T.C.
TARIM VE ORMAN BAKANLIĞI
Tarımsal Araştırmalar ve Politikalar Genel Müdürlüğü
PROJE SONUÇ RAPORU (Doktora Projesi)
İzmir İlinde Depolanan Patateslerde Kuru Çürüklük Hastalığına Neden Olan Fusarium spp.’nin Tanılanması ve Mücadele Olanaklarının Araştırılması
TAGEM-BS-15/04-04/02-04
Gülcan YIKILMAZSOY Tez Danışmanı: Prof. Dr. Necip TOSUN
ZİRAİ MÜCADELE ARAŞTIRMA ENSTİTÜSÜ MÜDÜRLÜĞÜ / BORNOVA
Aralık/2019 İZMİR
2
ÖNSÖZ
Patates orijini Türkiye olmayan ancak iklim ve ekolojik yapısı ile coğrafi konumu dikkate alındığında ülkemiz açısından oldukça önemli olan bir bitkidir ve günümüzde yurdun hemen her yerinde yetiştirilebilmektedir. Patates içerdiği nişasta, karbonhidrat, protein ve mineraller ile insan beslenmesinde en az buğday ve pirinç kadar önemli bir yer tutmaktadır.
Ülkemizde ova ve yayla koşullarında, değişik coğrafi bölgelerde, tüm yıla dağılmış tohumluk veya yemeklik patates üretimi yapılmaktadır. Patatesin yıl boyunca tüketimi yapıldığından, üretilen patatesin önemli bir kısmının depolanması gerekmektedir. Tüm dünyada olduğu gibi ülkemizde de iyi depolama yapılmayan yerlerde ortaya çıkan hastalıklar önemli ürün kayıplarına neden olmaktadır. Hasat sonrasında patateste görülen çeşitli tipteki çürüklükler içinde yaş ve kuru çürüklükler önemli bir yer tutmakta ve büyük kayıplara sebep olmaktadır. Patates kuru çürüklük hastalığı (Fusarium spp.) hasat sonrası patates yumrularında görülen, dünya çapında çok önemli bir depo hastalığıdır ve başlıca konukçusu patatestir. Hastalık depoda yumruları ve ekimden sonra da yumru parçalarını etkilediğinden hasatta %25’in üzerinde kayıplar meydana gelebildiği gibi depolarda ise bu oran %60’a çıkabilmektedir.
Bu projede patates depolarında görülen en önemli çürüklüklerden olan kuru çürüklüğe (Fusarium spp.) neden olan etmenlerin tanılanması amaçlanmıştır. Hastalık belirtisi gösteren patates yumrularından elde edilen Fusarium türleri morfolojik ve moleküler yöntemler kullanılarak Fusarium sambucinum, F. oxysporum, F.
equiseti ve F. avenaceum olarak tanılanmıştır. Bölgede yaygın olarak depolanan 13 patates çeşidinde yürütülen çeşit reaksiyon çalışmalarında söz konusu hastalığa duyarlı patates çeşitleri belirlenmiştir. Ülkemizde herhangi bir ruhsatlı bitki koruma ürününün bulunmadığı patates kuru çürüklük hastalığına karşı, farklı kimyasal ve biyolojik preparatlar kullanılarak yürütülen ilaçlamalarda patatesler üretici koşullarında olduğu gibi soğuk hava deposunda muhafaza edilerek ilaçların etkinliği araştırılmıştır.
Söz konusu bu çalışma T.C. Tarım ve Orman Bakanlığı Tarımsal Araştırmalar ve Politikalar Genel Müdürlüğü (TAGEM) tarafından tarafından desteklenmiş olup katkılarından dolayı teşekkür ederim. Ayrıca sağlamış oldukları imkanlardan dolayı Bornova Zirai Mücadele Araştırma Enstitüsü Müdürlüğü yetkililerine teşekkür ederim.
3
İÇİNDEKİLER Sayfa No
ÖNSÖZ 2
İÇİNDEKİLER 3
ÇİZELGE LİSTESİ 5
ŞEKİL LİSTESİ 6
SİMGELER VE KISALTMALAR DİZİNİ 7
ÖZET 8
SUMMARY 9
1. GİRİŞ 10 2. LİTERATÜR ÖZETİ
2.1. Türkiye’de Yapılan Çalışmalar
2.2. Dünya’da Yapılan Çalışmalar 16 16 17 3. MATERYAL ve METOT 22 3.1. MATERYAL 22 3.2. METOT 23
3.2.1. Örnek Toplama Çalışmaları 23
3.2.2. İzolasyon Çalışmaları 23
3.2.3. Patojenisite Testleri ve Virülenslik Düzeylerinin Belirlenmesi 23
3.2.4. Tanılama Çalışmaları 24
3.2.4.1. Morfolojik Karakteristiklerine Göre Tanılama 24
3.2.4.2. Moleküler Yöntemler Kullanılarak Tanılama 24
3.2.5. Çeşit Duyarlılık Seviyesinin Belirlenmesi 26
3.2.6. Hastalıkla Mücadele Çalışmaları 27
3.2.6.1. In vitro’da Fungisitlere Duyarlılık Düzeylerinin Belirlenmesi 27
3.2.6.2. In vivo’da Preparatların Etkinliklerinin Belirlenmesi 28
3.2.7. Tohum Çimlenme Testi 29
4. BULGULAR 29 4.1. Örnek Toplama Çalışmaları 29
4.2. Patojenisite Testleri ve Virülenslik Düzeylerinin Belirlenmesi 30
4.3. Morfolojik Karakteristiklerine Göre Tanılama 30
4.4. Moleküler Yöntemler Kullanılarak Tanılama 31
4
4.5. Çeşit Duyarlılık Seviyesinin Belirlenmesi 34
4.6. In vitro’da Fungisitlere Duyarlılık Düzeylerinin Belirlenmesi 35
4.7. In vivo’da Preparatların Etkinliklerinin Belirlenmesi 36
4.8. Tohum Çimlenme Testi 38
5. TARTIŞMA ve SONUÇ 39 KAYNAKÇA 42
YÜRÜTÜCÜNÜN ÖZGEÇMİŞİ 48
5
ÇİZELGE LİSTESİ Sayfa
No.
