Derin Ötektik Çözgen

Abbott vd (2004) tarafından, baĢlangıç bileĢenlerine göre çok daha düĢük erime noktasına sahip, iki veya daha fazla Lewis asidi ve bazı ya da Bronsted-Lory asidi ve

14

bazlarının karıĢımından oluĢan sistem, derin ötektik çözgen olarak tanımlanmıĢtır.

Ġyonik sıvılara benzer fiziksek özelliklere sahip olduğu düĢünülmüĢtür, ancak baĢlangıç bileĢenlerinin kaynağı ve kimyasal oluĢum prosesi açısından farklılık göstermektedir.

DES; hidrojen bağ alıcısı olarak hareket eden bir halojen tuzu ve hidrojen bağı donörünün (HBD) birleĢmesinden oluĢmaktadır (ġekil 2.5). Hidrojen bağ donörleri;

amid, amin, karboksilik asit, alkol ve metal tuzları gibi birçok seçenekten oluĢabilmektedir. Derin ötektik çözgenler (Çizelge 2.5) genel olarak 4 grupta incelenebilmektedir (Zhou ve Baker 2013, Smith vd. 2014).

Derin ötektik çözgenler Cat⁺X^-zY genel formülü ile ifade edilmektedir. Cat+ amonyum, fosfonyum ve sülfonyum katyonlarını, X ise halojenür anyon olan Lewis bazını göstermektedir. Kompleks anyonik türlerde; bir Lewis veya Brønsted asit Y ve X arasında oluĢmaktadır. Denklemde; ‗z‘ olarak belirtilen ifade, anyon ile etkileĢime giren Y molekülü sayısıdır. Yapılan çalıĢmaların büyük bir çoğunluğu; kuarterner amonyum ve imidazolium katyonları (örn. kolin klorür) üzerinde yoğunlaĢmıĢtır (Smith vd. 2014).

Tip 1 olarak tanımlanan derin ötektik çözgenler, MClx ve kuarterner amonyum tuzlarından oluĢmuĢ olup; kloroalüminat/imidozolium tuzları ve FeCl2, AgCl, CuCl, LiCl, CuCl2, SnCl2, ZnCl2 gibi çeĢitli metal halojenlerin birleĢiminden oluĢmaktadır.

Tip 1 oluĢturmak için düĢük erime noktasına sahip hidrat olmayan metal halojen tuzları gerekmektedir. Fakat bu tuzların sınırlı olması; Tip 2‘nin (hidrat metal halojenleri: kolin klorürün) kullanımının artmasına neden olmuĢtur. Tip 2 ötektikleri; Kolin klorür ve kobalt, nikel gibi birçok geçiĢ metal türleri ile oluĢmaktadır. Tip 4; metal klorür (ZnCl2) ve üre, asetamid, hekzandiol gibi hidrojen bağ donörlerinden oluĢmaktadır. Kolin klorür ve hidrojen bağı donörlerinin (amid, karboksilik asit, alkol) karıĢımı (Ģekil 2.5) en yaygın kullanılan çözgen sınıfını (Tip 3) oluĢturmaktadır (Smith 2014).

En yaygın DES oluĢturabilen bileĢiklerden birisi olan kolin klorür(ChCl); fosil rezervlerinden kolaylıkla üretilen veya biyokütleden ekstrakte edilebilen, ucuz ve toksik etkisi olmayan kuaterner amonyum tuzudur. Bu tuz; üre, karboksilik asit (okzalik asit, süksinik asit, formik asit, sitrik asit ve amino asit) ve poliol (gliserol,karbonhidrat) gibi

15

hidrojen bağ donörleri ile hızlı Ģekilde derin ötektik çözgen oluĢturabilmektedir (ġekil 2.5). Ġyonik sıvılar ile benzerlik göstermesine rağmen; iyonik olmayan bileĢenler ile de DES oluĢturabilmesi bu bileĢiği farklı kılmaktadır (Zhang vd. 2012).

ġekil 2.5 DES sentezinde sıklıkla kullanılan halojen tuzları ve hidrojen bağ donörleri (Zhang vd.2012, Smith vd. 2014)

DES‘lerin içerisindeki hidrojen bağ dönörünün oranı, DES‘lerin erime noktasını belirlediğine inanılmaktadır. Hidrojen bağ donörü çeĢidi, tuz çeĢidi ve mol oranları;

yoğunluğu, yüzey gerilimi ve viskoziteyi etkileyen baĢlıca faktörlerdir. DES; genel olarak diğer moleküler çözgenlere göre daha yüksek viskozite ve daha düĢük ısıl iletkenliğe sahiptir. Wonder waals ve elektrostatik etkiler yüksek viskoziteye katkı sağlamaktadır (Smith vd 2014).

