Derin ötektik çözgenin hazırlanması

3. MATERYAL ve YÖNTEM

3.2 Yöntemler

3.2.1 Derin ötektik çözgenin hazırlanması

Ön iĢlemde kullanılacak olan derin ötektik çözgen; Sigmadan temin edilmiĢ olan Kolin klorür (≥98% saflıkta) ve ISOLAB‘dan temin edilmiĢ (98-100% saflıkta) olan formik asit kullanılarak hazırlanmıĢtır. Farklı mol oranlarında (1:2,1:3 ve 1:4) karıĢtırılan Kolin klorür ve Formik asit, 30 °С sıcaklıkta 180 rpm karıĢtırma hızında 2 saat süresince karıĢtırılmıĢtır. Süre sonunda; 80 °С sıcaklıkta 16 saat bekletilmiĢtir. Kullanılmadan önce oda sıcaklığında muhafaza edilmiĢtir (Xu vd. 2016).

23 3.2.2 Geleneksel ön iĢlem

Öğütülen buğday samanları, Kolin klorür: Formik asit (1:3) ile katı sıvı oranı 1:10 (g/mL) olacak Ģekilde karıĢtırılmıĢ ve 80 °С sıcaklıkta 24 saat bekletilmiĢtir (Jablonsky vd. 2015). Geleneksel ön iĢlemdeki mol oranı (1:3) belirlenirken mikrodalga sonuçları göz önünde bulundurmuĢ ve enzimatik hidroliz sırasında en çok Ģeker elde edilmesini sağlayan mol oranı seçilmiĢtir. Ön iĢlem sonunda DES-saman karıĢımına 200 mL su ilavesi yapılarak soğumaya bırakılmıĢ ve sonrasında örnek vakumlu filtrasyon düzeneği ile çözgenden ayrıĢtırılmıĢtır. AyrıĢtırma sonrasında iĢlenmiĢ saman örnekleri 250 mL saf su ile yıkanmıĢtır. Yıkanan katı örnekler 60 °С etüvde 1 gece bekletilerek kurutulmuĢtur. Örneklerdeki kuru madde miktarı %89.2 olarak belirlenmiĢtir.

3.2.3 Mikrodalga destekli ön iĢlem

Saman örnekleri; üç farklı mol oranında (1:2, 1:3, ve 1:4), farklı sürelerde (2, 5 ve 8 dakika) ve farklı mikrodalga güçlerinde (270, 360, ve 450 W) Kolin klorür: Formik asit ile ön iĢleme tabi tutulmuĢtur (ġekil 3.1). Tüm deneylerde katı/sıvı oranı (kuru saman/DES) 1:10 (g/mL) olacak Ģekilde ayarlanmıĢtır. Ön iĢlem sonunda, DES-saman karıĢımına 200 mL su ilavesi yapılarak soğuması beklenmiĢ ve ardından vakumlu filtrasyon ile geleneksel ön iĢlemde olduğu gibi süzme iĢlemi gerçekleĢtirilmiĢtir.

Örnekler, sonrasında 250 mL saf su ile kademeli olarak yıkanmıĢ ve 60 °С etüvde 1 gece bekletilerek kurutulmuĢtur. 1:4 mol oranında kuru madde miktarları % 89.6-93.2, 1:3 mol oranında % 91.3-93.2, 1:2 mol oranında ise % 90.2-94.6 arasında bulunmuĢtur.

Ön iĢlem sonrasında iĢlenmiĢ samanda kompozisyon analizleri yapılmıĢtır (Sluiter vd.

2008) ve iĢlenmiĢ saman örnekleri enzimatik hidroliz ve toplam Ģeker miktarının optimum olduğu durumda fermentasyon deneylerine tabi tutulmuĢtur.

ġekil 3.1 Mikrodalga destekli derin ötektik çözgen ön iĢlemi sonrası saman örneği

3.2.4 Enzimatik Hidroliz

Ön iĢlem uygulanmıĢ buğday samanı örnekleri; enzimatik olarak hidrolize edilmiĢtir.

Enzimatik hidroliz deneyleri NREL laboratuvar prosedürleri temel alınarak yapılmıĢtır (Selig vd. 2008). Ön iĢlemden geçirilmiĢ örneklerde nem; infrared nem tayin cihazı (HHB43-S, Metter Toledo, Amerika) ile gerçekleĢtirilmiĢtir. Deneylerde dozu 50 FPU/g kuru madde olacak Ģekilde Cellic Ctec 2 (Novazymes, Danimarka) enzimi kullanılmıĢtır. Cellic Ctec 2; selülaz, hemiselülaz ve yüksek seviyede β-glukozidaz içeren enzim karıĢımıdır. Nem miktarları göz önünde bulundurularak tartılan örneklerde; %5 kuru madde i

çeren karıĢım, sıcaklık 50 °С ve karıĢtırma hızı 150 rpm olacak Ģekilde çalkalamalı inkübatörde (Nükleon, NCI-120, Türkiye) 72 saat süresince hidroliz gerçekleĢtirilmiĢtir.