Çizelge 1 Patates üreten ülkelerin 2015, 2016 ve 2017 yıllarındaki üretim miktarları (ton) ve 2017 yılı dünya üretimindeki payı (%)
10
Çizelge 2 Türkiye’de 2016, 2017 ve 2018 yıllarında illere göre patates üretim miktarı (ton) ve üretimdeki payı (%)
11
Çizelge 3 Türkiye’de coğrafi bölgelere göre üretilen patateslerin ekim ve hasat zamanları ile vejetasyon süresi
12
Çizelge 4 In vitro ve in vivo denemelerde kullanılan preparatların aktif madde ve miktarı, ticari adı, firması, formülasyonu ve uygulama dozu (100 kg tohum)
22
Çizelge 5 Patateslerde kuru çürüklük (Fusarium spp.) hastalığı değerlendirme skalası 24
Çizelge 6 PCR Master Mix (2X) protokolü 25
Çizelge 7 PCR çalışmalarında kullanılan Fusarium türlerine ait primerler, baz dizilimi, bant uzunluğu ve PCR programları
26
Çizelge 8 Patateslerde kuru çürüklük (Fusarium spp.) hastalığına karşı reaksiyon değerlendirme skalası
27
Çizelge 9 2015 ve 2016 yıllarında İzmir ili Torbalı ve Ödemiş ilçelerinde bulunan mevkilerden toplanan yumrulara ait örnek toplama tarihleri, depo sayısı ve depolardan toplanan yumru sayıları
29
Çizelge 10 Patojen olarak tespit edilen izolatların elde edildikleri patates çeşidi, izolat numarası ve hastalık oranı (%)
30
Çizelge 11 Çeşit duyarlılık denemelerinde kullanılan patates çeşitleri, duyarlılıkları, ortalama penetrasyon (mm) değerleri ile çoklu karşılaştırma sonucuna göre gruplandırılması
34
Çizelge 12 F. sambucinum izolatı üzerine fungisitlerin ED50 ve MIC değerleri (µg/ml) 35 Çizelge 13 In vivo’da suni inokulasyondan önce yapılan uygulamalar sonucunda preparatların aktif
maddeleri ve patates çeşitlerindeki hastalık oranı (H.O.) ve etkileri (%)
36
Çizelge 14 In vivo’da suni inokulasyondan sonra yapılan uygulamalar sonucunda preparatların aktif maddeleri ve patates çeşitlerindeki hastalık oranı (H.O.) ve etkileri (%)
37
Çizelge 15 In vivo’da suni inokulasyon öncesi ve sonrasında yapılan uygulamalar sonucunda fungisitlerin Lady Olympia çeşidinde hastalık oranı (H.O.) ve etkileri (%)
38
6
ŞEKİL LİSTESİ Sayfa
No.
Şekil 1 Patates kuru çürüklük (Fusarium spp.) hastalığının yaşam döngüsü 13
Şekil 2 Patates kuru çürüklük hastalığının yumrudaki belirtisi 14
Şekil 3 Torbalı (a) ve Ödemiş (b)’te yığın veya çuval şeklinde depolama 15 Şekil 4 Fusarium izolatlarına ait EF-1 ve EF-2 primerleri kullanılarak yürütülen PCR elektroforez
jel görüntüsü
31
Şekil 5 F. oxysporum izolatlarına ait FOF-1 ve FOR-1 primerleri kullanılarak elde edilen PCR elektroforez jel görüntüsü
32
Şekil 6 F. sambucinum izolatlarına ait FSF-1 ve FSR-1 primerleri kullanılarak elde edilen PCR elektroforez jel görüntüsü
32
Şekil 7 F. equiseti izolatlarına ait FEF-1 ve FER-1 primerleri kullanılarak elde edilen PCR elektroforez jel görüntüsü
33
Şekil 8 F. avenaceum izolatlarına ait FAF-1 ve FAR primerleri kullanılarak elde edilen PCR elektroforez jel görüntüsü
33
7
SİMGELER VE KISALTMALAR DİZİNİ
Simgeler Açıklama
Bp Baz pair
°C Santigrad derece
da Dekar
dk Dakika
sn Saniye
DNA Deoksiribonükleik asit
ED50 Miselyal gelişimi %50 engelleyen doz
g Gram
L Ladder
MIC Miselyal gelişimi engelleyen en düşük doz
mm Milimetre
ml Mililitre
µl Mikrolitre
NaOCl Sodyum Hipoklorit
PCR Polimeraz zincir reaksiyonu
PDA Patates dekstroz agar
rpm Dakikada devir sayısı
8
ÖZET
İzmir İlinde Depolanan Patateslerde Kuru Çürüklük Hastalığına Neden Olan Fusarium spp.’nin Tanılanması ve Mücadele Olanaklarının Araştırılması
Patates kuru çürüklük hastalığı (Fusarium spp.) hasat sonrası patates yumrularında görülen en önemli fungal depo çürüklüklerinden biridir. Bu çalışma ile İzmir ili Ödemiş ve Torbalı ilçelerindeki patates depolarında kuru çürüklük hastalığına neden olan Fusarium türlerinin morfolojik ve moleküler yöntemlerle tanılanması amaçlanmıştır. Bu kapsamda 2015-2016 yıllarında patates depolarında yürütülen örnek toplama çalışmaları sonucunda; hastalıklı patates yumrularından elde edilen Fusarium türleri Fusarium sambucinum, F. oxysporum, F. avenaceum ve F. equiseti olarak tanılanmıştır. Patojenisite çalışmaları sonucunda en virülent izolatın F.
sambucinum türüne ait olduğu belirlenmiştir. F. sambucinum’un moleküler olarak tanılanmasında FSF1 ve FSR1 primerleri kullanılarak 315 bp uzunluğunda bant elde edilmiştir. Bölgede yaygın olarak depolanan 13 patates çeşidinin hastalığa duyarlılıklarının tespit edilmesi amacıyla yürütülen çeşit reaksiyon testleri sonucunda en duyarlı çeşit Russet Burbank bulunmuştur. Ülkemizde bu hastalığa karşı ruhsatlı bir bitki koruma ürünü bulunmamaktadır. Hastalıkla mücadele çalışmalarında yürütülen in vitro testlerde 100 g/l fludioxonil, 464 g/l flutolanil, %70 thiophanate methyl, 500 g/l imazalil, 50 g/l fludioxonil+40 g/l sedaxane, 300 g/l fluxapyroxad ve
%20 tolclophos-methyl +%30 thiram’ın patateste kuru çürüklük etmeni F. sambucinum’un miselyal gelişimine etkileri araştırılmıştır. Bu testlerde fludioxonil, fludioxonil+sedaxane ve imazalil etkili maddeli preparatlar patojenin miselyal gelişimini engellemede en etkili fungisitler olmuştur. Patates yumrularında soğuk hava deposunda yürütülen denemelerde in vitro’da hastalık etmenine karşı etkili bulunan kimyasal preparatların yanı sıra biyolojik preparatlardan Bacillus subtilis QST 713 ırkı %1,34 (min.1x109 cfu/ml), Pseudomonas fluorescens strain Pf1 %1,5, 1x108 kob/ml min ve %42 karboksilik asidin etkisi de araştırılmıştır. In vivo denemeler Russet Burbank, Lady Olympia ve Granola çeşitleri ile yürütülmüş, suni inokulasyondan önce ve sonra olmak üzere 2 farklı ilaçlama yapılmıştır. Suni inokulasyondan önce ve sonra yapılan ilaçlamalarda en yüksek etkiyi Granola çeşidinde sırasıyla %77,18 ve %63,53 etki değeri ile 50 g/l fludioxonil+40 g/l sedaxane göstermiştir.