16

Çizelge 2.5 DES sınıflandırılması (Zhou ve Baker 2013, Smith vd. 2014).

Tip Kimyasal yapı Formül

Metallerin iĢlenmesi, polimer sentezi, nanotüp kompozit hazırlanması, biyodizel saflaĢtırılması, ilaçların çözündürülmesi, biyolojik tranformasyonlar ve CO2

absorpsiyonu gibi çok farklı alanlarda derin ötektik çözgenlerin kullanıldığı belirtilmiĢtir (Degam 2017). Bu kullanım alanlarına ek olarak, DES‘ler son yıllarda, selülozik biyokütle ön-iĢlem aĢamasında da iyonik sıvıların yerine tercih edilmeye baĢlanmıĢtır.

Literatürde birçok farklı derin ötektik çözgen, pirinç sapları (Kumar vd. 2016), palmiye ağacı yaprakları (Loow vd. 2018), mısır koçanı (Procentese vd. 2015), söğüt ağacı (Li vd. 2017) ve gıda endüstrisi atıkları (Procentese vd. 2018) gibi farklı biyokütle kaynakları üzerinde denenmiĢ ve lignoselülozik yapıyı etkin bir Ģekilde parçaladığı tespit edilmiĢtir. Ancak literatür ayrıntılı olarak incelendiğinde DES ile yapılan ön-iĢlemlerin süresinin uzun olduğu (2-24 saat) gözlemlenmektedir (Loow vd. 2017).

ĠĢlem süresinin kısaltılması amacıyla, DES ön iĢleminin mikrodalga ile birleĢtirilmesi yenilikçi bir yaklaĢım olarak düĢünülmektedir.

17 2.5 Mikrodalga ön iĢlemi

Mikrodalga; dalga boyları 1m-1mm ve frekansları 0,3-300 Ghz arasında değiĢen elektromanyetik dalgalardır (Haque 1999). Endüstriyel ölçekli kullanılan mikrodalgalar, genellikle 915 MHz frekansta, ev tipi kullanılanlar ise 2450 MHz frekanstadır.

Mikrodalga, elektromanyetik spektrumda, radyo frekans dalgalar ile kızılötesi dalgalar arasında yer almaktadır (Datta ve Anantheswaran 2001). Geleneksel ısıtmaya göre;

mikrodalga yöntemi çok daha farklı bir prensipte çalıĢmaktadır. Geleneksel yöntemde dıĢtan içe doğru bir ısıtma izlenirken, mikrodalgada hacimsel ısıtma olmaktadır.

Mikrodalgalar, dipolar parçacıkların rotasyonu ya da iyonik parçacıkların göçü ile moleküler bir harekete sebep olurlar. Ġyonik iletim, uygulanan elektromanyetik alandaki çözünen veya titreĢen iyonların göç etmesini, dipol rotasyon ise polarize olmuĢ moleküllerin, bir hizaya sokulması anlamına gelmektedir (Sumnu 2001). Bu Ģekilde ısınma; biyokütlenin ĢiĢmesine, hemiselüloz ve ligninin parçalanarak yapıdan ayrılmasına sebep olmaktadır. Mikrodalga ile ön iĢlem, AFEX ve buhar ile patlatma ön iĢlemleri gibi benzer patlama etkisi yaratmaktadır (Zhu vd. 2015; Puligundla vd. 2016).

2.6 Kaynak Özetleri

Bu bölümde, son yıllarda DES‘ler kullanılarak yapılan ön iĢlem çalıĢmaları detaylı olarak incelenmiĢtir.

Procentese vd. (2015) tarafından yapılan çalıĢmada; mısır sapı üç çeĢit çözgen (Kolin klorür:Gliserol (1:2), Kolin klorür:Üre (2:1), Kolin klorür: Ġmidazol (3:7)) kullanılarak farklı sıcaklıklarda 15 saat boyunca su banyosunda ön iĢleme tabi tutulmuĢtur. Hidroliz sonrası toplam Ģeker miktarı ChCl:Gliserol ile 150 °С sıcaklıkta iĢlenen örneklerde 37.8 g/g, ChCl:Üre ile 115 °С‘de iĢlenen örneklerde 20.9 g/g ve ChCl:Ġmidazol ile 115

°С sıcaklıkta iĢlenen örneklerde 35.9 g/g olarak bulunmuĢtur. En yüksek glikoz verimi 150 °С sıcaklıkta (%94.6) ChCl:Ġmidazol ile iĢlenen örneklerden, en yüksek ksiloz verimi ise (%95.5) aynı sıcaklıkta ChCl:Gliserol ile iĢlenen biyokütleden elde edildiği belirtilmiĢtir. Mısır sapında; ChCl:Ġmidazol‘ün (3:7 mol oranında) sıcaklık 80°С iken % 40 olan delignifikasyon oranının 150 °С‘ de % 88 olduğu belirtilmiĢtir.