Örneklerden 6, 24, 48, 72. saatlerde alınan numuneler; 6000 devirde 10 dakika süresince santrifüj (Hermle, Z206 A, Almanya) edilmiĢtir. Santrifüj sonrası örnekler, 0.45 μm filtrelerden geçirilip HPLC analizleri için -18 °С dondurucuda depolanmıĢtır. Hidroliz deneyleri iki tekerrürlü gerçekleĢtirilmiĢtir.

Hidroliz verimliği aĢağıdaki EĢitlik 3.1 ve 3.2 kullanılarak hesaplanmıĢtır.

( ) ( ( )

( ) ) (3.1)

( ) ( ( )

( ) ) (3.2) (Not: Formüllerdeki 0.9 ve 0.88, glikoz ve ksilozu, glukan ve ksilan eĢdeğeri olarak yazabilmek için gerekli olan dönüĢüm çarpanlarıdır.)

3.2.5 Fermantasyon

Enzimatik hidroliz sonuçlarına göre maksimum toplam Ģeker (mg/g iĢlenmiĢ saman) elde etmeyi sağlayan koĢullar optimum proses koĢulları olarak belirlenmiĢ ve bu koĢullarda iĢlenmiĢ saman örnekleri eĢ zamanlı sakkarifikasyon ve fermantasyon deneylerine tabi tutulmuĢtur.

Simultane sakkarifikasyon ve fermantasyon denemeleri NREL laboratuar prosedürü modifiye edilerek gerçekleĢtirilmiĢtir (Dowe ve McMillan 2001). Mikroorganizma olarak Escherichia coli KO11 (ATCC 55124) kullanılmıĢtır. Bu bakteri glikozun yanı sıra, ksilozu da fermente ederek etanole çevirebilen mutant bir bakteridir.

Luria-Bertani besi yeri (LB broth) (pH 7.0) ve %5 (w/w)‘lik glikoz çözeltisi 1:1 (v/v) olacak Ģekilde karıĢtırılmıĢ ve sterilize edilmiĢtir. Escherichia coli KO11 bu karıĢıma 1:50 (v/v) olacak Ģekilde inoküle edilmiĢ ve karıĢım 37 °С‘de 24 saat süreyle inkübe edilmiĢtir (Lee vd. 2015). Süre sonunda hücreler santrifüjlenerek fermentasyonda kullanılmıĢtır.

Fermentasyonda, 3 mL Luria-Bertani besi yeri (LB broth fermentasyon için 10 kat konsantre hazırlanmıĢtır), 1.5 g iĢlenmiĢ kuru saman, 1.5 mL sodyum fosfat tampon çözeltisi (pH 7) ve saf su (son hacim 30 mL) ile karıĢtırılmıĢ ve karıĢım 121 °С‘de 15 dakika süreyle sterilize edilmiĢtir. Otoklav sonrası, otoklav sırasında kaybedilen su

miktarı, dozu 50 FPU/g kuru madde olacak Ģekilde 10 kat LB broth ile seyreltilmiĢ Cellic Ctec 2 (Novazymes, Danimarka) enzimi (2,475 mL) ve 1.5 mL E. coli KO11 eklenmiĢ ve fermantasyon baĢlatılmıĢtır (Lee vd. 2015). Fermantasyon deneyleri; 37

°С‘de 96 saat boyunca 150 rpm çalkalama hızındaki inkübatörde gerçekleĢtirilmiĢtir.

Fermentasyon boyunca (6, 24, 48, 72 ve 96.saatlerde) örnekler alınmıĢ ve 1000 devirde 10 dakika süresince 4°С‘ de santrifüj edilmiĢtir. Süpernantlar HPLC analizi için 0.45 μm filtrelerden geçirilmiĢ ve -18°С‘ de depolanmıĢtır.

3.2.6 Analizler

3.2.6.1 Kompozisyon analizi

Ön iĢlem öncesinde ve sonrasında örneklerde kompozisyon analizleri gerçekleĢtirilmiĢtir. Kuru madde miktarı 300 ± 10 mg olacak Ģekilde tartılan örneklere;

3 ± 0.01 mL % 72‘lik sülfürik asit ilave edildikten sonra 30°С su banyosunda 60 dakika süresince her 10 dakikada bir karıĢtırılmıĢtır. Sürenin sonunda üzerlerine 84.00±0.04 g saf su ilave edilerek asit konsantrasyonu %4‘e seyreltilmiĢtir. Örnekler, otoklavda 121

°С‘de 1 saat süresince bekletilmiĢ ve sonrasında sıvı kısım krozelerden süzdürülerek -18