Anahtar Kelimeler: Patates, Kuru Çürüklük, Fusarium spp., Fusarium sambucinum, Fludioxonil
9
SUMMARY
Diagnosis of Fusarium spp. Causing Dry Rot Disease in Stored Potatoes in Izmir Province and Investigation of Control Possibilities
Potato dry rot disease (Fusarium spp.) is one of the most important fungal storage rots on potato tubers after harvesting. The aim of this study was to identify the Fusarium species that cause dry rot disease in potato storages in Ödemiş and Torbalı districts of İzmir province using morphological and molecular methods. In this context, as a result of surveys carried out in potato warehouses in these districts in 2015-2016; Fusarium species obtained from diseased potato tubers were identified as F. sambucinum, F. oxysporum, F. avenaceum and F.
equiseti. F. sambucinum was the most virulent according to the pathogenicity studies. In the molecular diagnosis of Fusarium sambucinum, using primers FSF1 and FSR1, predicted size was obtained 315 bp. To determine the susceptibility to disease, between 13 potato cultivars commonly stored in the region, Russet Burbank was found to be the most sensitive cultivar. There is not any plant protection products against this disease in our country. In vitro tests carried out in disease control studies, 100g/l fludioxonil, 464 g/l flutolanil, %70 thiophanate methyl, 500 g/l imazalil, 50 g/l fludioxonil+40 g/l sedaxane, 300 g/l fluxapyroxad ve %20 tolclophos-methyl +%30 thiram were investigated on the mycelial growth of F. sambucinum, a dry rot pathogen in potato. In these in vitro tests; fludioxonil, fludioxonil+sedaxane and imazalil were the most effective fungicides to prevent mycelial growth of the pathogen. In the experiments carried out in the cold storage of potato tubers, in addition to chemicals that are effective against the disease in in vitro tests, efficacy of Bacillus subtilis QST 713 strain % 1,34 (min.1x109 cfu/ml), Pseudomonas fluorescens strain Pf1 %1,5, 1x108 kob/ml min and %42 carboxylic acid were also tested. In vivo tests were conducted with Russet Burbank, Lady Olympia and Granola cultivars and two different methods were used including before and after artificial inoculation. In the application before and after artificial inoculation, the highest effect was observed on Granola cultivar by 50 g/l fludioxonil+40 g/l sedaxane with an effect value of 77.18% and 63.53%, respectively.
Key words: Potato, Dry rot, Fusarium spp., Fusarium sambucinum, Fludioxonil.
10
1. GİRİŞ
Patates (Solanum tuberosum L.) Solanaceae familyası içerisinde yer alan, dünya nüfusunun beslenmesinde temel gıda kaynakları arasında bulunan önemli bir kültür bitkisidir. Tek yıllık bir kültür bitkisi olan patates, çeşitli iklim bölgelerine kolaylıkla uyum sağlayabildiği için, dünyanın hemen her yerinde başarıyla yetiştirilebilmekte ve besin kaynağı olarak değişik şekillerde kullanılması sebebiyle de insan beslenmesi açısından önemli bir kültür bitkisidir.
Dünyada patates, bitkisel kaynaklı beslenmede buğday, mısır ve pirinçten sonra dördüncü sırada yer almaktadır. İnsan beslenmesinin yanı sıra endüstride de önemli bir gıda maddesi olan patates, gıda endüstrisinde doğrudan tüketildiği gibi, işlenerek de çeşitli kullanım alanlarına sahiptir. Patates; birim alandan alınan verimin ve besin değerinin yüksek olması, kullanım alanının geniş olması ve her çeşit iklimde yetişebilmesi açısından hemen hemen tüm dünya ülkeleri tarafından üretilmekte ve tüketilmektedir. Dünyada toplam patates üretimi yaklaşık 388 milyon ton civarındadır. Dünya patates üretiminin ¼’ü (99.147.000 ton) Çin tarafından gerçekleştirilmektedir. Üretim miktarı bakımından Çin’i sırasıyla Hindistan (48.605.000 ton) ve Rusya (29.589.976 ton) izlemektedir (Anonymous, 2019) (Çizelge 1).
Çizelge 1. Patates üreten ülkelerin 2015, 2016 ve 2017 yıllarındaki üretim miktarları (ton) ve 2017 yılı dünya üretimindeki payı (%) (Anonymous, 2019).
Ülke Patates üretim miktarı (ton) Üretimdeki
payı (%)
2015 2016 2017 2017 (%)
Çin 94 916 682 95 706 650 99 205 580 25,56
Hindistan 48 009 000 43 147 000 48 605 000 12,52
Rusya 33 645 799 31 107 797 29 589 976 7,62
Ukrayna 20 839 270 21 750 290 22 208 220 5,72
ABD 20 012 720 20 022 070 20 017 350 5,16
Almanya 10 370 200 10 772 100 11 720 000 3,02
Bangladeş 9 254 285 9 474 099 10 215 957 2,63
Polonya 6 313 669 8 872 445 9 171 733 2,36
Hollanda 6 651 692 6 534 338 7 391 881 1,90
Fransa 7 119 837 6 834 680 7 342 203 1,89
Belarus 5 995 298 5 984 069 6 414 755 1,65
Birleşik Krallık 5 644 000 5 395 000 6 218 000 1,60
İran 5 140 623 4 995 327 5 102 342 1,31
Türkiye 4 760 000 4 750 000 4 800 000 1,24
Peru 4 704 976 4 514 239 4 776 294 1,23
Cezayir 4 539 577 4 758 137 4 606 403 1,19
Belçika 3 689 994 3 402 787 4 416 665 1,14
Kanada 4 328 423 4 323 524 4 410 829 1,14
Mısır 4 955 445 4 113 441 4 325 478 1,11
Pakistan 3 997 579 3 974 248 4 142 399 1,07
11
Diğer 71 744 646 73 606 484 73 568 190 18,95
Toplam 376 577 033 374 252 075 388 190 675 100,00
Türkiye, dünya patates üretiminde 2018 yılında, 1.359.373 da alan ve 4,55 milyon ton üretim miktarı ile
%1,24’lük pay sahibi olarak 14. sırada yer almıştır (Anonymous, 2019). Türkiye patates üretiminin yaklaşık % 80’i 11 ilimizden karşılanmakta ve patates üretiminin en yoğun olduğu illerin başında Niğde, Konya, Afyon, Kayseri ve İzmir gelmektedir (Çizelge 2).
Çizelge 2. Türkiye’de 2016, 2017 ve 2018 yıllarında illere göre patates üretim miktarı (ton) ve üretimdeki payı (%) (Anonim, 2019a).
İl Patates üretim miktarı (ton) Üretimdeki payı (%)
2016 2017 2018 2018
Niğde 892 297 835 200 732 188 16,09
Konya 549 802 567 076 611 957 13,45
Afyonkarahisar 476 900 473 016 455 352 10,01
Kayseri 305 470 351 270 385 913 8,48
İzmir 367 706 396 130 330 143 7,26
Nevşehir 255 773 249 626 269 620 5,93
Adana 221 397 241 196 219 076 4,81
Aksaray 210 959 207 810 202 371 4,45
Sivas 202 524 182 149 169 737 3,73
Bolu 226 919 164 778 150 327 3,30
Bitlis 163 992 154 696 150 043 3,30
Erzurum 72 173 75 708 85 729 1,88
Hatay 109 961 148 858 71 145 1,56
Tokat 67 902 72 542 61 385 1,35
Diğer 626 225 679 945 655 014 14,40
Toplam 4 750 000 4 800 000 4 550 000 100,00
Patates farklı iklim bölgelerine kolaylıkla adapte olabilmesi nedeniyle, ülkemizin hemen hemen tüm bölgelerinde üretimi yapılmakta ve farklı üretim dönemlerinde yıl boyu üretim gerçekleştirilmektedir (Çizelge 3). Ege, Akdeniz ve Güneydoğu Anadolu bölgelerinde erkenci patates üretimi yapılmakta, diğer bölgelerde ise patates ana ürün olarak yetiştirilmektedir. Hasat ise nisan ayından başlayarak aralık ayı sonuna kadar devam etmektedir. Patates hasadının çok geniş zaman dilimine yayılmış olması, ülkemiz için büyük bir avantaj sağlamaktadır. İzmir ili Ödemiş ilçesinde birinci ekim genellikle şubat ayı içerisinde, birinci hasat ise mayıs- haziran-temmuz ayları arasında yapılmaktadır. İkinci ekim ise 1-15 ağustos arası yapılmaktadır. Ödemiş'in yayla şartlarında (Bozdağ-Gölcük) ise patates mayıs-haziran aylarında ekilmekte, hasat eylül-ekim aylarında yapılmaktadır. Ödemiş'te 1 yıl içerisinde 3 kez taze patates üretimi yapılmaktadır.