18

Zhang vd. (2016) tarafından yapılan çalıĢmada; mısır koçanına farklı (90 °С sıcaklık ve 24 saat süre ile) derin ötektik çözgenlerle ön iĢlem uygulanmıĢtır. Monokarboksilik asit:

ChCl, Dikarboksilik asit:ChCl ve Polialkol:ChCl üç farklı Ģekilde oluĢturulmuĢ ve iĢlenen biyokütlenin hidrolizi sonrasında elde edilen glikoz verimlilikleri değerlendirilmiĢtir. Monokarboksilik asit: ChCl türlerinden 1:5 oranında ki ChCl:Laktik asit‘in % 83.5 ile en yüksek glikoz verimi verdiği tespit edilmiĢ. Dikarboksilik asit:

ChCl‘de ise en yüksek glikoz verimi Malonik asit:ChCl (%61.5) ile bulunmuĢtur. 2:1 mol oranında oluĢturulmuĢ Polialkol:ChCl çözeltileri içinde en yüksek verimin %96.4 ile Gliserol:ChCl‘de gözlendiği belirtilmiĢtir. Ayrıca, Gliserol:ChCl‘nin lignini maksimum seviyede ayrıĢtırdığı, katı materyalin kazanımında ve yüksek glikoz verimi elde etmekte çok etkili olduğu rapor edilmiĢtir.

Yapılan bir baĢka çalıĢmada; pirinç samanı farklı DES‘ler ile iĢlenmiĢtir. Kolin klorür ile birlikte malonik asit, malik asit, 1,2-propanediol, sitrik asit, tartarik asit, gliserol, etilen glikol, laktik asit, üre ve oksalik asit gibi farklı hidrojen bağ donörleri kullanılarak ötektik çözgenler hazırlanmıĢtır. Pirinç samanı; farklı mol oranları kullanılarak hazırlanmıĢ çözgenlerle; %5 ve %10 katı oranlarında, farklı sıcaklık (60-121°С) ve sürelerde (30 dakika-12 saat) ön iĢleme maruz bırakılmıĢtır. Maksimum indirgen Ģeker miktarının (226.7 g/L) ChCl:Gliserol ile iĢlenmiĢ saman örneklerinin enzimatik hidrolizinden elde edildiği tespit edilmiĢ ve sakkarifikasyon verimi %87.1 olarak rapor edilmiĢtir (Kumar vd. 2016).

Xu vd. (2016) tarafından yapılan çalıĢmada; ChCl:Üre (1:2), ChCl: Gliserol (1:2), ChCl:Formik asit (1:2), ChCl:Asetik asit (1:2), ChCl:Oksalik asit (1:1), ChCl:Malonik asit (1:1) ve ChCl:Oksalik asit (1:1) kullanılarak mısır atıklarına ön iĢlem (130°С, 100 rpm‘de 2 saat) uygulanmıĢtır. ChCl: Formik asit ön iĢlemi sonunda elde edilen glikoz verimi optimizasyonla maksimize edilmeye çalıĢılmıĢtır. Optimizasyon sonunda; 3 saat boyunca uygulanmıĢ ön iĢlem ile 17.0 g/L glikoz elde edilmiĢ ve glikoz verimi %99 olarak bulunmuĢtur. Clostridium saccharobutylicum mikroorganizması kullanıldığında;

bütanol konsantrasyonu 5.63 g/L ve bütanol verimi 0.17 g/g toplam Ģeker olarak belirtilmiĢtir.

19

Lynam vd. (2017); çam örnekleri üzerinde Kolin klorür:Formik asit (1:2), Kolin klorür:Laktik asit (1:10), Kolin klorür:Asetik asit (1:2), Betaine:Laktik asit(1:2) gibi farklı derin ötektik çözgenler kullanarak ön iĢlem yapmıĢtır. Katı/sıvı oranı 1:10 (g/g) olarak hazırlanan örneklere 155 °С‘de 2 saat ön iĢlem uygulanmıĢtır. Kolin klorür:Formik asidin;en yüksek lignin çözünülebilirliğine (%14), en düĢük ksilan (<%1) ve selüloz çözünülürlüğüne (<%1) neden olduğu belirlenmiĢtir. Çam örneklerinde ön iĢlem sonunda; glikoz veriminin Kolin klorür:Formik asitle (%70) Kolin klorür:Gliserol‘e göre 7 kat daha fazla olduğu tespit edilmiĢtir.