°С‘de depolanmıĢtır. Katı kısım asitte çözünmeyen lignin miktarını belirlemekte kullanılmıĢtır. Lignin miktarı aĢağıdaki EĢitlik 3.3‘de gösterildiği Ģekilde hesaplanmıĢtır:

( ) (( ( )) ( )

( ) ) 0 (3.3) Ġlk süzülen sıvı kısımdan örnekler alınarak içerisindeki glikoz, ksiloz miktarları HPLC ile belirlenmiĢ ve NREL prosedüründe (Sluiter vd. 2008) anlatıldığı Ģekilde, saman örneklerindeki selüloz ve ksilan miktarları hesaplanmıĢtır. Ayrıca, sıvı kısımda asitte çözünen lignin miktarları, spektrofotometrik olarak 320 nm‘de okuma yapılarak, eĢitlik 3.4 yardımıyla hesaplanmıĢtır (Sluiter vd. 2008).

( ) ( ( )

( ) ) (3.4)

27 3.2.6.2 HPLC analizleri

Tüm örneklerdeki glikoz, ksiloz ve etanol konsantrasyonlarının belirlenmesinde Agilent 1260 Infinity HPLC sistemi kullanılmıĢtır. HPLC dedektörü RID dedektör olup sıcaklığı 40°C‘ye ayarlanmıĢtır. Analizler sırasında, Bio-Rad Aminex HPX-87H kolonu kullanılmıĢtır ve kolon sıcaklığı 60 °С‘de sabit tutulmuĢtur. Mobil faz olarak 0.005 M sülfürik asidin kullanıldığı sistemde akıĢ hızı 0.6 mL/dakika olarak ayarlanmıĢtır.

Enjeksiyon hacmi 10 µl‘dir. HPLC analizinde kullanılan standart kurveler EK1 ve EK2‘de gösterilmiĢtir.

Etanol verimliliği, iĢlenmiĢ örneklerdeki toplam Ģeker miktarı göz önünde bulundurularak aĢağıdaki EĢitlik 3.5 kullanılarak hesaplanmıĢtır.

Etanol verimi (%) ( )

( ) (3.5) (Not: Fermentasyona giren toplam Ģeker miktarında, iĢlenmiĢ biyokütledeki glikoz ve ksiloz miktarları (kullanılan mikroorganizma her ikisini de fermente edebildiği için) göz önüne alınmıĢtır. Formüldeki 0.511 değeri, bakterinin stokiyometrik biyokimyasına bağlı olan Ģekerden etanole dönüĢüm faktörüdür.)

3.2.6.3 Ġstatistik analizler

Bulgularla yönelik istatistiksel analizler MĠNĠTAB statistic software 16.1.1.1‖ (Minitab Inc., Amerika) paket programı kullanılarak gerçekleĢtirilmiĢtir. Bağımlı değiĢkenler arasındaki farklılık, ANOVA testi ile % 95 güven aralığında belirlenmiĢtir.

28 4. BULGULAR ve TARTIġMALAR

Bu çalıĢmada saman örnekleri; geleneksel ve mikrodalga destekli-DES (Kolin klorür:

Formik asit) ön iĢlemine tabi tutulmuĢtur. Mikrodalga destekli ön iĢlem; üç farklı mol oranı (1:2, 1:3, 1:4), mikrodalga gücü (270, 360 ve 450 W) ve ön iĢlem süresinde (2, 5 ve 8 dakika) gerçekleĢtirilmiĢtir. Proses koĢulları her bir mol oranı için çizelge 4.1‘ de gösterildiği Ģekilde numaralandırılmıĢtır. Ön iĢlem sonrasında proses parametrelerinin samanın kompozisyonuna, enzimatik hidroliz sonuçlarına etkileri incelenmiĢtir. Daha sonra, maksimum toplam Ģeker hidrolizini sağlayan proses koĢulları belirlenmiĢtir.

Optimum koĢullarda iĢlenmiĢ saman örneklerinde fermantasyon deneyleri gerçekleĢtirilerek etanol verimi belirlenmiĢtir.

Çizelge 4.1 Proses koĢullarının isimlendirilmesi

Proses KoĢulu Mikrodalga Gücü(W) Ön iĢlem süresi(dakika)

1 450 8

2 450 5

3 450 2

4 360 8

5 360 5

6 360 2

7 270 8

8 270 5

9 270 2

4.1 Mikrodalga Destekli Derin Ötektik Çözgen Ön ĠĢlemi

4.1.1 Ön iĢlem sonrası biyokütlenin geri kazanımı

Ön iĢlem sırasında biyokütlenin içerisindeki bazı bileĢenlerin çözünerek sıvı faza geçtiği bilinen bir olgudur. Bu sebeple katı haldeki biyokütlenin tamamını geri kazanmak mümkün olmamaktadır. Ön iĢlem sırasındaki kayıpları belirleyebilmek için ön iĢlem sonrası biyokütle tartılmıĢ ve ön iĢlem öncesi ağırlığına oranlanarak biyokütlenin geri kazanım yüzdesi belirlenmiĢtir. Geri kazanım sonuçları çizelge 4.2‘ de gösterilmiĢtir.