12
Çizelge 1. Türkiye’de coğrafi bölgelere göre üretilen patateslerin ekim ve hasat zamanları ile vejetasyon süresi (İşler, N.)
Coğrafi bölgeler Ekim zamanı Hasat Zamanı Vejetasyon süresi
Trakya-Marmara Mart-Nisan Ağustos-Eylül 5-6 ay
Ege İlkbahar Şubat-Nisan Haziran-Temmuz 4-5 ay
Sonbahar Ağustos Aralık-Ocak 4-5 ay
Akdeniz Aralık-Ocak Mayıs-Haziran 4-5 ay
İç Anadolu Nisan-Mayıs Ağustos-Ekim 5-7 ay
Karadeniz Mart-Mayıs Ağustos-Eylül 5-6 ay
Doğu Anadolu Mayıs Eylül 4-5 ay
Güneydoğu Anadolu Mart Haziran 4-5 ay
Ülkemizde patates farklı yöntemlerle depolanmaktadır. Mahzen veya kilerlerde depolama; çok ilkel bir depolama yöntemi olup bu tip depoların temiz, havalanabilir, rutubetsiz ve serin olması gereklidir. Dışarıdan ışık almamalıdır. Toprak silolar; ilkel bir depolama yöntemi olmakla beraber, ülkemizde yer yer kullanılmaktadır.
Her iki depolama yönteminde de depo rutubeti ve sıcaklığı tam olarak kontrol edilemediği için kayıplar meydana gelmektedir. Niğde ve Nevşehir bölgesinde yetiştirilen patateslerin büyük çoğunluğu hasat sonrası volkanik kaya depolar içinde saklanmaktadır. Depo içi sıcaklığı yaklaşık 6°C dolaylarında seyretmekte, depo içi rutubeti ise
%90 dolaylarındadır. Doğal olarak oluşan veya sonradan yapılan bu tip depolar patates yumrularının saklanması için oldukça uygun olup kapı, havalandırma gibi iyileştirmelerle patates yumruları çürümeden ve sürmeden uzunca bir süre saklanabilmektedir. Patates yumrusu, depolama süresi boyunca birkaç fiziksel aşamadan geçer.
Bunlardan; iyileşme periyodunda hasat yaraları iyileştirilir. Soğutma periyodunda yumrular istenilen soğutma sıcaklığına düşürülür ve son olarak yumrular, depolama yapılacak çeşide göre uygun depolama sıcaklığında ve süresinde tutulur. Modern depolarda da yumruları istenilen piyasa koşullarında tutmak için bu üç durumda gerekli olan sıcaklık, nem ve hava debisinin sağlanması amaçlanmıştır. Bu tip depolarda depo şartları kontrol edilebildiği ve yumruların kullanım amaçlarına göre ayarlanabildiği için, yumruda ağırlık ve kalite kaybı minimum düzeye inmektedir (Anonim, 2019c). Patateslerde öngörülen depolama süresi doğal soğutma yapılan depolarda 6 ay, yapay soğutma yapılan depolarda ise 8 aydır. Ancak bu süre çeşide ve iklime göre değişiklik gösterebilir (Altuntaş ve ark, 2011). İzmir ili Torbalı ilçesinde patatesler sıcaklık, nem, havalandırma gibi uygun koşulların sağlandığı modern depolarda depolanırken, Ödemiş ilçesinde ağırlıklı olarak depolama üretici koşullarında, mahzen ya da kilerlerde yapılmaktadır.
Patates besin değeri yönünden olduğu kadar konukçuluk ettiği hastalık etmenleri ve zararlılar bakımından da zengin bir kültür bitkisi olup, ürün miktarını ve kalitesini hastalık etmenleri doğrudan etkilemektedir. Bu hastalık etmenlerinin başında da fungus, bakteri ve virüsler yer almaktadır (Boyd, 1972). Gelişmekte olan ülkelerde hastalık, zararlı ve yabancı otlardan dolayı patates üretiminde %32,4’lük bir kayıp olduğu ve bu kaybın
%21,8’inin hastalıklardan kaynaklandığı belirtilmektedir (Eken et al., 2000). Patates bitkisinin üretim aşamasında olduğu kadar depolama aşamalarında da birçok zararlı etmenden dolayı önemli kayıplar gözlenmekte ve uzun süreli depolamalarda ortam koşullarına ve süreye de bağlı olarak bu kayıplar artmaktadır.
Patateste fungal etmenlerin neden olduğu hastalıklar içinde, oluşturduğu kayıplar göz önüne alındığında da depo hastalıkları önemli bir yer tutmaktadır.
13
Patates depolarında çürüklüğe neden olan en önemli patojenler içinde Phytophthora infestans, Erwinia carotovora subsp. carotovora, E. carotovora subsp. atroseptica, Pythium spp. ve Fusarium spp. sayılabilir. Bu etmenlerden Fusarium türleri ise birçok tarımsal ürün, bahçe bitkileri veya orman bitkilerinde çeşitli hastalıklara sebep olan geniş konukçu dizisine sahip patojenlerdir (Chehri et al., 2011).
Patates kuru çürüklük hastalığı (Fusarium spp.) hasat sonrası patates yumrularında görülen en önemli fungal depo çürüklüklerinden biridir. Kuru çürüklük hastalığı hem depoda yumruları hem de tarlada tohumluk yumru parçalarını ekonomik yönden etkileyen dünya çapında önemli bir hastalıktır. Hastalık verim, tohumluk kalitesi ve ürünün pazarlanabilirliğini azaltmaktadır. Doğrudan ya da dolaylı olarak ürün kayıplarına neden olur.
Yumru enfeksiyonlarının çoğu, dikim, mekanik hasat ve depolamadan önce boyutlara göre sınıflandırma sırasında ortaya çıkan yaralar yoluyla oluşur. Kuru çürüklüğe bağlı ürün kayıplarının tarlada %6-25 arasında olduğu tahmin edilmekte olup, uzun süreli depolamalar sırasında ise bu kayıpların %60’a kadar çıkabildiği bildirilmektedir (Estrada et al., 2010; Secor and Salas, 2001, Stevenson et al., 2001). Patateslerde önemli zarara neden olan bu hastalığa birçok Fusarium türü neden olmaktadır. Hastalık etmeni olan funguslar, tohum ve toprak kökenlidir. Yumruda kuru çürüklüğe neden olan Fusarium spp. genel olarak patates yumrularında ve toprakta çürümüş bitki artıklarında, spor veya miselyum halinde uzun yıllar canlılığını sürdürür (Anonim, 2014). Bu hastalık etmenleri bulaşık tohumluk yumrularla da taşınabilir. Hasat sırasında yaralanan patates yumrularında hastalık depoda ilerler ve bu patatesler çimlenme gücü azaldığından tohumluk olarak kullanıldıklarında ekimden sonra da çürümeye devam ederek çıkış olmamasına neden olur (Şekil 1).
