar; lignoselülozik hammaddeden (saman, küspe, orman atıkları gibi gıda dıĢındaki materyaller, enerji bitkileri vb. gibi) üretilen yakıtları kapsamaktadır.
Üçüncü nesil biyoyakıtlar ise alglerden üretilen yakıtları içermektedir (Anonymous 2013).
2.3 Lignoselülozik Biyokütlenin DönüĢümü
Lignoselülozik biyokütleden biyoetanol üretim aĢamaları 4 baĢlık altında incelenebilir;
(1) ön iĢlem, (2) hidroliz, (3) fermantasyon (hidroliz sonrasında veya eĢzamanlı olarak) (4) üretilmiĢ etanolün ayrılması (Ayoub ve Lucia 2018).
Lignoselülozik materyalin yapısı sebebiyle, biyolojik olarak dönüĢümü çok zor gerçekleĢir. Öncelikli olarak, bağlarla korunmuĢ yapının, ön iĢlemle parçalanması ve hidroliz ve fermantasyon aĢamasına hazırlanması gerekmektedir. Ön iĢlem ile ilgili ayrıntılı bilgi aĢağıda verilmiĢtir (2.3.3). Ön iĢlem sonrasında, materyaldeki polimerik Ģekerlerin hidroliz ile fermente edilebilir Ģekerlere dönüĢmesi ve fermentasyon ile etanol üretimi sağlanmaktadır.
2.3.1 Hidroliz
Hidroliz; kimyasallarla (asit) hidroliz ve enzimatik hidroliz olarak iki Ģekilde yapılabilmektedir (Çizelge 2.2). Sülfirik asit, asit hidrolizi sırasında en çok tercih edilen kimyasaldır. Ancak, korozif olması ve Ģekerlerin degredasyonuna sebep olması nedeniyle günümüzde enzimatik hidroliz daha yaygın olarak uygulanmaktadır (Haq vd.2016).
8
Çizelge 2.2 Asit ve enzimatik hidrolizin özellikleri (Haq vd.2016)
Hidroliz metodu Olumlu özellikleri Olumsuz özellikleri Konsantre asit prosesi DüĢük sıcaklıkta
gerçekleĢebilmesi
Yüksek Ģeker verimi
Yüksek asit tüketimi (ekipman korozyonu)
Asidin tekrar kullanımı için yüksek enerji tüketimi
YavaĢ proses Seyreltik asit prosesi DüĢük asit tüketimi
Hızlı proses
Yüksek sıcaklıkta iĢlem
DüĢük Ģeker verimi
Ekipman korozyonu
Ġstenmeyen bileĢik oluĢumu
Enzimatik proses DüĢük korozyon
Yüksek ürün verimi
DüĢük toksisite
Ġnhibitör oluĢturmaması
YavaĢ proses
Enzim pahalılığı
Enzimatik hidroliz; substrata özgü ve oldukça pahalı olan selülaz ve hemiselülaz enzimleri tarafından gerçekleĢtirilmektedir. BaĢlıca selülaz enzimleri; endo-1,4-β- glukanaz, ekzoglukanaz (sellobiyohidrolaz) ve β-glikozidaz olarak üç sınıf altında toplanmaktadır (ġekil 2.3). Endoglukanaz; polimerin amorf bölgesine saldırarak selüloz yapısının bozulmasına ve bu sayede moleküler ağırlığı düĢük yeni zincir oluĢumunu sağlamaktadır. Sellobiyohidrolaz; zincir sonundaki β-1,4-glikozidik bağını kırarak sellobiyoz oluĢumuna neden olmaktadır. β-glikozidaz; sellobiyozu hidroliz ile glikoza parçalamaktadır (Sun ve Cheng 2002, Sarkar vd. 2012). Trichoderma, Penicillum, Fusarium ve Aspergillus küfleri selülaz enzimi üretiminde sıklıkla tercih edilir.
Selülozik etanol üretimi sırasında selülazın yanında hemiselülozu hidrolize eden ilave enzimler (glukuronidaz, asetilesteraz, ksilanaz, b-ksilosidaz, galaktomannanaz ve glukoanzanaz) de kullanılabilmektedir (McMillan 1994, Sun ve Cheng 2002, Mosier 2005). Selüloz hidrolizini etkileyen faktörler; hammaddenin gözenekliliği (eriĢilebilir yüzey alanı), selüloz lifinin kristalliği, hammaddenin lignin ve hemiselüloz içeriği olarak tanımlanmıĢtır. Lignin ve hemiselülozun varlığı selülaz enziminin selüloza ulaĢılabilirliğini zorlaĢtırmaktadır.
9
ġekil 2.3 Selülozun enzimatik hidrolizi (Sarkar vd. 2012)
2.3.2 Fermantasyon
Fermantasyon prosesi; monomer Ģeker ünitelerinin etanole dönüĢümüdür. Hidrolize Ģeker ünitelerinin etanole dönüĢümü eĢitlik 2.1‘de gösterilmiĢtir (Mohapatra vd. 2017).
(2.1)
Fermantasyon iĢlemi mayalar veya bakteriler ile gerçekleĢtirilir. Heksozların (6 karbonlu Ģekerler) etanole dönüĢümü kolay bir Ģekilde gerçekleĢirken; pentozlar (5 karbonlu Ģekerler) sadece bazı mikroorganizmalar tarafından fermente edilerek etanole dönüĢtürülebilmektedir. Fermantasyon iĢlemi, eĢ zamanlı hidroliz ve fermentasyon (SSF) veya ayrı hidroliz ve fermentasyon (SHF) Ģeklinde gerçekleĢtirilebilmektedir.
SSF; düĢük enzim dozu gerektirmesi, iĢletme maliyetinde tasarruf sağlaması, kontaminasyon problemini azaltması, proses süresini kısaltması ve hidroliz verimini arttırması sebebiyle (Sun and Cheng 2002) günümüzde selülozik etanol üretiminde en çok tercih edilen fermantasyon metodu olmuĢtur.
10
Etanol üretiminde en çok bilinen ve ticari olarak da en çok tercih edilen mikroroganizma Saccharomyces cerevisiae‘dır. S. cerevisiae‘nin heksozdan yüksek verimde etanol üretebildiği, etanole ve inibitör bileĢiklere yüksek direnç gösterebildiği bilinmektedir. Ancak, biyotkütlenin hidrolizi aĢamasında açığa çıkan ksiloz gibi 5 karbonlu pentozları fermente edememektedir. Ekonomik bir biyoetanol üretim yöntemi için biyokütlenin içerisindeki tüm Ģekerlerin fermente edilebilmesi büyük önem taĢımaktadır (Basile ve Dalene 2019). Bu bağlamda, pentozları da fermente edebilen bazı diğer mikroorganizmaların kullanımı literatürde farklı çalıĢmalara konu olmuĢtur (Çizelge 2.3). Çizelgede belirtilen mikroorganizmalar dıĢında; Klebsiella oxytoca, Zymomonas mobilis, Pichia stipitis, Candida shehatae, Pachysolan tannophilus, Kluyveromyces mariianus gibi türlerde ksiloz ve sellobiyozu fermente edebilmektedir (Basile ve Dalene vd. 2019).