Sonuçlar incelendiğinde; mol oranlarındaki asitlik oranı, mikrodalga gücü ve ön iĢlem süresi arttıkça katının geri kazanım yüzdesinin azaldığı görülmüĢtür. Bu azalmanın istatiksel olarak önemli (p<0,05) olduğu bulunmuĢtur (EK 3). Mikrodalga gücünün ve süresinin artması ile lignoselülozik yapının daha çok parçalandığı ve buna bağlı olarak da geri kazanımın azaldığı düĢünülmektedir. En fazla geri kazanım (en az katı kaybı)

%93.8 ile 1:2 mol oranında 270 W mikrodalga gücünde, 2 dakika iĢlem gören örneklerde olmuĢtur. En az geri kazanım ise (% 62.3) 1:4 mol oranında 450 W mikrodalga gücünde, 8 dakika iĢlem gören örneklerde tespit edilmiĢtir.

Ön iĢlem Ģiddetinin artmasıyla geri kazanımdaki düĢüĢ literatürde de rapor edilmiĢtir ve sonuçlar çalıĢmamızla benzerlik göstermektedir. Procentese vd. (2015) tarafından mısır sapları üzerine yapılan çalıĢmada; biyokütlenin geri kazanımının sıcaklık arttıkça azaldığı tespit edilmiĢtir. ChCl:gliserol ön iĢleminde 80 °С‘de geri kazanım %85 iken 150°С‘de bu değerin % 55‘e düĢtüğü gözlemlenmiĢtir.

Çizelge 4.2 Mikrodalga destekli derin ötektik çözgen ön iĢlemi sonrası biyokütlenin geri kazanımı sonuçları (farklı proses koĢulları çizelge 4.1‘ de belirtilmiĢtir)

Geri kazanım (%)

4.1.2 Ön iĢlemin biyokütlenin kompozisyonu üzerine etkisi

ĠĢlem görmemiĢ samanda (Çizelge 3.1) %33.20 glukan, % 22.45 ksilan ve %19.82 klason lignin olduğu bulunmuĢtur. Mikrodalga destekli ön iĢlem sonuçları incelendiğinde 1:4 mol oranında; glukanın %40.8-55.6, ksilanın %2.8-21.3 ve asitte çözünmeyen ligninin %22.8-34.3, 1:3 mol oranında; glukanın %37.4-49.5, ksilanın

%3.1-19.4 ve asitte çözünmeyen ligninin %21.8-39.6, 1:2 mol oranında glukanın

%32.7-54, ksilanın %1.8-19.6 ve asitte çözünmeyen ligninin %21.9-38 arasında değiĢim gösterdiği gözlemlenmiĢtir (EK 5).

ĠĢlem görmemiĢ saman örneklerinin sonuçları ile kıyaslandığında; ön iĢlem sonrası glukan ve lignin miktarının arttığı, ksilan miktarının ise azaldığı görülmektedir (ġekil 4.1, ġekil 4.2, ġekil 4.3). Bu sonuçlar, ksiloz gibi pentoz yapıdaki Ģekerlerin sıcaklık ve asit ile kolaylıkla hidrolize olabildiğini göstermektedir (Palmqvist ve Hahn-Hagerdal 2000). Örneklerdeki ksilan miktarı genel olarak ön iĢlem süresinin artmasıyla azalmıĢtır. Ksilan miktarındaki azalmanın, yüksek mikrodalga güçlerinde (450 W) daha belirgin olduğu tespit edilmiĢtir.

Ön iĢleme tabi tutulmuĢ saman örneklerinin lignin içeriğinin ise % 21,8- 39,6 arasında olduğu bulunmuĢtur. Hammaddeye oranla lignin içeriğindeki bu artıĢ, örneklerden ksilanın ayrıĢtırılmasından kaynaklanmaktadır. Bir diğer deyiĢle, ksilan biyokütleden uzaklaĢtırıldığı için (hidrolize olarak sıvı faza geçtiği için) lignin miktarı artmıĢ gibi gözükmektedir. Ön iĢleme tabi tutulmuĢ örneklerdeki ksilan miktarındaki azalıĢın, selüloz (glukan) ve lignin miktarında artıĢa sebep olduğu ġekil 4.4‘de daha net gözükmektedir. Benzer sonuçlar diğer araĢtırmacılar tarafından da tespit edilmiĢtir.