Procentese vd. (2017) tarafından yapılan çalıĢmada marul yapraklarına Kolin klorür:Gliserol (1:2) ile farklı sıcaklık (80-150°С) ve sürelerde (3-16 saat) su banyosunda ön iĢlem uygulanmıĢtır ve iĢlenmiĢ örneklerden Clostridium acetobutylicum kullanılarak bütanol üretilmiĢtir. Ön iĢlemin 150 °С‘ de 6 saat boyunca sürdüğü koĢulda glikoz verimi %94.9 ve ksiloz verimi %75 bulunmuĢtur. Bu koĢulda elde edilen bütanol verimi 0.04 g/g, fermentasyon sonundaki bütanol konsantrasyonu ise 0.5 g/L olarak bulunmuĢtur.

Chen ve Wan vd. (2018) tarafından yapılan çalıĢmada; 3 farklı hammaddede (mısır koçanı, dallı darı otu (switchgrass) ve fil otu (miscanthus)) Kolin klorür: Laktik asit (1:2) ile mikrodalgada-DES (800 W ve 45 saniye) ön iĢlemi uygulanmıĢtır. ĠĢlenen biyokütlenin geri kazanım oranları mısır koçanı, dallı darı otu ve fil otu için sırasıyla % 36.64, 50.46 ve 53.21 olarak bildirilmiĢtir. Glikoz verimleri mısır koçanı, dallı darı otu ve fil otu için sırası ile %78.5, %75 ve <%40 olarak rapor edilmiĢtir. Uygulanan ön iĢlemin biyokütle sindirilebilirliğini arttırdığı ifade edilmiĢtir.

Li vd. (2018) tarafından yapılan çalıĢmada; pirinç samanı farklı mol oranlarında (1:1,1:3,1:5) hazırlanmıĢ Kolin klorür: Laktik asit çözeltisiyle 90-120°С sıcaklıkta 3-6 saat süresince ön iĢleme tabi tutulmuĢtur. En ekstrem koĢul olan; 1:5 mol oranında, 120°С sıcaklıkta 3 saat süreyle iĢlenmiĢ örneklerde; selüloz, ksilan ve lignin miktarları sırasıyla %59.2, 8.3 ve 11.3 olarak tespit edilmiĢtir. Bu iĢlem sonunda gerçekleĢtirilen enzimatik hidroliz deneylerinden elde edilen örneklerde glikoz veriminin %60-70 arasında değiĢtiği belirtilmiĢtir.

20

Loow vd. (2018) tarafından yapılan çalıĢmada; palmiye ağacı yaprakları, Kolin klorür:Üre (1:2) ile (1:10 (w/v) katı/sıvı oranında) farklı sıcaklık (60-140 °С) ve sürelerde (2-10 saat) yağ banyosunda ön iĢleme tabi tutulmuĢ ve ardından inorganik tuz ile iĢlenmiĢtir. Dört saat boyunca 120 °С‘de uygulanan ön iĢlemin 14.76 g/L ksiloz verimi sağladığı belirtilmiĢtir.

Procentese vd. (2018) tarafından yapılan çalıĢmada; gıda endüstrisi atıkları (patates kabuğu, elma atıkları ve kahve atıkları) üzerinde iki farklı derin ötektik çözgenin (Kolin klorür:Gliserol ve Kolin klorür:Etilen glikol) etkisi incelenmiĢtir. Ön iĢlem, farklı katı/çözgen oranlarında (1:8-1:32) ve farklı sıcaklıklarda (60-150 °С) 3 saat boyunca gerçekleĢtirilmiĢtir. Kolin klorür:Gliserol‘ün (1:32 katı/çözgen oranında) 150 °С sıcaklıkta örneklerden maksimum glikoz elde etmeyi sağladığı bildirilmiĢtir. Patates kabuğu, elma atıkları ve kahve atıklarından elde edilen maksimum glikoz miktarları sırasıyla 0.80, 0.95 ve 0.88 g glikoz/g biyokütle olarak rapor edilmiĢtir.

Sert vd. (2018) tarafından yapılan çalıĢmada; ayçiçeği sapında Kolin klorür:Sitrik asit (0.7:0.3), Kolin kloür:Tartarik asit (0.7:0.3), Kolin klorür:Okzalik(1:1) asit kullanılarak mikrodalgada ön iĢlem uygulanmıĢtır. Ön iĢlem; farklı sıcaklık (130-180 °С) ve sürelerde (1-10 dakika) gerçekleĢtirilmiĢtir. Mikrodalgada Kolin klorür:Oksalik asit kullanıldığında, 180°С sıcaklıkta 1 dakika boyunca iĢlem gören örneklerde en yüksek geri kazanım verimi (%99.07) elde edilmiĢtir.