Çizelge 2.3 Biyoetanol üretiminde kullanılan ve pentozları da fermente edebilen bazı mikroorganizmalar ve özellikleri (Basile ve Dalene 2019)
Mikroorganizma Özelliği Kaynakça
Escherichia coli Doğal suĢları ksiloz ve sellolobiyozu fermente edebilir, ancak etanole karĢı toleransı düĢüktür.
Lau vd. (2010) Yasuda vd.(2014).
Clostridium acetobutylicum Farklı Ģekerleri tamamen tüketebildiği belirtilmiĢtir.
Procentese vd.(2017) Clostridium
sacccharobutylicum
Farklı Ģekerleri tamamen tüketebildiği belirtilmiĢtir.
Xu vd.(2016).
Xing vd.(2018)
2.3.3 Lignoselülozik biyokütlede ön iĢlem
Ön iĢlemin birincil amacı, lignoselülozik yapının parçalanmasını (ġekil 2.4) ve böylelikle enzimatik hidroliz ve fermantasyona uygun hale getirilmesini sağlamaktır (Mosier vd 2005). Ön iĢlem sırasında biyokütlede meydana gelen değiĢimler (porozite ve yüzey alanının artması, ligninin modifiye olması ve yapıdan ayrıĢması, hemiselülozun kısmen depolimerizasyonu, selüloz kristalitesinin değiĢimi vb. gibi) enzimatik hidrolize olumlu Ģekilde etki etmektedir (Ayoub ve Lucia 2018). Bir ön iĢlemde beklenilen özellikler arasında, yüksek enzimatik hidroliz verimi sağlaması,
11
Ģeker degredasyonunu minimumda tutması, mikroorganizmaların inhibisyonuna sebep olabilecek toksik maddelerin oluĢumuna neden olmaması, çevreci kimyasallar kullanılması, düĢük enerji gereksinimi ve düĢük maliyetli olması sayılabilir (Ayoub ve Lucia 2018).
Ön iĢlem; (a) mekanik ön iĢlem (doğrama, öğütme gibi parçaçık boyutu küçültme ve), (b) fiziksel ön iĢlem ((ıĢınlama ve mikrodalga, ultrason, infrared) ve termal ön iĢlem (buhar ile patlatma), (c) kimyasal ön iĢlem (alkali, asit ve organik çözgenler), (d) fizikokimyasal ön iĢlem (hidrotermal proses), (e) biyolojik ön iĢlem (çürükçül mantarlar) gibi farklı baĢlıklar altında incelenebilmektedir (Ayoub ve Lucia 2018).
ġekil 2.4 Ön iĢlemin lignoselülozik biyokütle üzerinde etkisi (Ayoub ve Lucia 2018)
12
Çizelge 2.4 Bazı ön iĢlem metotlarının özellikleri (Mosier 2005, Alvira vd. 2010, Ayoub ve Lucia 2018)
Ön ĠĢlem Metodu Olumlu özellikleri Olumsuz özellikleri Biyolojik Hemiselüloz ve lignini
parçalaması,
DüĢük enerji tüketimi
Ön iĢlem hızının düĢük olması
Doğrama Selüloz kristalitesini
azaltması Yüksek enerji ve güç isteği
Buhar ile patlatma Ligninin parçalanması ve hemiselülozun çözünmesine neden olması,
Fiyat uygunluğu
Glikoz ve hemiselüloz veriminin yüksekliği
Hemiselülozun kısmen bozunması
Toksik bileĢiklerin oluĢumu
AFEX
(Amonyak Lif Patlaması) UlaĢılabilir yüzey alanının artması,
Ġnhibitör oluĢumunun düĢüklüğü
Yüksek lignin içeren hammaddelerde etkili olmaması,
Maliyetinin yüksekliği CO2 ile patlatma UlaĢılabilir yüzey alanının
artması,
Fiyat uygunluğu
Toksik bileĢik oluĢumunu içermemesi
Lignin ve hemiselülozu etkilememesi
Yüksek basınç gerekliliği
Islak oksidasyon Ligninin ayrılmasında etkili olması,
Ġnhibitör oluĢumunun düĢüklüğü,
Enerji gereksiniminin düĢük olması (ekzotermik)
Oksijen ve alkali katalistin maliyetinin fazla olması
Ozon ile ön iĢlem Lignin içeriğini azaltması,
Toksik bileĢik oluĢmaması Pahalı olması
Organik çözgen Lignin ve hemiselüloz parçalanmasına neden olması
Yüksek maliyet
Çözgenin geri dönüĢümlü olması gerekliliği
Konsantre asit Yüksek glikoz verimi,
Sıcaklığın ideal olması Asit maliyeti
Korozyon sorunu
Ġnhibitör oluĢumu Seyreltik asit Konsantre aside göre
korozyana daha az neden olması,
Ġnhibitör oluĢumunun düĢüklüğü,
ġeker degredasyonu
DüĢük Ģeker verimi eldesi
13
Farklı ön iĢlem metotları ve bu metotların bazı özellikleri çizelge 2.4‘ de özetlenmiĢtir (Mosier 2005, Alvira vd. 2010, Ayoub ve Lucia 2018). Lignoselülozik biyokütlenin ön-iĢlemesi ile ilgili yapılmıĢ araĢtırılmalar göz önünde bulundurulduğunda günümüzde halen altın standart olarak belirlenmiĢ bir proses yoktur. Bazı yöntemler etanol verimliliğini arttırmasına rağmen, Ģeker degredasyonuna sebep olmuĢ, bazıları toksik yan ürünlerin oluĢmasını engellemesine rağmen çok pahalı bir yöntem olduğu gözlemlenmiĢtir. Bazıları ise maliyeti düĢürmesine rağmen diğer yöntemlere oranla etkinliğinin daha az olduğu anlaĢılmıĢtır (Rabemanolontsoa ve Saka, 2016). Bu tez kapsamında ön-iĢlem metodu olarak yeĢil çözücü tercih edilmiĢtir.