Şekil Error! No text of specified style in document.. Patates kuru çürüklük (Fusarium spp.) hastalığının yaşam döngüsü (Wharton et al., 2007)
14
Hastalık etmeni doğrudan yumruya giriş yapamaz bu nedenle hasat sırasında yumru yaralanmadıkça genellikle hastalık görülmez. Hastalığın gelişimi; toprak, çevre koşulları, hasat-bakım koşulları, çeşitlere ve depolama sıcaklıklarına göre değişiklik gösterir. Enfeksiyon için optimum sıcaklıklar 10-20oC arasındadır, Fusarium spp.’nin çoğu, bu sıcaklık aralıklarında yüksek nem ile birlikte hızla gelişirler (Anonim, 2014).
Depolarda ise kuru çürüklük en hızlı %50-80 bağıl nemde ve 15-28°C sıcaklıkta gelişir. Düşük nem ve sıcaklık değeri, enfeksiyonu ve hastalık gelişimini geciktirir. Hastalık belirtileri hasattan sonra birkaç hafta içinde belirgin bir şekilde ortaya çıkar. Hastalık yumrularda, koyu renkli çökük yüzeysel lekeler şeklinde başlar. Yumru etinde açık kahverengiden siyaha kadar değişen renklerde nekrotik alanlar görülür (Şekil 2). Çürüklük ilerledikçe yumru içinde boşluklar oluşur ve yumru yüzeyi buruşur. Yumru içinde oluşan boşluklarda ve enfekteli alanlar üzerinde etmenin sarı, pembe, beyaz veya mor renkli fungal yapıları gözle görülebilir. Uzun depolanma süresi sonunda hastalık ilerledikçe yumruda tamamen çürüme, buruşma ve mumyalaşma görülür.
G. YIKILMAZSOY G. YIKILMAZSOY
Şekil 1. Patates kuru çürüklük hastalığının yumrudaki belirtisi
İzmir ili Ödemiş ilçesinde 79.999 da alanda 278.638 ton patates üretimi yapılmaktadır (Anonim, 2019a).
Ödemiş ilçesi ilkbahar ve sonbahar olmak üzere 2 farklı dönemde de patates yetiştirilmesi bakımından Ege bölgesi açısından da önemli bir yere sahiptir. Patates hasat dönemleri başlamadan önce de Ödemiş ve Torbalı ilçelerinde patates depolama alanlarında Türkiye’nin farklı il ve ilçelerinden gelen patatesler depolanmaktadır.
Bazı depolarda 12 ay boyunca patates bulunabilmekte ve yıl içerisinde bu sirkülasyon devam etmektedir. Bu ilçelerde bulunan depolar ve depolama alanlarında patatesler yığın veya çuvallar şeklinde depolanmaktadır (Şekil 3). İzmir ili; Türkiye’nin farklı bölgelerinde yetiştirilen ve hasattan sonra depolanmak üzere İzmir’e gönderilen farklı patates çeşitlerinde kuru çürüklük hastalığının depolama alanlarındaki durumlarının incelenebilmesi açısından da önem taşımaktadır. Türkiye’nin farklı illerinde yetiştirilen, depolanmak üzere İzmir’e gönderilen ve bu bölgeden pazara sunulan patateslerde depolama alanlarındaki kuru çürüklüklerden meydana gelen kayıplar ürün miktarını da doğrudan etkileyerek ekonomik kayıplara neden olabilmektedir.
15
Şekil 2. Torbalı (a) ve Ödemiş (b)’te yığın veya çuval şeklinde depolama
Tarım ve Orman Bakanlığı İzmir İl Müdürlüğü tarafından 2014 yılında İzmir ili Ödemiş ilçesinde depo ve kısa süreli saklama alanlarındaki mevcut patateslerin %15-20’sinde kuru çürüklük hastalık etmenine rastlandığı bildirilmiştir. Bunun üzerine Bornova Zirai Mücadele Araştırma Enstitüsü Müdürlüğü konu uzmanları tarafından İzmir ilinde Ödemiş ve Torbalı ilçelerinde bulunan patates depolama alanlarında yapılan surveylerde hastalığın önemli zarara neden olduğu belirlenmiştir. Ülkemizde patateste kuru çürüklük hastalığının mücadelesinde kullanılacak ruhsatlı bir bitki koruma ürünü bulunmamaktadır. Bu nedenle depolarda sorun oluşturan bu hastalığın tanı ve mücadelesi ile ilgili bir çalışma yapılması gereği doğmuştur.
Bu projede, İzmir ili Ödemiş ve Torbalı ilçelerinde bulunan patates depolama ve kısa süreli saklama alanlarından kuru çürüklük hastalığı belirtisi görülen yumru örnekleri alınarak izolasyonlar yapılmıştır. Yapılan izolasyonlar sonucunda elde edilen Fusarium türlerinin morfolojik ve moleküler yöntemler kullanılarak tanılanması amaçlanmıştır. Patojenisite çalışmaları sonucunda saptanan en virulent Fusarium izolatı ile çeşit reaksiyon testleri yürütülmüştür. Bu çalışmalarda, Ödemiş ve Torbalı ilçelerindeki depolama alanlarında yaygın olarak depolanan patates çeşitlerinin etmene duyarlılıklarının belirlenmesi hedeflenmiştir. Hastalıkla mücadele çalışmaları kapsamında yürütülen in vitro testlerde; Türkiye’de ruhsatlı bitki koruma ürünü bulunmayan bu hastalığa karşı farklı kimyasal preparatlar kullanılarak ilaç denemeleri yürütülmüştür. In vivo testlerde ise en virulent izolat ve çeşit duyarlılık çalışmalarında en duyarlı olduğu tespit edilen patates çeşitleri kullanılarak soğuk hava deposunda denemeler kurulmuştur. Bu denemelerde in vitro’da etkili bulunan kimyasal preparatların yanı sıra biyolojik preparatlara da yer verilmiş ve iki farklı ilaçlama yöntemi kullanılarak mücadele olanaklarının araştırılması hedeflenmiştir.
a b
16
2. LİTERATÜR ÖZETİ
2.1. Türkiye’de Yapılan Çalışmalar
Türkiye’de yapılan en kapsamlı çalışmalardan biri, 1981-1983 yılları arasında patatesteki fungal ve bakteriyel hastalıkların tespit edilmesi amacıyla 11 ilde yapılan surveyler olmuştur. Bu surveyler sonucunda; 30 fungus ve 2 bakteri izolatı tanılanmış, virüs haricindeki hastalık etmenlerinin patateste neden olduğu ürün kaybı
%20 olarak belirtilmiştir. Bu kayıplar içerisindeki en önemli yeri %42 ile depo kayıplarının aldığı, mildiyö ve depo kuru çürüklüğünün %20’lik oran ile en çok görülen hastalıklar olduğu belirlenmiştir (Türkensteen and Eraslan, 1985). Aynı araştırmada 6 ilde patates depolarında yapılan surveylerde elde edilen toplam 169 izolatın 163 tanesini Fusarium türleri oluşturmaktadır. Erzurum’dan elde edilen toplam 26 izolatın 25’inin ise Fusarium sambucinum olduğu belirlenmiştir.
Ülkemizde Fusarium türlerinin varlığı üzerine yapılan genel bir çalışmada 55 bitki türünde 31 Fusarium türü saptanmıştır. Patatesten izole edilen Fusarium türlerinin ise bölgelere göre farklılık gösterdiği belirlenmiştir.