Guo vd. (2018) tarafından yapılan çalıĢmada; ksiloz yan ürünü olan endüstriyel ksiloz kalıntılarına, Kolin klorür:Formik asit (1:1,5), Kolin klorür:1,4-Bütandiol (1:2) ve Betain:Laktik asit (1:2) kullanılarak farklı sıcaklıklarda (80, 100, 120°С) 2 saat süreyle ön iĢlem uygulanmıĢtır. Sıcaklık arttıkça örneklerdeki selüloz miktarının da arttığı belirtilmiĢtir. Enzimatik hidroliz sırasında elde edilen en yüksek glikoz verimine (%96.8) 120 °С sıcaklıkta Betain:Laktik asidin uygulandığı ön iĢlemle eriĢildiği belirtilmiĢtir.

Xing vd. (2018) tarafından yapılan çalıĢmada; pirinç samanı üzerine farklı DES‘lerin (Kolin klorür:Formik asit (1:2), Kolin klorür:Asetik asit (1:2), Kolin klorür:Gliserol

21

(1:2), Kolin klorür:Üre (1:2), Kolin klorür:Formik asit:Gliserol (1:1:1), Kolin klorür:Formik asit:Üre (1:1:1), Kolin klorür:Asetik asit:Gliserol (1:1:1) ve Kolin klorür:Asetik asit:Üre (1:1:1)) etkisi araĢtırılmıĢtır. Örnekler çözgen ile beraber yağ banyosunda 130 °С‘ de 2 saat boyunca bekletilmiĢtir. Kolin klorür:Formik asit:Asetik asit ön iĢleminde en yüksek toplam Ģeker 42.46 g/L elde edilmiĢtir. Clostridium sacccharobutylicum kullanılarak yapılan fermentasyon sonunda bütanol verimi 0.25g/g toplam Ģeker olarak bulunmuĢtur.

Bu çalıĢmanın genel amacı, lignoselülozik bir biyokütle olan ve aynı zamanda Türkiye‘de ki en önemli tarımsal atıklardan biri olan buğday samanının yapısını, mikrodalga eĢliğinde derin ötektik çözgen ile hızlı ve efektif bir Ģekilde parçalamak, devamında eĢ zamanlı sakkarifikasyon ve fermantasyon ile enerji ihtiyacında fosil yakıtlara alternatif olan biyoetanol üretmektir.

22 3. MATERYAL ve YÖNTEM

3.1 Materyal

Bu çalıĢmada; kullanılmıĢ olan buğday samanı, Ankara Üniversitesi Kenan Evren AraĢtırma ve Uygulama Çiftliği‘nden tedarik edilmiĢtir. Buğday samanı; değirmende (Apex mill, Apex Construction LTD, Ġngiltere) öğütülmüĢtür. ÖğütülmüĢ saman gözenek büyüklüğü 950 mm olan elekten geçirilmiĢtir. Samanın kompozisyon analizi NREL Laboratuvar Prosedürü NREL/TP-510-42618‘e (Sluiter vd. 2008) göre belirlenmiĢ ve çizelge 3.1‘ de verilmiĢtir. Samandaki kuru madde miktarı 105 ˚C‘de 1 gün bekletilerek %92.5 olarak belirlenmiĢtir.

Çizelge 3.1 Samanın kompozisyonu (kuru madde bazında) BileĢen miktarı (%)

Selüloz 34.70±0.90

Hemiselüloz 22.45±0,30

Klason Lignin 19.82±0.15

3.2 Yöntemler

3.2.1 Derin ötektik çözgenin hazırlanması

Ön iĢlemde kullanılacak olan derin ötektik çözgen; Sigmadan temin edilmiĢ olan Kolin klorür (≥98% saflıkta) ve ISOLAB‘dan temin edilmiĢ (98-100% saflıkta) olan formik asit kullanılarak hazırlanmıĢtır. Farklı mol oranlarında (1:2,1:3 ve 1:4) karıĢtırılan Kolin klorür ve Formik asit, 30 °С sıcaklıkta 180 rpm karıĢtırma hızında 2 saat süresince karıĢtırılmıĢtır. Süre sonunda; 80 °С sıcaklıkta 16 saat bekletilmiĢtir. Kullanılmadan önce oda sıcaklığında muhafaza edilmiĢtir (Xu vd. 2016).

23 3.2.2 Geleneksel ön iĢlem

Öğütülen buğday samanları, Kolin klorür: Formik asit (1:3) ile katı sıvı oranı 1:10 (g/mL) olacak Ģekilde karıĢtırılmıĢ ve 80 °С sıcaklıkta 24 saat bekletilmiĢtir (Jablonsky vd. 2015). Geleneksel ön iĢlemdeki mol oranı (1:3) belirlenirken mikrodalga sonuçları göz önünde bulundurmuĢ ve enzimatik hidroliz sırasında en çok Ģeker elde edilmesini sağlayan mol oranı seçilmiĢtir. Ön iĢlem sonunda DES-saman karıĢımına 200 mL su ilavesi yapılarak soğumaya bırakılmıĢ ve sonrasında örnek vakumlu filtrasyon düzeneği ile çözgenden ayrıĢtırılmıĢtır. AyrıĢtırma sonrasında iĢlenmiĢ saman örnekleri 250 mL saf su ile yıkanmıĢtır. Yıkanan katı örnekler 60 °С etüvde 1 gece bekletilerek kurutulmuĢtur. Örneklerdeki kuru madde miktarı %89.2 olarak belirlenmiĢtir.