YeĢil çözücüler süperkritik akıĢkanlar, iyonik sıvılar ve derin ötektik çözücüler (DES) olarak sınıflandırılabilir. Son yıllarda büyük ilgi gören yeĢil çözücüler ise iyonik sıvılar ve derin ötektik çözücülerdir. Ġyonik sıvılar anyon ve katyon olmak üzere en az iki bileĢenden oluĢan, oda sıcaklığında sıvı halde bulunan çözücülerdir. Ġyonik sıvıların toksik ve fiyatlarının yüksek olması araĢtırmacıları yeni nesil derin ötektik çözücülere yönlendirmiĢtir (Zhang vd. 2012). Derin ötektik çözücüler, organik tuzlar ile alkol, asit veya amit gibi hidrojen bağı donörü (HBD) arasındaki bağ ile oluĢurlar. DES‘lerin erime noktası baĢlangıç kimyasallarına göre çok daha düĢüktür (genellikle 70⁰ C‘nin altında sıvı formdadırlar) ve bu özellik karıĢımın oda sıcaklığında kullanılmasını sağlamaktadır. Ayrıca bileĢenler arasındaki güçlü bağ bileĢiklerin reaktifliğini azaltarak onları birçok durum için inert hale getirmektedir. Ġyonik sıvılar gibi DES‘ler de düĢük buhar basıncına ve yüksek ısıl kararlılığa sahiptir. Ancak, iyonik sıvıların aksine ucuz, hazırlanmaları kolay ve biyolojik olarak parçalanabilmektedirler. Sentezlerinin çok kolaylıkla yapılabiliyor olması (iki kimyasalın direkt karıĢtırılmasıyla) ve sentez aĢamasından sonra ekstra saflaĢtırma aĢaması gerektirmemesi, yanıcı olmamaları da pilot ve endüstriyel ölçekte de rahatlıkla kullanılabilmelerini sağlamaktadır (Zhang vd.
2012).
2.4 Derin Ötektik Çözgen
Abbott vd (2004) tarafından, baĢlangıç bileĢenlerine göre çok daha düĢük erime noktasına sahip, iki veya daha fazla Lewis asidi ve bazı ya da Bronsted-Lory asidi ve
14
bazlarının karıĢımından oluĢan sistem, derin ötektik çözgen olarak tanımlanmıĢtır.
Ġyonik sıvılara benzer fiziksek özelliklere sahip olduğu düĢünülmüĢtür, ancak baĢlangıç bileĢenlerinin kaynağı ve kimyasal oluĢum prosesi açısından farklılık göstermektedir.
DES; hidrojen bağ alıcısı olarak hareket eden bir halojen tuzu ve hidrojen bağı donörünün (HBD) birleĢmesinden oluĢmaktadır (ġekil 2.5). Hidrojen bağ donörleri;
amid, amin, karboksilik asit, alkol ve metal tuzları gibi birçok seçenekten oluĢabilmektedir. Derin ötektik çözgenler (Çizelge 2.5) genel olarak 4 grupta incelenebilmektedir (Zhou ve Baker 2013, Smith vd. 2014).
Derin ötektik çözgenler Cat+X-zY genel formülü ile ifade edilmektedir. Cat+ amonyum, fosfonyum ve sülfonyum katyonlarını, X ise halojenür anyon olan Lewis bazını göstermektedir. Kompleks anyonik türlerde; bir Lewis veya Brønsted asit Y ve X arasında oluĢmaktadır. Denklemde; ‗z‘ olarak belirtilen ifade, anyon ile etkileĢime giren Y molekülü sayısıdır. Yapılan çalıĢmaların büyük bir çoğunluğu; kuarterner amonyum ve imidazolium katyonları (örn. kolin klorür) üzerinde yoğunlaĢmıĢtır (Smith vd. 2014).
Tip 1 olarak tanımlanan derin ötektik çözgenler, MClx ve kuarterner amonyum tuzlarından oluĢmuĢ olup; kloroalüminat/imidozolium tuzları ve FeCl2, AgCl, CuCl, LiCl, CuCl2, SnCl2, ZnCl2 gibi çeĢitli metal halojenlerin birleĢiminden oluĢmaktadır.
Tip 1 oluĢturmak için düĢük erime noktasına sahip hidrat olmayan metal halojen tuzları gerekmektedir. Fakat bu tuzların sınırlı olması; Tip 2‘nin (hidrat metal halojenleri: kolin klorürün) kullanımının artmasına neden olmuĢtur. Tip 2 ötektikleri; Kolin klorür ve kobalt, nikel gibi birçok geçiĢ metal türleri ile oluĢmaktadır. Tip 4; metal klorür (ZnCl2) ve üre, asetamid, hekzandiol gibi hidrojen bağ donörlerinden oluĢmaktadır. Kolin klorür ve hidrojen bağı donörlerinin (amid, karboksilik asit, alkol) karıĢımı (Ģekil 2.5) en yaygın kullanılan çözgen sınıfını (Tip 3) oluĢturmaktadır (Smith 2014).
En yaygın DES oluĢturabilen bileĢiklerden birisi olan kolin klorür(ChCl); fosil rezervlerinden kolaylıkla üretilen veya biyokütleden ekstrakte edilebilen, ucuz ve toksik etkisi olmayan kuaterner amonyum tuzudur. Bu tuz; üre, karboksilik asit (okzalik asit, süksinik asit, formik asit, sitrik asit ve amino asit) ve poliol (gliserol,karbonhidrat) gibi
15
hidrojen bağ donörleri ile hızlı Ģekilde derin ötektik çözgen oluĢturabilmektedir (ġekil 2.5). Ġyonik sıvılar ile benzerlik göstermesine rağmen; iyonik olmayan bileĢenler ile de DES oluĢturabilmesi bu bileĢiği farklı kılmaktadır (Zhang vd. 2012).
ġekil 2.5 DES sentezinde sıklıkla kullanılan halojen tuzları ve hidrojen bağ donörleri (Zhang vd.2012, Smith vd. 2014)
DES‘lerin içerisindeki hidrojen bağ dönörünün oranı, DES‘lerin erime noktasını belirlediğine inanılmaktadır. Hidrojen bağ donörü çeĢidi, tuz çeĢidi ve mol oranları;
yoğunluğu, yüzey gerilimi ve viskoziteyi etkileyen baĢlıca faktörlerdir. DES; genel olarak diğer moleküler çözgenlere göre daha yüksek viskozite ve daha düĢük ısıl iletkenliğe sahiptir. Wonder waals ve elektrostatik etkiler yüksek viskoziteye katkı sağlamaktadır (Smith vd 2014).
16
Çizelge 2.5 DES sınıflandırılması (Zhou ve Baker 2013, Smith vd. 2014).