Yapılan bir çalıĢmada, yumuĢak ağaç örneği organik asitler ile farklı koĢullarda ön iĢleme tabi tutulmuĢ ve kompozisyondaki değiĢim gözlemlenmiĢtir. Lignin içeriğinin % 32,36‘dan % 46,61‘e kadar arttığı ve bunun karbonhidrat degradasyonuyla bağlantılı Ģekilde gerçekleĢtiği tespit edilmiĢtir (Lim ve Lee 2013). Benzer Ģekilde BarıĢık vd.

(2016) tarafından yapılan çalıĢmada; buğday samanı farklı sıcaklık (170, 190, 210°С), asit konsantrasyonu (%1, 3, 5) ve sürelerde (10, 20, 30 dakika) ön iĢleme tabi tutulmuĢ ve ksilanın biyokütleden ayrılarak sıvı faza geçtiği ifade etmiĢtir. Kumar vd. (2016) tarafından pirinç samanı üzerinde farklı DES‘ler (ChCl:Gliserol, ChCl:Malik asit, ChCl:Laktik asit) kullanılarak yapılan çalıĢmada ön iĢlemle birlikte örneklerin glukan oranlarında artıĢ olduğu rapor edilmiĢtir. Bir diğer çalıĢmada, (Procentese vd. 2015) mısır koçanı farklı DES‘ler (ChCl:gliserol, ChCl:Ġmidazol) kullanılarak farklı sıcaklıklarda (80, 115 ve 150°С) ön iĢleme tabi tutulmuĢtur. ChCl:gliserol kullanılarak yapılan ön iĢlemde, sıcaklığın 80 °С‘den 150 °С‘ye çıkarılması, ksilan miktarının

%25.3‘den %21.1‘e azalmasına sebep olurken, glukan miktarının %32.5‘den %52.7‘ye artmasına sebep olmuĢtur. Benzer sonuç ChCl:Ġmidazol ile yapılan deneyler sonunda da tespit edilmiĢtir (glukan miktarı %38.4‘den %41.1‘e artarken, ksilan miktarı

%30.0‘dan %5.6‘ya düĢmüĢtür).

ġekil 4.1 Farklı ön iĢlem koĢullarında(1:4 mol oranında) DES ile iĢlenmiĢ saman örneklerinin kompozisyonu (farklı proses koĢulları çizelge 4.1‘ de belirtilmiĢtir)

ġekil 4.2 Farklı ön iĢlem koĢullarında (1:3 mol oranında) DES ile iĢlenmiĢ saman örneklerinin kompozisyonu (farklı proses koĢulları çizelge 4.1‘ de belirtilmiĢtir)

0 20 40 60 80 100

1 2 3 4 5 6 7 8 9

Asitte çözünmeyen lignin

Ksilan Glukan

0,0 20,0 40,0 60,0 80,0 100,0

1 2 3 4 5 6 7 8 9

Asitte çözünmeyen lignin Ksilan

Glukan

ġekil 4.3 Farklı ön iĢlem koĢullarıında (1:2 mol oranında) DES ile iĢlenmiĢ saman örneklerinin kompozisyonu (farklı proses koĢulları çizelge 4.1‘ de belirtilmiĢtir)

ġekil 4.4 Farklı ön iĢlem koĢullarında DES ile iĢlenmiĢ saman örneklerinin glukan ve lignin içeriklerinin (%) ve örnekteki ksilan miktarı (%) ile değiĢimi

0 20 40 60 80 100

1 2 3 4 5 6 7 8 9

Asitte çözünmeyen lignin Ksilan

Glukan

0 10 20 30 40 50 60

0 5 10 15 20 25

Glukan/Lignin(%)

Ksilan(%)

Lignin Glukan

4.1.3 Derin ötektik çözgen ön iĢleminin hidroliz üzerine etkisi

Farklı koĢullardaki ön iĢlemden sonra; buğday samanında enzimatik hidroliz deneyleri gerçekleĢtirilmiĢtir ve bu koĢullarda elde edilen glikoz (mg/mL), ksiloz (mg/mL) ve toplam Ģeker miktarları (mg/g iĢlenmiĢ saman) belirlenmiĢtir.

Sonuçlar genel olarak incelendiğinde; tüm proses koĢullarının glikoz konsantrasyonu ve ksiloz konsantrasyonu üzerine etkisi önemli bulunmuĢtur (p<0.05) (EK 6-7). Bir baĢka ifade ile DES‘in mol oranında, mikrodalga gücünde ve ön iĢlem süresindeki değiĢimler, enzimatik hidroliz sırasında açığa çıkan glikoz ve ksiloz miktarında etki yaratmaktadır.

Sabit mol oranında ve sabit ön iĢlem süresinde (1:2 mol oranı ve 2 dakika ön iĢlem süresi), mikrodalga gücünde ki artıĢın istatiksel olarak anlamlı olduğu bulunmuĢtur (p<0.05). Tüm mol oranlarında, mikrodalga gücü ve ön iĢlem süresinin artmasıyla, enzimatik hidroliz sırasında elde edilen Ģeker konsantrasyonlarının arttığı görülmüĢtür.