3.2.3 Mikrodalga destekli ön iĢlem

Saman örnekleri; üç farklı mol oranında (1:2, 1:3, ve 1:4), farklı sürelerde (2, 5 ve 8 dakika) ve farklı mikrodalga güçlerinde (270, 360, ve 450 W) Kolin klorür: Formik asit ile ön iĢleme tabi tutulmuĢtur (ġekil 3.1). Tüm deneylerde katı/sıvı oranı (kuru saman/DES) 1:10 (g/mL) olacak Ģekilde ayarlanmıĢtır. Ön iĢlem sonunda, DES-saman karıĢımına 200 mL su ilavesi yapılarak soğuması beklenmiĢ ve ardından vakumlu filtrasyon ile geleneksel ön iĢlemde olduğu gibi süzme iĢlemi gerçekleĢtirilmiĢtir.

Örnekler, sonrasında 250 mL saf su ile kademeli olarak yıkanmıĢ ve 60 °С etüvde 1 gece bekletilerek kurutulmuĢtur. 1:4 mol oranında kuru madde miktarları % 89.6-93.2, 1:3 mol oranında % 91.3-93.2, 1:2 mol oranında ise % 90.2-94.6 arasında bulunmuĢtur.

Ön iĢlem sonrasında iĢlenmiĢ samanda kompozisyon analizleri yapılmıĢtır (Sluiter vd.

2008) ve iĢlenmiĢ saman örnekleri enzimatik hidroliz ve toplam Ģeker miktarının optimum olduğu durumda fermentasyon deneylerine tabi tutulmuĢtur.

24

ġekil 3.1 Mikrodalga destekli derin ötektik çözgen ön iĢlemi sonrası saman örneği

3.2.4 Enzimatik Hidroliz

Ön iĢlem uygulanmıĢ buğday samanı örnekleri; enzimatik olarak hidrolize edilmiĢtir.

Enzimatik hidroliz deneyleri NREL laboratuvar prosedürleri temel alınarak yapılmıĢtır (Selig vd. 2008). Ön iĢlemden geçirilmiĢ örneklerde nem; infrared nem tayin cihazı (HHB43-S, Metter Toledo, Amerika) ile gerçekleĢtirilmiĢtir. Deneylerde dozu 50 FPU/g kuru madde olacak Ģekilde Cellic Ctec 2 (Novazymes, Danimarka) enzimi kullanılmıĢtır. Cellic Ctec 2; selülaz, hemiselülaz ve yüksek seviyede β-glukozidaz içeren enzim karıĢımıdır. Nem miktarları göz önünde bulundurularak tartılan örneklerde; %5 kuru madde i

çeren karıĢım, sıcaklık 50 °С ve karıĢtırma hızı 150 rpm olacak Ģekilde çalkalamalı inkübatörde (Nükleon, NCI-120, Türkiye) 72 saat süresince hidroliz gerçekleĢtirilmiĢtir.

Örneklerden 6, 24, 48, 72. saatlerde alınan numuneler; 6000 devirde 10 dakika süresince santrifüj (Hermle, Z206 A, Almanya) edilmiĢtir. Santrifüj sonrası örnekler, 0.45 μm filtrelerden geçirilip HPLC analizleri için -18 °С dondurucuda depolanmıĢtır. Hidroliz deneyleri iki tekerrürlü gerçekleĢtirilmiĢtir.

25

Hidroliz verimliği aĢağıdaki EĢitlik 3.1 ve 3.2 kullanılarak hesaplanmıĢtır.

( ) ( ( )

( ) ) (3.1)

( ) ( ( )

( ) ) (3.2) (Not: Formüllerdeki 0.9 ve 0.88, glikoz ve ksilozu, glukan ve ksilan eĢdeğeri olarak yazabilmek için gerekli olan dönüĢüm çarpanlarıdır.)

3.2.5 Fermantasyon

Enzimatik hidroliz sonuçlarına göre maksimum toplam Ģeker (mg/g iĢlenmiĢ saman) elde etmeyi sağlayan koĢullar optimum proses koĢulları olarak belirlenmiĢ ve bu koĢullarda iĢlenmiĢ saman örnekleri eĢ zamanlı sakkarifikasyon ve fermantasyon deneylerine tabi tutulmuĢtur.