Tip Kimyasal yapı Formül
I)Kuarterner amonyak tuzu+metal klorüra
Cat+X–zMClx
(M = Zn, Sn, Fe, Al, Ga, In)
II)Kuarterner amonyak tuzu+metal klorür hidratb
Cat+X–zMClx·yH2O (M = Cr, Co, Cu, Ni, Fe)
III)Kuarterner amonyak tuzu+hidrojen bağı donörüc
Cat+X–zRZ
(Z= CONH2, COOH, OH)
IV)Metal klorür
hidrat+hidrojen bağ donörüc
MClx + RZ = MClx–1+·RZ + MClx+1–
(M = Al, ZnZ = CONH2, OH)
1Metal klorür (a), metal klorür hidrat (b) ve hidrojen bağ donörünün(c) kimyasal yapısı çizelgede gösterilmiĢtir.
Metallerin iĢlenmesi, polimer sentezi, nanotüp kompozit hazırlanması, biyodizel saflaĢtırılması, ilaçların çözündürülmesi, biyolojik tranformasyonlar ve CO2
absorpsiyonu gibi çok farklı alanlarda derin ötektik çözgenlerin kullanıldığı belirtilmiĢtir (Degam 2017). Bu kullanım alanlarına ek olarak, DES‘ler son yıllarda, selülozik biyokütle ön-iĢlem aĢamasında da iyonik sıvıların yerine tercih edilmeye baĢlanmıĢtır.
Literatürde birçok farklı derin ötektik çözgen, pirinç sapları (Kumar vd. 2016), palmiye ağacı yaprakları (Loow vd. 2018), mısır koçanı (Procentese vd. 2015), söğüt ağacı (Li vd. 2017) ve gıda endüstrisi atıkları (Procentese vd. 2018) gibi farklı biyokütle kaynakları üzerinde denenmiĢ ve lignoselülozik yapıyı etkin bir Ģekilde parçaladığı tespit edilmiĢtir. Ancak literatür ayrıntılı olarak incelendiğinde DES ile yapılan ön- iĢlemlerin süresinin uzun olduğu (2-24 saat) gözlemlenmektedir (Loow vd. 2017).
ĠĢlem süresinin kısaltılması amacıyla, DES ön iĢleminin mikrodalga ile birleĢtirilmesi yenilikçi bir yaklaĢım olarak düĢünülmektedir.
17 2.5 Mikrodalga ön iĢlemi
Mikrodalga; dalga boyları 1m-1mm ve frekansları 0,3-300 Ghz arasında değiĢen elektromanyetik dalgalardır (Haque 1999). Endüstriyel ölçekli kullanılan mikrodalgalar, genellikle 915 MHz frekansta, ev tipi kullanılanlar ise 2450 MHz frekanstadır.
Mikrodalga, elektromanyetik spektrumda, radyo frekans dalgalar ile kızılötesi dalgalar arasında yer almaktadır (Datta ve Anantheswaran 2001). Geleneksel ısıtmaya göre;
mikrodalga yöntemi çok daha farklı bir prensipte çalıĢmaktadır. Geleneksel yöntemde dıĢtan içe doğru bir ısıtma izlenirken, mikrodalgada hacimsel ısıtma olmaktadır.
Mikrodalgalar, dipolar parçacıkların rotasyonu ya da iyonik parçacıkların göçü ile moleküler bir harekete sebep olurlar. Ġyonik iletim, uygulanan elektromanyetik alandaki çözünen veya titreĢen iyonların göç etmesini, dipol rotasyon ise polarize olmuĢ moleküllerin, bir hizaya sokulması anlamına gelmektedir (Sumnu 2001). Bu Ģekilde ısınma; biyokütlenin ĢiĢmesine, hemiselüloz ve ligninin parçalanarak yapıdan ayrılmasına sebep olmaktadır. Mikrodalga ile ön iĢlem, AFEX ve buhar ile patlatma ön iĢlemleri gibi benzer patlama etkisi yaratmaktadır (Zhu vd. 2015; Puligundla vd. 2016).
2.6 Kaynak Özetleri
Bu bölümde, son yıllarda DES‘ler kullanılarak yapılan ön iĢlem çalıĢmaları detaylı olarak incelenmiĢtir.
Procentese vd. (2015) tarafından yapılan çalıĢmada; mısır sapı üç çeĢit çözgen (Kolin klorür:Gliserol (1:2), Kolin klorür:Üre (2:1), Kolin klorür: Ġmidazol (3:7)) kullanılarak farklı sıcaklıklarda 15 saat boyunca su banyosunda ön iĢleme tabi tutulmuĢtur. Hidroliz sonrası toplam Ģeker miktarı ChCl:Gliserol ile 150 °С sıcaklıkta iĢlenen örneklerde 37.8 g/g, ChCl:Üre ile 115 °С‘de iĢlenen örneklerde 20.9 g/g ve ChCl:Ġmidazol ile 115
°С sıcaklıkta iĢlenen örneklerde 35.9 g/g olarak bulunmuĢtur. En yüksek glikoz verimi 150 °С sıcaklıkta (%94.6) ChCl:Ġmidazol ile iĢlenen örneklerden, en yüksek ksiloz verimi ise (%95.5) aynı sıcaklıkta ChCl:Gliserol ile iĢlenen biyokütleden elde edildiği belirtilmiĢtir. Mısır sapında; ChCl:Ġmidazol‘ün (3:7 mol oranında) sıcaklık 80°С iken % 40 olan delignifikasyon oranının 150 °С‘ de % 88 olduğu belirtilmiĢtir.
18
Zhang vd. (2016) tarafından yapılan çalıĢmada; mısır koçanına farklı (90 °С sıcaklık ve 24 saat süre ile) derin ötektik çözgenlerle ön iĢlem uygulanmıĢtır. Monokarboksilik asit:
ChCl, Dikarboksilik asit:ChCl ve Polialkol:ChCl üç farklı Ģekilde oluĢturulmuĢ ve iĢlenen biyokütlenin hidrolizi sonrasında elde edilen glikoz verimlilikleri değerlendirilmiĢtir. Monokarboksilik asit: ChCl türlerinden 1:5 oranında ki ChCl:Laktik asit‘in % 83.5 ile en yüksek glikoz verimi verdiği tespit edilmiĢ. Dikarboksilik asit:
ChCl‘de ise en yüksek glikoz verimi Malonik asit:ChCl (%61.5) ile bulunmuĢtur. 2:1 mol oranında oluĢturulmuĢ Polialkol:ChCl çözeltileri içinde en yüksek verimin %96.4 ile Gliserol:ChCl‘de gözlendiği belirtilmiĢtir. Ayrıca, Gliserol:ChCl‘nin lignini maksimum seviyede ayrıĢtırdığı, katı materyalin kazanımında ve yüksek glikoz verimi elde etmekte çok etkili olduğu rapor edilmiĢtir.