F. coeruleum, F. roseum, F. sulphureum Ürgüp ve Nevşehir’de; F. sulphureum, F. solani, F. oxysporum, F.
solani var. coeruleum, F. culmorum, F. sambucinum Bolu’da, F. oxysporum, F. solani Sakarya’da, F.
oxysporum, F. solani, F. proliferatum, F. equiseti ise Ege bölgesinde saptanmıştır (Özer and Soran, 1991).
Erzurum ilinde ise patates ve soğan depolarında yapılan bir çalışmada 16 cinse ait 30 fungus türü tanılanmış ve en yaygın türler arasında, F. moniliforme, F. solanum var. coeruleum, F. sulphureum, F. equiseti, Gliocladium roseum, Penicillium spp., Trichothecium roseum ve Ulocladium botrytis’in yer aldığı belirtilmiştir.
Bu çalışmada patojenisite testleri sonucunda çürümüş patates yumrularının %62,5’inin F. sulphureum izolatlarından kaynaklandığı belirtilmiştir (Gündüz, 1977).
Erzurum’da patates depolarında çürüklük oluşturan fungal etmenleri belirlemek amacıyla yapılan başka bir çalışmada farklı ilçelerdeki patates depolarından alınan yumrulardan yapılan izolasyonlarda 17 fungus cinsi ve bu cinslere ait 25 tür izole edilmiştir. En yaygın funguslar; Fusarium, Rhizoctonia, Helminthosporium, Penicillium ve Doratomyces olarak saptanmıştır. Patojenisite çalışmalarında ise Fusarium sambucinum, F.
solani, F. culmorum, F. oxysporum ve Pythium ultimum’un; Agria, Granola ve Marfona çeşidi patateslerde önemli derecede çürüme meydana getirdiği belirtilmiştir. Erzurum’da Çolakoğlu tarafından yürütülen başka bir çalışmada da; patates ve soğan depolarından 16 cinse ait 46 tür tanılanmış ve en sık rastlananlar Fusarium, Botrytis, Aspergillus, Penicillium, Rhizopus ve Mucor cinsine ait türler olmuştur. Ayrıca patates depolarında görülen en yaygın fungal patojenlerin ise Colletotrichum, Chrysosporium ve Fusarium olduğu belirlenmiştir (Eken et al., 2000).
Fusarium sambucinum ve F. solani, ılıman bölgelerde depolanan patates yumrularında kuru çürüklüğe neden olan yaygın patojenlerdendir. F. sambucinum ve F. solani'nin bu hastalığa duyarlı veya orta derecede dirençli olan patates çeşidi yumrularından hazırlanan doku diskleri üzerine enfeksiyonunun incelendiği bir çalışmada patojenisite testlerinde tüm Fusarium izolatlarının patojen olduğu ve Türkiye’de yetiştirilen 17 patates çeşidinde değişken oranda agresiflik gösterdiği ortaya konmuştur. Test edilen çeşitlerden sadece Broke çeşidi,
17
patojene karşı daha az duyarlılık göstermiştir. F. sambucinum izolatları ise bütün çeşitlerde F. solani'den daha agresif patojen olarak tespit edilmiştir (Aydın and İnal, 2018).
Patateste kuru çürüklüğe sebep olduğu belirlenen Fusarium solani’ye karşı ise potansiyel biyolojik kontrol etmenleri olarak Bacillus, Mikrococcus, Burkholderia, Pseudomonas ve Flavobacter olmak üzere 12 türe ait toplam 22 bakteri straini kullanılarak yürütülen biyolojik mücadele çalışmasında etkili oldukları tespit edilen toplam 12 bakteriyel strain in vivo’da hem Agria hem Granola patates yumrularında denenmiştir. Sonuç olarak 12 bakteri straini in vitro’da F. solani’ye karşı farklı oranlarda etkili bulunurken, in vivo’da Burkholderia sp.’nin hastalığı önlemede kontrole göre önemli derecede etkili olduğu tespit edilmiştir (Kotan ve Şahin, 2002).
Patateste kuru çürüklüğe neden olan Fusarium sambucinum’a karşı Bacillus, Burkholderia ve Pseudomonas bakteri cinslerine dahil 20 izolatın in vitro ve in vivo koşullarda test edildiği bir çalışmada, sadece Burkholderia OSU-7 türü tek başına hastalığı önlemede %95 oranında etkili bulunmuştur (Kotan et al., 1999).
Fusarium sambucinum’un neden olduğu patates kuru çürüklüğünün biyolojik kontrolünde Trichoderma türlerinin etkisinin araştırıldığı bir çalışmada patojenlerin ve antagonistlerin etkileşimi, PDA ortamında ölçülmüştür. In vitro koşullarda, 22-24°C sıcaklıkta 15 Trichoderma izolatı F. sambucinum’a ait 3 izolat üzerinde denenmiş ve sırasıyla T. virens, T. gamsii, T. hamatum, T. asperellum, T. harzianum, T. atroviride en etkili izolatlar olarak bulunmuştur. In vivo testlerde ise T. viride, T. asperellum, T. harzianum, T. virens ve T.
inhamatum en etkili türler olarak bulunmuştur (Aydın, 2019). Söz konusu çalışmada patates yumruları ayrıca fludioxonil SC (100 g/l) ve azoxystrobin SC (250 g/l) adlı ticari tohum fungisitleri ile ilaçlanmış ve sonuçlar, fludioxonil ile ilaçlamaların azoxystrobin uygulaması ve biyolojik kontrol ajanlarına kıyasla daha etkili olduğunu ortaya koymuştur.
2.2. Dünya’da Yapılan Çalışmalar
Patateslerde kuru çürüklük hastalığı ile ilgili yapılan literatür taramalarında dünyada araştırmaların bu hastalığa neden olan Fusarium türlerinin tespit, teşhis ve mücadelesine yönelik olduğu görülmüştür.
Patates kuru çürüklük hastalığının ortaya çıkmasında 2005 yılına kadar yapılan çalışmalarda 13 Fusarium türünün önemli patojenler olduğu belirlenmiştir (Cullen et al., 2005). Fusarium sulphureum Schltd. (=F.
sambucinum Fuckel) Kuzey Amerika ve Avrupa ülkelerinde en önemli patojendir (Hanson et al., 1996; Hide et al., 1992). F. solani (Mart.) İngiltere’de ana patojen olarak belirtilmiştir. Bu türlere ek olarak, F. avenaceum (Fr.) Sacc, F. culmorum (W. G. Sm.), F. oxysporum Schltd., F. acuminatum P.E. Nelson & Toussoun, F.
crookwellense L. W. Burgess, F. equiseti (Corda) Sacc., F. graminearum Schwabe, F. scirpi Lambotte &
Fauterey, F. semitectum (Corda) Sacc, F. lateritium Nees and F. reticulatum Mont. dünyanın değişik bölgelerinden söz konusu hastalığa yol açan patojenler olarak rapor edilmiştir (Theron and Holz, 1991; Cullen et al., 2005; Hanson et al., 1996).
18
Dünyada yapılan çalışmalarda patates yumrularında çürüklüğe yol açan etmenlerin bazılarının Phytophthora infestans, Erwinia caratovora ssp. caratovora, E. caratovora ssp. atroseptica ve Fusarium spp.
olduğu bildirilmektedir (Secor and Salas, 2001; Sadfi et al., 2002). Bunlar içinde Fusarium kuru çürüklüğü, genellikle kuru olan büzülmüş ve çökmüş hastalıklı dokular ile karakterize edilen, dünya çapında ekonomik açıdan önemli bir hastalıktır (Chehri et al., 2011).