Simultane sakkarifikasyon ve fermantasyon denemeleri NREL laboratuar prosedürü modifiye edilerek gerçekleĢtirilmiĢtir (Dowe ve McMillan 2001). Mikroorganizma olarak Escherichia coli KO11 (ATCC 55124) kullanılmıĢtır. Bu bakteri glikozun yanı sıra, ksilozu da fermente ederek etanole çevirebilen mutant bir bakteridir.

Luria-Bertani besi yeri (LB broth) (pH 7.0) ve %5 (w/w)‘lik glikoz çözeltisi 1:1 (v/v) olacak Ģekilde karıĢtırılmıĢ ve sterilize edilmiĢtir. Escherichia coli KO11 bu karıĢıma 1:50 (v/v) olacak Ģekilde inoküle edilmiĢ ve karıĢım 37 °С‘de 24 saat süreyle inkübe edilmiĢtir (Lee vd. 2015). Süre sonunda hücreler santrifüjlenerek fermentasyonda kullanılmıĢtır.

Fermentasyonda, 3 mL Luria-Bertani besi yeri (LB broth fermentasyon için 10 kat konsantre hazırlanmıĢtır), 1.5 g iĢlenmiĢ kuru saman, 1.5 mL sodyum fosfat tampon çözeltisi (pH 7) ve saf su (son hacim 30 mL) ile karıĢtırılmıĢ ve karıĢım 121 °С‘de 15 dakika süreyle sterilize edilmiĢtir. Otoklav sonrası, otoklav sırasında kaybedilen su

26

miktarı, dozu 50 FPU/g kuru madde olacak Ģekilde 10 kat LB broth ile seyreltilmiĢ Cellic Ctec 2 (Novazymes, Danimarka) enzimi (2,475 mL) ve 1.5 mL E. coli KO11 eklenmiĢ ve fermantasyon baĢlatılmıĢtır (Lee vd. 2015). Fermantasyon deneyleri; 37

°С‘de 96 saat boyunca 150 rpm çalkalama hızındaki inkübatörde gerçekleĢtirilmiĢtir.

Fermentasyon boyunca (6, 24, 48, 72 ve 96.saatlerde) örnekler alınmıĢ ve 1000 devirde 10 dakika süresince 4°С‘ de santrifüj edilmiĢtir. Süpernantlar HPLC analizi için 0.45 μm filtrelerden geçirilmiĢ ve -18°С‘ de depolanmıĢtır.

3.2.6 Analizler

3.2.6.1 Kompozisyon analizi

Ön iĢlem öncesinde ve sonrasında örneklerde kompozisyon analizleri gerçekleĢtirilmiĢtir. Kuru madde miktarı 300 ± 10 mg olacak Ģekilde tartılan örneklere;

3 ± 0.01 mL % 72‘lik sülfürik asit ilave edildikten sonra 30°С su banyosunda 60 dakika süresince her 10 dakikada bir karıĢtırılmıĢtır. Sürenin sonunda üzerlerine 84.00±0.04 g saf su ilave edilerek asit konsantrasyonu %4‘e seyreltilmiĢtir. Örnekler, otoklavda 121

°С‘de 1 saat süresince bekletilmiĢ ve sonrasında sıvı kısım krozelerden süzdürülerek -18

°С‘de depolanmıĢtır. Katı kısım asitte çözünmeyen lignin miktarını belirlemekte kullanılmıĢtır. Lignin miktarı aĢağıdaki EĢitlik 3.3‘de gösterildiği Ģekilde hesaplanmıĢtır:

( ) (( ( )) ( )

( ) ) 0 (3.3) Ġlk süzülen sıvı kısımdan örnekler alınarak içerisindeki glikoz, ksiloz miktarları HPLC ile belirlenmiĢ ve NREL prosedüründe (Sluiter vd. 2008) anlatıldığı Ģekilde, saman örneklerindeki selüloz ve ksilan miktarları hesaplanmıĢtır. Ayrıca, sıvı kısımda asitte çözünen lignin miktarları, spektrofotometrik olarak 320 nm‘de okuma yapılarak, eĢitlik 3.4 yardımıyla hesaplanmıĢtır (Sluiter vd. 2008).

( ) ( ( )

( ) ) (3.4)

27 3.2.6.2 HPLC analizleri

Tüm örneklerdeki glikoz, ksiloz ve etanol konsantrasyonlarının belirlenmesinde Agilent 1260 Infinity HPLC sistemi kullanılmıĢtır. HPLC dedektörü RID dedektör olup sıcaklığı 40°C‘ye ayarlanmıĢtır. Analizler sırasında, Bio-Rad Aminex HPX-87H kolonu kullanılmıĢtır ve kolon sıcaklığı 60 °С‘de sabit tutulmuĢtur. Mobil faz olarak 0.005 M sülfürik asidin kullanıldığı sistemde akıĢ hızı 0.6 mL/dakika olarak ayarlanmıĢtır.