Yapılan bir baĢka çalıĢmada; pirinç samanı farklı DES‘ler ile iĢlenmiĢtir. Kolin klorür ile birlikte malonik asit, malik asit, 1,2-propanediol, sitrik asit, tartarik asit, gliserol, etilen glikol, laktik asit, üre ve oksalik asit gibi farklı hidrojen bağ donörleri kullanılarak ötektik çözgenler hazırlanmıĢtır. Pirinç samanı; farklı mol oranları kullanılarak hazırlanmıĢ çözgenlerle; %5 ve %10 katı oranlarında, farklı sıcaklık (60-121°С) ve sürelerde (30 dakika-12 saat) ön iĢleme maruz bırakılmıĢtır. Maksimum indirgen Ģeker miktarının (226.7 g/L) ChCl:Gliserol ile iĢlenmiĢ saman örneklerinin enzimatik hidrolizinden elde edildiği tespit edilmiĢ ve sakkarifikasyon verimi %87.1 olarak rapor edilmiĢtir (Kumar vd. 2016).
Xu vd. (2016) tarafından yapılan çalıĢmada; ChCl:Üre (1:2), ChCl: Gliserol (1:2), ChCl:Formik asit (1:2), ChCl:Asetik asit (1:2), ChCl:Oksalik asit (1:1), ChCl:Malonik asit (1:1) ve ChCl:Oksalik asit (1:1) kullanılarak mısır atıklarına ön iĢlem (130°С, 100 rpm‘de 2 saat) uygulanmıĢtır. ChCl: Formik asit ön iĢlemi sonunda elde edilen glikoz verimi optimizasyonla maksimize edilmeye çalıĢılmıĢtır. Optimizasyon sonunda; 3 saat boyunca uygulanmıĢ ön iĢlem ile 17.0 g/L glikoz elde edilmiĢ ve glikoz verimi %99 olarak bulunmuĢtur. Clostridium saccharobutylicum mikroorganizması kullanıldığında;
bütanol konsantrasyonu 5.63 g/L ve bütanol verimi 0.17 g/g toplam Ģeker olarak belirtilmiĢtir.
19
Lynam vd. (2017); çam örnekleri üzerinde Kolin klorür:Formik asit (1:2), Kolin klorür:Laktik asit (1:10), Kolin klorür:Asetik asit (1:2), Betaine:Laktik asit(1:2) gibi farklı derin ötektik çözgenler kullanarak ön iĢlem yapmıĢtır. Katı/sıvı oranı 1:10 (g/g) olarak hazırlanan örneklere 155 °С‘de 2 saat ön iĢlem uygulanmıĢtır. Kolin klorür:Formik asidin;en yüksek lignin çözünülebilirliğine (%14), en düĢük ksilan (<%1) ve selüloz çözünülürlüğüne (<%1) neden olduğu belirlenmiĢtir. Çam örneklerinde ön iĢlem sonunda; glikoz veriminin Kolin klorür:Formik asitle (%70) Kolin klorür:Gliserol‘e göre 7 kat daha fazla olduğu tespit edilmiĢtir.
Procentese vd. (2017) tarafından yapılan çalıĢmada marul yapraklarına Kolin klorür:Gliserol (1:2) ile farklı sıcaklık (80-150°С) ve sürelerde (3-16 saat) su banyosunda ön iĢlem uygulanmıĢtır ve iĢlenmiĢ örneklerden Clostridium acetobutylicum kullanılarak bütanol üretilmiĢtir. Ön iĢlemin 150 °С‘ de 6 saat boyunca sürdüğü koĢulda glikoz verimi %94.9 ve ksiloz verimi %75 bulunmuĢtur. Bu koĢulda elde edilen bütanol verimi 0.04 g/g, fermentasyon sonundaki bütanol konsantrasyonu ise 0.5 g/L olarak bulunmuĢtur.
Chen ve Wan vd. (2018) tarafından yapılan çalıĢmada; 3 farklı hammaddede (mısır koçanı, dallı darı otu (switchgrass) ve fil otu (miscanthus)) Kolin klorür: Laktik asit (1:2) ile mikrodalgada-DES (800 W ve 45 saniye) ön iĢlemi uygulanmıĢtır. ĠĢlenen biyokütlenin geri kazanım oranları mısır koçanı, dallı darı otu ve fil otu için sırasıyla % 36.64, 50.46 ve 53.21 olarak bildirilmiĢtir. Glikoz verimleri mısır koçanı, dallı darı otu ve fil otu için sırası ile %78.5, %75 ve <%40 olarak rapor edilmiĢtir. Uygulanan ön iĢlemin biyokütle sindirilebilirliğini arttırdığı ifade edilmiĢtir.
Li vd. (2018) tarafından yapılan çalıĢmada; pirinç samanı farklı mol oranlarında (1:1,1:3,1:5) hazırlanmıĢ Kolin klorür: Laktik asit çözeltisiyle 90-120°С sıcaklıkta 3-6 saat süresince ön iĢleme tabi tutulmuĢtur. En ekstrem koĢul olan; 1:5 mol oranında, 120°С sıcaklıkta 3 saat süreyle iĢlenmiĢ örneklerde; selüloz, ksilan ve lignin miktarları sırasıyla %59.2, 8.3 ve 11.3 olarak tespit edilmiĢtir. Bu iĢlem sonunda gerçekleĢtirilen enzimatik hidroliz deneylerinden elde edilen örneklerde glikoz veriminin %60-70 arasında değiĢtiği belirtilmiĢtir.
20
Loow vd. (2018) tarafından yapılan çalıĢmada; palmiye ağacı yaprakları, Kolin klorür:Üre (1:2) ile (1:10 (w/v) katı/sıvı oranında) farklı sıcaklık (60-140 °С) ve sürelerde (2-10 saat) yağ banyosunda ön iĢleme tabi tutulmuĢ ve ardından inorganik tuz ile iĢlenmiĢtir. Dört saat boyunca 120 °С‘de uygulanan ön iĢlemin 14.76 g/L ksiloz verimi sağladığı belirtilmiĢtir.
Procentese vd. (2018) tarafından yapılan çalıĢmada; gıda endüstrisi atıkları (patates kabuğu, elma atıkları ve kahve atıkları) üzerinde iki farklı derin ötektik çözgenin (Kolin klorür:Gliserol ve Kolin klorür:Etilen glikol) etkisi incelenmiĢtir. Ön iĢlem, farklı katı/çözgen oranlarında (1:8-1:32) ve farklı sıcaklıklarda (60-150 °С) 3 saat boyunca gerçekleĢtirilmiĢtir. Kolin klorür:Gliserol‘ün (1:32 katı/çözgen oranında) 150 °С sıcaklıkta örneklerden maksimum glikoz elde etmeyi sağladığı bildirilmiĢtir. Patates kabuğu, elma atıkları ve kahve atıklarından elde edilen maksimum glikoz miktarları sırasıyla 0.80, 0.95 ve 0.88 g glikoz/g biyokütle olarak rapor edilmiĢtir.