Kuru çürüklüğe neden olan patojenlerden F. sambucinum patates yetiştirilen birçok bölgede örneğin;
Amerika’nın kuzeyi, İngiltere ve Fildişi sahilinde patates kuru çürüklük hastalığının ana patojeni olarak bildirilmiştir (Hide and Cayley, 1985; Leach and Webb, 1981).
Fusarium lateritium’un dünya çapında dağılım gösteren ve genellikle odunsu bitkilerde hastalık oluşturan bir etmen olduğu bildirilmiştir (Nelson et al., 1983). Bu türler, tatlı patateslerde ise yaprak klorozuna neden olarak ve toksin üreterek, solgunluğa ve yaprak kaybına yol açar (Clark, 1994). İran’ın Khorasan bölgesinden Rasteghar et al., (2000) bu etmeni patateslerde kuru çürüklük patojeni olarak bildirmişlerdir. Bu tür diğer Fusarium türleriyle karşılaştırıldığında daha düşük virülenslik gösterirken, F. oxysporum ile birlikte bulunduklarında patojenisiteleri önemli ölçüde artmaktadır.
Fusarium oxysporum’un dünyada patates yumrularında çürüklüklere neden olan en önemli türlerden biri olduğu belirtilmektedir (Nelson et al., 1986). Bu türler patates üreten bölgelerin çoğunda, örneğin Hindistan’da, Güney Afrika’da ve Avrupa’da tohumluk patateslerde patates kuru çürüklüğüne yol açan önemli etmenlerdendir (Theron and Holz, 1989).
Tunus’ta depolanmış patateslerde F. roseum’un 3 türü olan, F. roseum var. sambucinum, F. roseum var.
culmorum ve F. roseum var. graminearum’un, en yaygın ve en patojen türler olduğu ortaya konmuştur. Son yıllarda ise F. roseum var. sambucinum’un patateslerde geleneksel ve soğuk depolama süresince görülen en baskın fungus olduğu ve kayıpların temel nedeni olduğu belirlenmiştir (Trabelsi and Chérif, 2009).
Norveç’te 3 yıl süresince farklı üretim bölgelerini ve çeşitleri temsil eden toplam 238 adet patates toplanmıştır. Toplanan örneklerden, her örnekten 1-3 türe ait olmak üzere, %47’sinde Fusarium spp. tespit edilmiştir. En fazla izole edilen tür, toplam Fusarium izolatlarının %59,6’sını oluşturan F. coeruleum olmuştur.
Bunu sırasıyla F. avenaceum (%27,2), F. sambucinum (%6,4) ve F. culmorum (%5,2) takip etmiştir. F.
coeruleum Norveç’in kuzey ve güneybatısındaki en yaygın tür iken, F.avenaceum doğu Norveç'te hakim tür olarak öne çıkmıştır. Bu çalışmada; Norveç izolatlarını başarılı şekilde tanımlayan F. coeruleum için spesifik yeni bir TaqMan real-time PCR yöntemi geliştirilmiştir (Heltoft et al., 2016).
Patates yumrularından izole edilen Fusarium sambucinum’u morfolojik karakterlere dayanarak tanımlamak amacıyla, koloni büyüme çapı, kültürdeki renklenme, makrokonidilerin şekli ve büyüklüğü, mikrokonidi ve klamidospor varlığı araştırılmıştır. Bu çalışmada; makrokonidilerin hilal şeklinde, bel kısmından ince, nispeten kısa ve genellikle boyut olarak tek düze olduğu, apikal hücrenin sivri uçlu, basal hücrenin ise ayak şekilli olduğu, bölme sayısının genellikle 3 ila 6olduğu belirlenmiştir. Mikrokonidilerin ise çok nadir
19
bulundukları, bulunduklarında ise genelde havai misellerde yer aldığı ve oval şekilli olduğu belirlenmiştir (Borca and Puia, 2013).
Tunus’ta 11 patates çeşidinin (Arinda, Atlas, Bellini, Elodie, Fabula, Liseta, Mondial, Nicola, Oceania, Orla, Spunta) kuru çürüklüğe hassasiyetinin denendiği bir çalışmada Fusarium solani, F. oxysporum f. sp.
tuberosi, F. sambucinum ve F. graminearum farklı depolama sıcaklıklarında değerlendirilmiştir. F. sambucinum, test edilen patates çeşitlerinin çoğunda en baskın patojen olmuştur. F. oxysporum f. sp. tuberosi ve F. solani test edilen çeşitlerde nispeten daha az şiddetli kuru çürüklüğe neden olmuştur. Bu çalışmada, F. sambucinum'a duyarlı çeşitlerin çoğu F. oxysporum f.sp.tuberosi'ye toleranslı olarak değerlendirilmiştir.15, 20, 25 ve 30°C'de 21 günlük inkübasyondan sonra, test edilen çeşitlerin hiçbiri Fusarium türlerine karşı tamamen dayanıklı bulunmamıştır (Trabelsi et al., 2012).
Mısır'daki üç bölgeden tipik kuru çürüklük belirtileri gösteren patates yumrularından elde edilen 21 Fusarium spp. izolatı F. sambucinum, F. solani, F. oxysporum ve F. culmorum olarak tanılanmıştır. Bu izolatların Spunta çeşidi sağlıklı patates yumruları üzerindeki patojenisite testleri sonucunda 17 tanesinin patojen ve 4'ünün ise patojen olmadığı belirlenmiştir. Kuru çürüklük hastalık enfeksiyonuna tepkilerini belirlemek için seçilen sekiz çeşit patatesin (Banba, Burren, Slaney, Galactica, Spunta, Valor, Cara, Lady Rosetta) çeşit denemeleri sonucunda aralarında önemli farklılıklar bulunmuştur. Galactica çeşidi en büyük enfeksiyona neden olarak daha duyarlı bulunurken, Valor çeşidinin en az enfeksiyon belirtileri ile hastalığa daha fazla direnç gösterdiği tespit edilmiştir. F. sambucinum ve F. oxysporum, Lady Rosetta ve Valor çeşitleri için F. culmorum ve F. solani ile karşılaştırıldığında daha büyük enfeksiyon lezyonlarına neden olmuştur (Saber et al., 2013).
Kuru çürüklük belirtisi gösteren yumru örneklerinden elde edilen izolatların moleküler yöntemlerle ITS, TEF-1α ve ß-Tubulin genleri kullanılarak Fusarium türleri olarak tanılandığı bir çalışmada; 149 izolat arasında 12 tür tanılanmış ve incelenen bölgelerin hepsinde en fazla bulunan tür, tespit edilen tüm türlerin%45'ini oluşturan 67 izolat ile Fusarium oxysporum olmuştur. Türlerin %12,1’i F. avenaceum, %10,7’si F. solani ve
%7,4’ü ise F. sambucinum olarak saptanmıştır. Bu çalışma ile 149 ITS, 141 TEF-1α ve 144 ß-Tub olmak üzere toplamda 434 patates türevli Fusarium sekansı dizisi NCBI GenBank veritabanında kaydedilmiştir (Stefańczyk and Sobkowiak, 2016).