Glikoz ve ksiloz miktarlarının (mg/mL) ön iĢlem süresinden çok büyük oranda etkilendiği söylenebilir. Tüm mol oranlarında 2 dakika süreyle yapılan ön iĢlemin (ġekil 4.5, ġekil 4.6, ġekil 4.7 - Proses KoĢulları 3, 6, 9) Ģekerleri yeterince hidrolize etmekte çok etkili olmadığı tespit edilmiĢtir (EK 4). Glikoz miktarının en düĢük değeri (6.85 mg/mL) 1:4 mol oranında 270 W mikrodalga gücünde 2 dakika süreyle iĢlenmiĢ samanda gözlemlenmiĢtir. Bu sonuç, düĢük mikrodalga gücü ve süresinde, formik asit miktarı fazla olsa dahi yeterince glikoz hidrolize edilemediğini göstermektedir. Ksiloz miktarı ise en düĢük değerini (1.18 mg/mL) en ekstrem proses koĢullarında (1:4 mol oranı, 450 W mikrodalga gücü, 8 dakika ön iĢlem süresi) almıĢtır. Bunun sebebi ise, daha önceden de belirtildiği gibi hemiselülozun sıcaklık ve kimyasallara karĢı duyarlı olması ve ön iĢlem süresince çözünerek sıvı faza geçmesidir. Bir baĢka ifade ile bu sonuç, ekstrem ön iĢlem koĢullarında hemiselüloz kayıplarının yüksek olduğunu göstermektedir. Glikoz miktarı en yüksek (29.20 mg/mL), 1:2 mol oranında 450 W mikrodalga gücünde 8 dakika süreyle iĢlenmiĢ samanda gözlemlenmiĢtir. Mikrodalga gücü ve sürenin artması ile lignoselülozik yapı daha iyi parçalanmıĢ ve böylelikle selülaz enzimi yapı içerisinde daha iyi nüfuz ederek daha yüksek miktarlarda glikoz elde edilmiĢtir. Ksiloz miktarının en yüksek değeri ise (4.09 mg/mL) 1:4 mol oranında 360 W mikrodalga gücünde 5 dakika süreyle iĢlenmiĢ samanda gözlemlenmiĢtir.

Literatürde, mısır atıklarının 130 °С‘de 3 saat boyunca Kolin klorür:Formik asit (1:2) ile iĢlendiği bir çalıĢmada enzimatik hidroliz sırasında elde edilen maksimum glikoz konsantrasyonunun 17.0 g/L olduğu rapor edilmiĢtir (Xu vd. 2016). Bir diğer çalıĢmada;

palmiye ağacı yapraklarında, Kolin klorür:Üre kullanılarak 4 saat boyunca 120 °С‘de uygulanan ön iĢlemin 14.76 g/L ksiloz elde etmeyi sağladığı belirtilmiĢtir (Loow vd.

2018). Enzimatik hidroliz aĢamasında elde edilen Ģeker konsantrasyonlarının farklılığı hammadde, ön iĢlem ve enzimatik hidroliz parametrelerindeki farklılıklardan kaynaklanmaktadır. Bunlara ek olarak, bizim çalıĢmamıza benzer Ģekilde Liu vd. (2019) tarafından ön iĢlem sıcaklığının artmasıyla enzimatik hidroliz sırasında elde edilen glikoz ve ksiloz konsantrasyonlarında artıĢ olduğunu rapor etmiĢlerdir. Trietilbenzil amonyak klorür:Laktik asit ile sabit mol oranında (1:9) ve sabit ön iĢlem süresinde (10 saat) yapılan ön iĢlemde sıcaklığın 80°С‘den 110 °С‘e çıkarılması ile glikoz veriminin

%55.48‘den 66.32‘a, ksiloz veriminin ise %14.25‘den 20.09‘a arttığı gözlemlenmiĢtir.

Ön iĢlem süresinin kıyaslandığı bir diğer çalıĢmada, Wan ve Mun (2018) tarafından sago palmiyesi atıklarına, Kolin Klorür:Üre (1:2), Kolin klorür:Sitrik asit (1:2) ve Kolin klorür:Gliserol (1:1) çözgenleri uygulanmıĢtır. Ön iĢlem süresinin 1 saatten 3 saate çıkardığında glikoz veriminin arttığı (en yüksek 3.saat 5 mg/mL) sonrasında ise 5.saatte 3,4 mg/mL‘e düĢtüğü bildirilmiĢtir. Çok uzun ön iĢlem sürelerinin de Ģeker degredasyonuna sebep olduğu anlaĢılmaktadır.