Sert vd. (2018) tarafından yapılan çalıĢmada; ayçiçeği sapında Kolin klorür:Sitrik asit (0.7:0.3), Kolin kloür:Tartarik asit (0.7:0.3), Kolin klorür:Okzalik(1:1) asit kullanılarak mikrodalgada ön iĢlem uygulanmıĢtır. Ön iĢlem; farklı sıcaklık (130-180 °С) ve sürelerde (1-10 dakika) gerçekleĢtirilmiĢtir. Mikrodalgada Kolin klorür:Oksalik asit kullanıldığında, 180°С sıcaklıkta 1 dakika boyunca iĢlem gören örneklerde en yüksek geri kazanım verimi (%99.07) elde edilmiĢtir.
Guo vd. (2018) tarafından yapılan çalıĢmada; ksiloz yan ürünü olan endüstriyel ksiloz kalıntılarına, Kolin klorür:Formik asit (1:1,5), Kolin klorür:1,4-Bütandiol (1:2) ve Betain:Laktik asit (1:2) kullanılarak farklı sıcaklıklarda (80, 100, 120°С) 2 saat süreyle ön iĢlem uygulanmıĢtır. Sıcaklık arttıkça örneklerdeki selüloz miktarının da arttığı belirtilmiĢtir. Enzimatik hidroliz sırasında elde edilen en yüksek glikoz verimine (%96.8) 120 °С sıcaklıkta Betain:Laktik asidin uygulandığı ön iĢlemle eriĢildiği belirtilmiĢtir.
Xing vd. (2018) tarafından yapılan çalıĢmada; pirinç samanı üzerine farklı DES‘lerin (Kolin klorür:Formik asit (1:2), Kolin klorür:Asetik asit (1:2), Kolin klorür:Gliserol
21
(1:2), Kolin klorür:Üre (1:2), Kolin klorür:Formik asit:Gliserol (1:1:1), Kolin klorür:Formik asit:Üre (1:1:1), Kolin klorür:Asetik asit:Gliserol (1:1:1) ve Kolin klorür:Asetik asit:Üre (1:1:1)) etkisi araĢtırılmıĢtır. Örnekler çözgen ile beraber yağ banyosunda 130 °С‘ de 2 saat boyunca bekletilmiĢtir. Kolin klorür:Formik asit:Asetik asit ön iĢleminde en yüksek toplam Ģeker 42.46 g/L elde edilmiĢtir. Clostridium sacccharobutylicum kullanılarak yapılan fermentasyon sonunda bütanol verimi 0.25g/g toplam Ģeker olarak bulunmuĢtur.
Bu çalıĢmanın genel amacı, lignoselülozik bir biyokütle olan ve aynı zamanda Türkiye‘de ki en önemli tarımsal atıklardan biri olan buğday samanının yapısını, mikrodalga eĢliğinde derin ötektik çözgen ile hızlı ve efektif bir Ģekilde parçalamak, devamında eĢ zamanlı sakkarifikasyon ve fermantasyon ile enerji ihtiyacında fosil yakıtlara alternatif olan biyoetanol üretmektir.
22 3. MATERYAL ve YÖNTEM
3.1 Materyal
Bu çalıĢmada; kullanılmıĢ olan buğday samanı, Ankara Üniversitesi Kenan Evren AraĢtırma ve Uygulama Çiftliği‘nden tedarik edilmiĢtir. Buğday samanı; değirmende (Apex mill, Apex Construction LTD, Ġngiltere) öğütülmüĢtür. ÖğütülmüĢ saman gözenek büyüklüğü 950 mm olan elekten geçirilmiĢtir. Samanın kompozisyon analizi NREL Laboratuvar Prosedürü NREL/TP-510-42618‘e (Sluiter vd. 2008) göre belirlenmiĢ ve çizelge 3.1‘ de verilmiĢtir. Samandaki kuru madde miktarı 105 ˚C‘de 1 gün bekletilerek %92.5 olarak belirlenmiĢtir.
Çizelge 3.1 Samanın kompozisyonu (kuru madde bazında) BileĢen miktarı (%)
Selüloz 34.70±0.90
Hemiselüloz 22.45±0,30
Klason Lignin 19.82±0.15
3.2 Yöntemler
3.2.1 Derin ötektik çözgenin hazırlanması
Ön iĢlemde kullanılacak olan derin ötektik çözgen; Sigmadan temin edilmiĢ olan Kolin klorür (≥98% saflıkta) ve ISOLAB‘dan temin edilmiĢ (98-100% saflıkta) olan formik asit kullanılarak hazırlanmıĢtır. Farklı mol oranlarında (1:2,1:3 ve 1:4) karıĢtırılan Kolin klorür ve Formik asit, 30 °С sıcaklıkta 180 rpm karıĢtırma hızında 2 saat süresince karıĢtırılmıĢtır. Süre sonunda; 80 °С sıcaklıkta 16 saat bekletilmiĢtir. Kullanılmadan önce oda sıcaklığında muhafaza edilmiĢtir (Xu vd. 2016).
23 3.2.2 Geleneksel ön iĢlem
Öğütülen buğday samanları, Kolin klorür: Formik asit (1:3) ile katı sıvı oranı 1:10 (g/mL) olacak Ģekilde karıĢtırılmıĢ ve 80 °С sıcaklıkta 24 saat bekletilmiĢtir (Jablonsky vd. 2015). Geleneksel ön iĢlemdeki mol oranı (1:3) belirlenirken mikrodalga sonuçları göz önünde bulundurmuĢ ve enzimatik hidroliz sırasında en çok Ģeker elde edilmesini sağlayan mol oranı seçilmiĢtir. Ön iĢlem sonunda DES-saman karıĢımına 200 mL su ilavesi yapılarak soğumaya bırakılmıĢ ve sonrasında örnek vakumlu filtrasyon düzeneği ile çözgenden ayrıĢtırılmıĢtır. AyrıĢtırma sonrasında iĢlenmiĢ saman örnekleri 250 mL saf su ile yıkanmıĢtır. Yıkanan katı örnekler 60 °С etüvde 1 gece bekletilerek kurutulmuĢtur. Örneklerdeki kuru madde miktarı %89.2 olarak belirlenmiĢtir.
3.2.3 Mikrodalga destekli ön iĢlem
Saman örnekleri; üç farklı mol oranında (1:2, 1:3, ve 1:4), farklı sürelerde (2, 5 ve 8 dakika) ve farklı mikrodalga güçlerinde (270, 360, ve 450 W) Kolin klorür: Formik asit ile ön iĢleme tabi tutulmuĢtur (ġekil 3.1). Tüm deneylerde katı/sıvı oranı (kuru saman/DES) 1:10 (g/mL) olacak Ģekilde ayarlanmıĢtır. Ön iĢlem sonunda, DES-saman karıĢımına 200 mL su ilavesi yapılarak soğuması beklenmiĢ ve ardından vakumlu filtrasyon ile geleneksel ön iĢlemde olduğu gibi süzme iĢlemi gerçekleĢtirilmiĢtir.