Enjeksiyon hacmi 10 µl‘dir. HPLC analizinde kullanılan standart kurveler EK1 ve EK2‘de gösterilmiĢtir.

Etanol verimliliği, iĢlenmiĢ örneklerdeki toplam Ģeker miktarı göz önünde bulundurularak aĢağıdaki EĢitlik 3.5 kullanılarak hesaplanmıĢtır.

Etanol verimi (%) ( )

( ) (3.5) (Not: Fermentasyona giren toplam Ģeker miktarında, iĢlenmiĢ biyokütledeki glikoz ve ksiloz miktarları (kullanılan mikroorganizma her ikisini de fermente edebildiği için) göz önüne alınmıĢtır. Formüldeki 0.511 değeri, bakterinin stokiyometrik biyokimyasına bağlı olan Ģekerden etanole dönüĢüm faktörüdür.)

3.2.6.3 Ġstatistik analizler

Bulgularla yönelik istatistiksel analizler MĠNĠTAB statistic software 16.1.1.1‖ (Minitab Inc., Amerika) paket programı kullanılarak gerçekleĢtirilmiĢtir. Bağımlı değiĢkenler arasındaki farklılık, ANOVA testi ile % 95 güven aralığında belirlenmiĢtir.

28 4. BULGULAR ve TARTIġMALAR

Bu çalıĢmada saman örnekleri; geleneksel ve mikrodalga destekli-DES (Kolin klorür:

Formik asit) ön iĢlemine tabi tutulmuĢtur. Mikrodalga destekli ön iĢlem; üç farklı mol oranı (1:2, 1:3, 1:4), mikrodalga gücü (270, 360 ve 450 W) ve ön iĢlem süresinde (2, 5 ve 8 dakika) gerçekleĢtirilmiĢtir. Proses koĢulları her bir mol oranı için çizelge 4.1‘ de gösterildiği Ģekilde numaralandırılmıĢtır. Ön iĢlem sonrasında proses parametrelerinin samanın kompozisyonuna, enzimatik hidroliz sonuçlarına etkileri incelenmiĢtir. Daha sonra, maksimum toplam Ģeker hidrolizini sağlayan proses koĢulları belirlenmiĢtir.

Optimum koĢullarda iĢlenmiĢ saman örneklerinde fermantasyon deneyleri gerçekleĢtirilerek etanol verimi belirlenmiĢtir.

Çizelge 4.1 Proses koĢullarının isimlendirilmesi

Proses KoĢulu Mikrodalga Gücü(W) Ön iĢlem süresi(dakika)

1 450 8

2 450 5

3 450 2

4 360 8

5 360 5

6 360 2

7 270 8

8 270 5

9 270 2

29

4.1 Mikrodalga Destekli Derin Ötektik Çözgen Ön ĠĢlemi

4.1.1 Ön iĢlem sonrası biyokütlenin geri kazanımı

Ön iĢlem sırasında biyokütlenin içerisindeki bazı bileĢenlerin çözünerek sıvı faza geçtiği bilinen bir olgudur. Bu sebeple katı haldeki biyokütlenin tamamını geri kazanmak mümkün olmamaktadır. Ön iĢlem sırasındaki kayıpları belirleyebilmek için ön iĢlem sonrası biyokütle tartılmıĢ ve ön iĢlem öncesi ağırlığına oranlanarak biyokütlenin geri kazanım yüzdesi belirlenmiĢtir. Geri kazanım sonuçları çizelge 4.2‘ de gösterilmiĢtir.

Sonuçlar incelendiğinde; mol oranlarındaki asitlik oranı, mikrodalga gücü ve ön iĢlem süresi arttıkça katının geri kazanım yüzdesinin azaldığı görülmüĢtür. Bu azalmanın istatiksel olarak önemli (p<0,05) olduğu bulunmuĢtur (EK 3). Mikrodalga gücünün ve süresinin artması ile lignoselülozik yapının daha çok parçalandığı ve buna bağlı olarak da geri kazanımın azaldığı düĢünülmektedir. En fazla geri kazanım (en az katı kaybı)

%93.8 ile 1:2 mol oranında 270 W mikrodalga gücünde, 2 dakika iĢlem gören örneklerde olmuĢtur. En az geri kazanım ise (% 62.3) 1:4 mol oranında 450 W mikrodalga gücünde, 8 dakika iĢlem gören örneklerde tespit edilmiĢtir.

Ön iĢlem Ģiddetinin artmasıyla geri kazanımdaki düĢüĢ literatürde de rapor edilmiĢtir ve

Ön iĢlem Ģiddetinin artmasıyla geri kazanımdaki düĢüĢ literatürde de rapor edilmiĢtir ve