Mol oranındaki değiĢimlerin, glikoz ve ksiloz konsantrasyonuna istatiksel olarak önemli bir etkiye neden olduğu yukarıda belirtilmiĢtir. DüĢük mikrodalga gücünde ve kısa ön iĢlem süresinde (360 W, 2 dk) çözgendeki asit konsantrasyonu 2 kat arttırıldığında (1:2 mol oranından 1:4 mol oranına), glikoz miktarı %7 oranında bir azalıĢ göstermiĢtir.

Ancak bu azalma aynı koĢullarda 450W mikrodalga gücünde sırasıyla %26.6 olmuĢtur.

Bu sonuç, çözgendeki asit konsantrasyonundaki artıĢın, mikrodalga gücünün artmasıyla glikoz degredasyonuna sebep olduğunu göstermektedir. Ekstrem proses koĢulu (450W mikrodalga gücü ve 8 dakika ön iĢlem süresi) sabit tutulduğunda, mol oranında ki asit konsantrasyonundaki artıĢın istatiksel olarak anlamlı olduğu bulunmuĢtur (p<0.05).

Benzer sonuçlar literatürde de rapor edilmiĢtir. Mısır koçanı sabit sıcaklıkta (90 °С), 24 saat süreyle Kolin klorür:Laktik asit ile farklı mol oranlarında (1:10-1:15) ön iĢleme tabi tutulmuĢtur. Çözgendeki asit konsantrasyonunun artması ile glikoz veriminin

%83,2‘den %79,1‘e düĢtüğü belirtilmiĢtir (Zhang vd. 2016). Enzimatik hidroliz verimlerinin çözgendeki asit miktarı ve asitin kuvveti ile bağıntılı olduğu açıklanmıĢtır.

Mol oranının, ksiloz konsantrasyonu üzerine etkisinin belirli bir trendi izlemediği gözlemlenmektedir. Bu da mikrodalga gücü, ön iĢlem süresi ve mol oranı arasında interaksiyonların olduğunu ve değiĢik proses koĢullarında mol oranının etkisinin de değiĢebildiğini düĢündürmektedir. Benzer Ģekilde, literatürde mol oranının etkisinin incelendiği bir çalıĢmada, çözgendeki asit konsantrasyonunun artması ile ksiloz değerlerinin belirli bir trend izlemediği rapor edilmiĢtir. Liu vd. (2019) tarafından yapılan çalıĢmada; buğday samanına Trietilbenzil amonyak klorür:Laktik asit kullanılarak ön iĢlem uygulanmıĢtır. Sabit sıcaklık (100 °С) ve ön iĢlem süresinde (10 saat) farklı mol oranlarının ksiloz verimi üzerine etkisi incelenmiĢtir. Mol oranının 1:5‘

den 1:9‘a arttırılması (laktik asit konsantrasyonunun artması) ksiloz veriminin

%75.3‘den 71.0‘a azalmasına, 1:11‘e arttırıldığında %77.9‘e yükselmesine ve 1:13‘de bu değerin % 74.3‘e düĢmesine sebep olmuĢtur.

ġekil 4.5 Farklı ön iĢlem koĢullarının (1:4 mol oranında) enzimatik hidroliz sırasında elde edilen glikoz ve ksiloz miktarları (mg/mL) üzerine etkisi (farklı proses koĢulları çizelge 4.1‘ de belirtilmiĢtir)

0 5 10 15 20 25 30 35

1 2 3 4 5 6 7 8 9

ġeker konsantrasyonu(mg/mL)

Proses koĢulları

Ksiloz(mg/mL) Glikoz (mg/mL)

4.1.4 Derin ötektik çözgen ön iĢleminin toplam Ģeker üzerine etkisi

Bir gram iĢlenmiĢ samandan elde edilen toplam Ģeker miktarları (mg/g) ġekil 4.8-4.10‘da gösterilmiĢtir. En düĢük toplam Ģeker miktarı (170 mg/g) 1:4 mol oranında 270 W mikrodalga gücünde 2 dakika süreyle iĢlenmiĢ samanda bulunmuĢtur. Bu miktar

mikrodalga gücünün ve ön iĢlem süresinin artması ile yaklaĢık 3.7 kat artarak 619 mg/g ile maksimum değerini (1:3 mol oranı, 360 W mikrodalga gücü, 8 dakika ön iĢlem süresi) almıĢtır. Literatürde DES ön iĢlemi ile farklı hammaddelerden farklı miktarlarda Ģeker elde edildiği gözlenmektedir. Kumar vd. (2015) tarafından yapılan çalıĢmada;

pirinç samanı Kolin klorür:Laktik asit (1:5) ile iĢlenmiĢ ve enzimatik hidroliz aĢamasında elde edilen toplam indirgen Ģeker miktarını 333 mg/g olarak tespit edilmiĢtir. Kumar vd. (2016) pirinç samanı ile yaptıkları diğer bir çalıĢmalarında ChCl:Gliserol ile ön iĢlemin 226.7 g/L indirgen Ģeker elde etmeyi sağladığını rapor etmiĢlerdir. Bu çalıĢmalarda elde edilen Ģeker miktarının bizim çalıĢmamıza kıyasla az olmasının sebebi hammadde, çözgen ve proses parametrelerindeki farklılıklardır.