Örnekler, sonrasında 250 mL saf su ile kademeli olarak yıkanmıĢ ve 60 °С etüvde 1 gece bekletilerek kurutulmuĢtur. 1:4 mol oranında kuru madde miktarları % 89.6-93.2, 1:3 mol oranında % 91.3-93.2, 1:2 mol oranında ise % 90.2-94.6 arasında bulunmuĢtur.
Ön iĢlem sonrasında iĢlenmiĢ samanda kompozisyon analizleri yapılmıĢtır (Sluiter vd.
2008) ve iĢlenmiĢ saman örnekleri enzimatik hidroliz ve toplam Ģeker miktarının optimum olduğu durumda fermentasyon deneylerine tabi tutulmuĢtur.
24
ġekil 3.1 Mikrodalga destekli derin ötektik çözgen ön iĢlemi sonrası saman örneği
3.2.4 Enzimatik Hidroliz
Ön iĢlem uygulanmıĢ buğday samanı örnekleri; enzimatik olarak hidrolize edilmiĢtir.
Enzimatik hidroliz deneyleri NREL laboratuvar prosedürleri temel alınarak yapılmıĢtır (Selig vd. 2008). Ön iĢlemden geçirilmiĢ örneklerde nem; infrared nem tayin cihazı (HHB43-S, Metter Toledo, Amerika) ile gerçekleĢtirilmiĢtir. Deneylerde dozu 50 FPU/g kuru madde olacak Ģekilde Cellic Ctec 2 (Novazymes, Danimarka) enzimi kullanılmıĢtır. Cellic Ctec 2; selülaz, hemiselülaz ve yüksek seviyede β-glukozidaz içeren enzim karıĢımıdır. Nem miktarları göz önünde bulundurularak tartılan örneklerde; %5 kuru madde i
çeren karıĢım, sıcaklık 50 °С ve karıĢtırma hızı 150 rpm olacak Ģekilde çalkalamalı inkübatörde (Nükleon, NCI-120, Türkiye) 72 saat süresince hidroliz gerçekleĢtirilmiĢtir.
Örneklerden 6, 24, 48, 72. saatlerde alınan numuneler; 6000 devirde 10 dakika süresince santrifüj (Hermle, Z206 A, Almanya) edilmiĢtir. Santrifüj sonrası örnekler, 0.45 μm filtrelerden geçirilip HPLC analizleri için -18 °С dondurucuda depolanmıĢtır. Hidroliz deneyleri iki tekerrürlü gerçekleĢtirilmiĢtir.
25
Hidroliz verimliği aĢağıdaki EĢitlik 3.1 ve 3.2 kullanılarak hesaplanmıĢtır.
( ) ( ( )
( ) ) (3.1)
( ) ( ( )
( ) ) (3.2) (Not: Formüllerdeki 0.9 ve 0.88, glikoz ve ksilozu, glukan ve ksilan eĢdeğeri olarak yazabilmek için gerekli olan dönüĢüm çarpanlarıdır.)
3.2.5 Fermantasyon
Enzimatik hidroliz sonuçlarına göre maksimum toplam Ģeker (mg/g iĢlenmiĢ saman) elde etmeyi sağlayan koĢullar optimum proses koĢulları olarak belirlenmiĢ ve bu koĢullarda iĢlenmiĢ saman örnekleri eĢ zamanlı sakkarifikasyon ve fermantasyon deneylerine tabi tutulmuĢtur.
Simultane sakkarifikasyon ve fermantasyon denemeleri NREL laboratuar prosedürü modifiye edilerek gerçekleĢtirilmiĢtir (Dowe ve McMillan 2001). Mikroorganizma olarak Escherichia coli KO11 (ATCC 55124) kullanılmıĢtır. Bu bakteri glikozun yanı sıra, ksilozu da fermente ederek etanole çevirebilen mutant bir bakteridir.
Luria-Bertani besi yeri (LB broth) (pH 7.0) ve %5 (w/w)‘lik glikoz çözeltisi 1:1 (v/v) olacak Ģekilde karıĢtırılmıĢ ve sterilize edilmiĢtir. Escherichia coli KO11 bu karıĢıma 1:50 (v/v) olacak Ģekilde inoküle edilmiĢ ve karıĢım 37 °С‘de 24 saat süreyle inkübe edilmiĢtir (Lee vd. 2015). Süre sonunda hücreler santrifüjlenerek fermentasyonda kullanılmıĢtır.
Fermentasyonda, 3 mL Luria-Bertani besi yeri (LB broth fermentasyon için 10 kat konsantre hazırlanmıĢtır), 1.5 g iĢlenmiĢ kuru saman, 1.5 mL sodyum fosfat tampon çözeltisi (pH 7) ve saf su (son hacim 30 mL) ile karıĢtırılmıĢ ve karıĢım 121 °С‘de 15 dakika süreyle sterilize edilmiĢtir. Otoklav sonrası, otoklav sırasında kaybedilen su
26
miktarı, dozu 50 FPU/g kuru madde olacak Ģekilde 10 kat LB broth ile seyreltilmiĢ Cellic Ctec 2 (Novazymes, Danimarka) enzimi (2,475 mL) ve 1.5 mL E. coli KO11 eklenmiĢ ve fermantasyon baĢlatılmıĢtır (Lee vd. 2015). Fermantasyon deneyleri; 37
°С‘de 96 saat boyunca 150 rpm çalkalama hızındaki inkübatörde gerçekleĢtirilmiĢtir.
Fermentasyon boyunca (6, 24, 48, 72 ve 96.saatlerde) örnekler alınmıĢ ve 1000 devirde 10 dakika süresince 4°С‘ de santrifüj edilmiĢtir. Süpernantlar HPLC analizi için 0.45 μm filtrelerden geçirilmiĢ ve -18°С‘ de depolanmıĢtır.
3.2.6 Analizler
3.2.6.1 Kompozisyon analizi
Ön iĢlem öncesinde ve sonrasında örneklerde kompozisyon analizleri gerçekleĢtirilmiĢtir. Kuru madde miktarı 300 ± 10 mg olacak Ģekilde tartılan örneklere;
3 ± 0.01 mL % 72‘lik sülfürik asit ilave edildikten sonra 30°С su banyosunda 60 dakika süresince her 10 dakikada bir karıĢtırılmıĢtır. Sürenin sonunda üzerlerine 84.00±0.04 g saf su ilave edilerek asit konsantrasyonu %4‘e seyreltilmiĢtir. Örnekler, otoklavda 121
°С‘de 1 saat süresince bekletilmiĢ ve sonrasında sıvı kısım krozelerden süzdürülerek -18
°С‘de depolanmıĢtır. Katı kısım asitte çözünmeyen lignin miktarını belirlemekte kullanılmıĢtır. Lignin miktarı aĢağıdaki EĢitlik 3.3‘de gösterildiği Ģekilde hesaplanmıĢtır:
( ) (( ( )) ( )
( ) ) 0 (3.3) Ġlk süzülen sıvı kısımdan örnekler alınarak içerisindeki glikoz, ksiloz miktarları HPLC ile belirlenmiĢ ve NREL prosedüründe (Sluiter vd. 2008) anlatıldığı Ģekilde, saman örneklerindeki selüloz ve ksilan miktarları hesaplanmıĢtır. Ayrıca, sıvı kısımda asitte çözünen lignin miktarları, spektrofotometrik olarak 320 nm‘de okuma yapılarak, eĢitlik 3.4 yardımıyla hesaplanmıĢtır (Sluiter vd. 2008).
( ) ( ( )
( ) ) (3.4)
27 3.2.6.2 HPLC analizleri
Tüm örneklerdeki glikoz, ksiloz ve etanol konsantrasyonlarının belirlenmesinde Agilent 1260 Infinity HPLC sistemi kullanılmıĢtır. HPLC dedektörü RID dedektör olup sıcaklığı 40°C‘ye ayarlanmıĢtır. Analizler sırasında, Bio-Rad Aminex HPX-87H kolonu kullanılmıĢtır ve kolon sıcaklığı 60 °С‘de sabit tutulmuĢtur. Mobil faz olarak 0.005 M sülfürik asidin kullanıldığı sistemde akıĢ hızı 0.6 mL/dakika olarak ayarlanmıĢtır.
Enjeksiyon hacmi 10 µl‘dir. HPLC analizinde kullanılan standart kurveler EK1 ve EK2‘de gösterilmiĢtir.
Etanol verimliliği, iĢlenmiĢ örneklerdeki toplam Ģeker miktarı göz önünde bulundurularak aĢağıdaki EĢitlik 3.5 kullanılarak hesaplanmıĢtır.
Etanol verimi (%) ( )
( ) (3.5) (Not: Fermentasyona giren toplam Ģeker miktarında, iĢlenmiĢ biyokütledeki glikoz ve ksiloz miktarları (kullanılan mikroorganizma her ikisini de fermente edebildiği için) göz önüne alınmıĢtır. Formüldeki 0.511 değeri, bakterinin stokiyometrik biyokimyasına bağlı olan Ģekerden etanole dönüĢüm faktörüdür.)
3.2.6.3 Ġstatistik analizler
Bulgularla yönelik istatistiksel analizler MĠNĠTAB statistic software 16.1.1.1‖ (Minitab Inc., Amerika) paket programı kullanılarak gerçekleĢtirilmiĢtir. Bağımlı değiĢkenler arasındaki farklılık, ANOVA testi ile % 95 güven aralığında belirlenmiĢtir.
28 4. BULGULAR ve TARTIġMALAR
Bu çalıĢmada saman örnekleri; geleneksel ve mikrodalga destekli-DES (Kolin klorür:
Formik asit) ön iĢlemine tabi tutulmuĢtur. Mikrodalga destekli ön iĢlem; üç farklı mol oranı (1:2, 1:3, 1:4), mikrodalga gücü (270, 360 ve 450 W) ve ön iĢlem süresinde (2, 5 ve 8 dakika) gerçekleĢtirilmiĢtir. Proses koĢulları her bir mol oranı için çizelge 4.1‘ de gösterildiği Ģekilde numaralandırılmıĢtır. Ön iĢlem sonrasında proses parametrelerinin samanın kompozisyonuna, enzimatik hidroliz sonuçlarına etkileri incelenmiĢtir. Daha sonra, maksimum toplam Ģeker hidrolizini sağlayan proses koĢulları belirlenmiĢtir.
Optimum koĢullarda iĢlenmiĢ saman örneklerinde fermantasyon deneyleri gerçekleĢtirilerek etanol verimi belirlenmiĢtir.
Çizelge 4.1 Proses koĢullarının isimlendirilmesi
Proses KoĢulu Mikrodalga Gücü(W) Ön iĢlem süresi(dakika)
1 450 8
2 450 5
3 450 2
4 360 8
5 360 5
6 360 2
7 270 8
8 270 5
9 270 2
29
4.1 Mikrodalga Destekli Derin Ötektik Çözgen Ön ĠĢlemi
4.1.1 Ön iĢlem sonrası biyokütlenin geri kazanımı
Ön iĢlem sırasında biyokütlenin içerisindeki bazı bileĢenlerin çözünerek sıvı faza geçtiği bilinen bir olgudur. Bu sebeple katı haldeki biyokütlenin tamamını geri kazanmak mümkün olmamaktadır. Ön iĢlem sırasındaki kayıpları belirleyebilmek için ön iĢlem sonrası biyokütle tartılmıĢ ve ön iĢlem öncesi ağırlığına oranlanarak biyokütlenin geri kazanım yüzdesi belirlenmiĢtir. Geri kazanım sonuçları çizelge 4.2‘ de gösterilmiĢtir.
Sonuçlar incelendiğinde; mol oranlarındaki asitlik oranı, mikrodalga gücü ve ön iĢlem süresi arttıkça katının geri kazanım yüzdesinin azaldığı görülmüĢtür. Bu azalmanın istatiksel olarak önemli (p<0,05) olduğu bulunmuĢtur (EK 3). Mikrodalga gücünün ve süresinin artması ile lignoselülozik yapının daha çok parçalandığı ve buna bağlı olarak da geri kazanımın azaldığı düĢünülmektedir. En fazla geri kazanım (en az katı kaybı)
%93.8 ile 1:2 mol oranında 270 W mikrodalga gücünde, 2 dakika iĢlem gören örneklerde olmuĢtur. En az geri kazanım ise (% 62.3) 1:4 mol oranında 450 W mikrodalga gücünde, 8 dakika iĢlem gören örneklerde tespit edilmiĢtir.
Ön iĢlem Ģiddetinin artmasıyla geri kazanımdaki düĢüĢ literatürde de rapor edilmiĢtir ve sonuçlar çalıĢmamızla benzerlik göstermektedir. Procentese vd. (2015) tarafından mısır sapları üzerine yapılan çalıĢmada; biyokütlenin geri kazanımının sıcaklık arttıkça azaldığı tespit edilmiĢtir. ChCl:gliserol ön iĢleminde 80 °С‘de geri kazanım %85 iken 150°С‘de bu değerin % 55‘e düĢtüğü gözlemlenmiĢtir.