Proses parametrelerinin enzimatik hidroliz sırasında açığa çıkan toplam Ģeker miktarı (mg Ģeker/g iĢlenmiĢ saman) üzerine etkisi ġekil 4.11‘de daha net görülebilmektedir.

Toplam Ģeker miktarı glikoz konsantrasyon sonuçları ile paralellik göstermiĢ.

Uygulanan ön iĢlem süresinin artması lignoselülozik yapıda daha çok parçalanmaya neden olduğu için toplam Ģeker miktarının da ön iĢlem süresiyle önemli ölçüde arttığı görülmektedir. Elde edilen toplam Ģeker miktarı mikrodalga gücünün 270 W‘dan 360 W‘a artmasıyla yaklaĢık 1.3 kat artmıĢ, ancak sonrasında 450 W‘da göreceli olarak sabit kalmıĢtır. DES içerisindeki formik asitin mol miktarındaki artıĢ ile toplam Ģeker miktarının azaldığı tespit edilmiĢtir. Bu da, asit konsantrasyonunun artması ile yaĢanan Ģeker kayıplarıyla açıklanabilmektedir.

Projede fermentasyon aĢamasında kullanılan mutant bakteri (E. coli KO11) 5 ve 6 karbonlu Ģekerleri fermente ederek etanol üretebilen bir mikroorganizmadır. Bu sebeple glikoz veya ksiloz konsantrasyonlarından daha çok ortamdaki toplam Ģekeri maksimize etmek önem kazanmaktadır. Dolayısıyla, parametrelerin optimizasyonunda 1 gram iĢlenmiĢ samandan en çok toplam Ģeker elde etmeyi sağlayan koĢul göz önünde bulundurulmuĢtur. Maksimum toplam Ģekerin (619 mg/g ) elde edilmesini sağlayan optimum noktalar 1:3 mol oranı, 360 W mikrodalga gücü ve 8 dakika ön-iĢlem süresi olarak tespit edilmiĢtir.

ġekil 4.8 Farklı ön iĢlem koĢullarının (1:4 mol oranında) enzimatik hidroliz sırasında elde edilen toplam Ģeker miktarı (mg Ģeker/ g iĢlenmiĢ saman) üzerine etkisi (farklı proses koĢulları çizelge 4.1‘ de belirtilmiĢtir)

ġekil 4.9 Farklı ön iĢlem koĢullarının (1:3 mol oranında) enzimatik hidroliz sırasında elde edilen toplam Ģeker miktarı (mg Ģeker/ g iĢlenmiĢ saman) üzerine etkisi (farklı proses koĢulları çizelge 4.1‘ de belirtilmiĢtir)

479

ġekil 4.10 Farklı ön iĢlem koĢullarının (1:2 mol oranında) enzimatik hidroliz sırasında elde edilen toplam Ģeker miktarı (mg Ģeker/ g iĢlenmiĢ saman) üzerine etkisi (farklı proses koĢulları çizelge 4.1‘ de belirtilmiĢtir)

1:4

ġekil 4.11 Proses parametrelerinin enzimatik hidroliz sırasında elde edilen toplam Ģeker miktarı (mg Ģeker/ g iĢlenmiĢ saman) üzerine etkisi

611

4.1.5 Derin ötektik çözgen ön iĢleminin verim üzerine etkisi

Enzimatik hidroliz sırasında açığa çıkan glikoz ve ksiloz miktarları, materyal ve metot kısmında belirtilen denklemlerde kullanılarak glikoz ve ksiloz verimleri hesaplanmıĢ ve çizelge 4.3‘de verilmiĢtir. Bu çizelgedeki verim, iĢlenmiĢ samandaki glukanın yüzde olarak glikoza hidrolize olma oranı ve aynı Ģekilde ksilanın yüzde olarak ksiloza hidrolize olma oranıdır. Toplam Ģeker miktarına benzer Ģekilde tüm mol oranlarında ve

Belgede ANKARA ÜNĠVERSĠTESĠ FEN BĠLĠMLERĠ ENSTĠTÜSÜ YÜKSEK LĠSANS TEZĠ. DERĠN ÖTEKTĠK ÇÖZGEN ÖN ĠġLEMĠNĠN BUĞDAY SAMANINDAN BĠYOETANOL ÜRETĠMĠNE ETKĠSĠ (sayfa 34-0)