Tunus’ta 11 patates çeşidinin (Arinda, Atlas, Bellini, Elodie, Fabula, Liseta, Mondial, Nicola, Oceania, Orla, Spunta) kuru çürüklüğe hassasiyetinin denendiği bir çalışmada Fusarium solani, F. oxysporum f. sp.
tuberosi, F. sambucinum ve F. graminearum farklı depolama sıcaklıklarında değerlendirilmiştir. F. sambucinum, test edilen patates çeşitlerinin çoğunda en baskın patojen olmuştur. F. oxysporum f. sp. tuberosi ve F. solani test edilen çeşitlerde nispeten daha az şiddetli kuru çürüklüğe neden olmuştur. Bu çalışmada, F. sambucinum'a duyarlı çeşitlerin çoğu F. oxysporum f.sp. tuberosi'ye toleranslı olarak değerlendirilmiştir. 15, 20, 25 ve 30°C'de 21 günlük inkübasyondan sonra, test edilen çeşitlerin hiçbiri Fusarium türlerine karşı tamamen dayanıklı bulunmamıştır (Trabelsi et al., 2012).
20
İran’da ticari 43 patates çeşidinin, benzer şartlar altında F. sulphureum, F. solani ve F. oxysporum'un neden olduğu kuru çürüklüğe karşı duyarlılığı iki yıl boyunca incelenmiştir. F. sulphureum’un patojenisitesi diğer iki türden daha yüksek çıkmıştır. Saturna çeşidi, test edilen tüm türlere en dayanıklı çeşit olarak belirlenmiştir. Panda, Fregate, Folva ve Arian çeşitleri ise F. solani'ye karşı dayanıklı bulunmuştur. F.
oxysporum en az patojen tür olmasına rağmen, çeşitlerin hemen hemen yarısı bu türe dayanıklı gruba dahil edilmiştir (Esfahani, 2005).
Ticari olarak değerlendirilen patates çeşitlerinin kuru çürüklüğe neden olan Fusarium sulphureum, F.
solani ve F. oxysporum'a karşı patojenisite ve inokulum, inokulasyon yöntemi, sıcaklık, bağıl nem ve ışık gibi benzer koşullar altında duyarlılıklarının değerlendirildiği bir çalışmada; benzer koşullar uygulanmasına rağmen, çeşitlerin hastalığa neden olan türlere karşı farklı direnç seviyelerinde tepki gösterdiği tespit edilmiştir. Bu çalışmada; F. sulphureum en agresif patojen olarak tespit edilirken bunu F. solani izlemiştir. 43 patates çeşidi ile yürütülen patojenisite testlerinde F. sulphureum’a en duyarlı çeşit ‘Seuminar’ çeşidi patates olarak belirlenmiştir (Esfahani, 2011).
Türkiye’de ruhsatlı preparatı bulunmayan patates kuru çürüklük hastalığına karşı yurtdışında ruhsatlı bitki koruma ürünleri bulunmakta ancak bu ürünler hastalığa karşı dayanıklılık kazanmakta ve etkinliklerini kaybetmektedir. Yurtdışında hastalığın mücadelesine yönelik yapılan çalışmalarda; thiabendazole (TBZ) ve imazalil etkili maddeli ve ruhsatlı fungisitler, yumrular depoya konulduktan sonra uygulanmakta ancak bu fungisitlerin devamlı kullanımının, TBZ’ye dayanıklı F. sambucinum ırklarının oluşumuna yol açtığı belirtilmektedir (Kawchuk et al., 1994; Shinners-Carnelley et al., 2003). Bu dayanıklı yumruların hastalıkla bulaşık yumrularla birlikte ekilmesi sonucunda ise TBZ’nin etkisi azalmakta ve daha yaygın kuru çürüklük kayıpları meydana gelmektedir (Hide et al., 1992; Desjardins et al., 1993; Kawchuk et al., 1994; Holley and Kawchuk 1996; Schisler et al., 1997).
Sistemik fungisitlerden carbendazim, benomyl, thiophanate methyl ve triadimefon (100-250-500-1000 ppm) ile sistemik olmayan fungisitlerden methoxyethyl mercury chloride (MEMC), mancozeb, propineb, tetramethyl thiuram disulphide’in (1000-1500-2000-3000 ppm) farklı konsantrasyonlarda patates kuru çürüklüğüne karşı in vitro’da karşılaştırmalı etkinliklerinin denendiği bir çalışmada; sistemik fungisitlerden carbendazim ve benomyl, en düşük konsantrasyon olan 100 ppm’de fungus gelişimini önemli ölçüde sırasıyla
%99,17 ve %99,22 oranında engellemiştir. Sistemik olmayan fungisitlerden MEMC ise fungus gelişimini en düşük konsantrasyon olan 1000 ppm’de %99,20 oranında engellemiştir (Sandipan et al., 2016).
Mısır’da, pazara sunulan ve tohumluk üretimi amacıyla depolarda bulunan patates yumruları üzerinde iki yıl süresince yürütülen surveylerde tipik kuru çürük belirtileri gösteren hastalıklı patates yumrularından 28 fungal izolat elde edilmiştir. İzole edilen funguslar saflaştırılmış ve F. culmorum, F. oxysporum, F. sambucinum, F. semitectum ve F. solani olarak tanılanmıştır. 28 Fusarium izolatından Spunta çeşidi patateslerde yürütülen patojenisite testleri sonucunda 18 izolatın patojen, 10’unun ise patojen olmadığı saptanmıştır. 12 biyoajanın F.
culmorum gelişimi üzerindeki antagonistik etkisini değerlendirmek için in vitro testler yapılmış ve bunlardan, T.
viride-1 ve T. harzianum'un, test edilen F. culmorum izolatının miselyal büyümesinde en yüksek etkiye neden
21
olduğu ortaya konmuştur. İndükleyici direnç kimyasallarından (IRC) olan katekol, kitosan ve salisilik asidin, F.
culmorum miselyal büyümesine karşı inhibe edici etkisini belirlemek için yürütülen in vitro testlerde kitosan ve salisilik asidin, test edilen fungusun miselyal büyümesine karşı bir etkisi olmayan katekolden daha etkili olduğu belirlenmiştir (Ashour et al., 2017).
Hasat sonrası hastalıklarla biyolojik mücadele karmaşıktır. Bu mücadele yöntemleri biyolojik ve çevresel faktörler gibi çeşitli değişkenleri içermektedir. Patates kuru çürüklüğüne neden olan en önemli patojenlerden Fusarium roseum var. sambucinum’a karşı abiyotik ajanlardan; kitin, kitosan, salisilik asit, bion (benzothiadiazol) ve β-aminobutyricacid (BABA)’nın etkilerinin in vitro ve in vivo’da fungal büyüme ve gelişme üzerine etkilerini belirlemek için yapılan bir çalışmada; kitin ve kitosan 400 µg/ml'de ve BABA 30 µg/ml'de, patates yumrularında kuru çürüklük gelişimini etkin bir şekilde engellemiştir. BABA'nın, patates yumrularının geleneksel yöntemlerle 3 ay süresince depolanmasından sonra da etkinliği kanıtlanmıştır. Ayrıca BABA ile antagonistik bakteri Bacillus cereus uygulamasının, F. roseum var. sambucinum ile enfekte olmuş patates yumrularındaki hastalığı, kontrole oranla yaklaşık %70 oranında azalttığı tespit edilmiştir (Trabelsi and Chérif, 2009).
Fungisit ve biyofungisitlerin patateslerde yetiştirme sezonu boyunca tarlada karık usulü ile yaprak uygulamaları ve hasattan sonra depoda yapılacak kombine uygulamaların, patateste kuru çürüklük patojeni olan Fusarium sambucinum’a karşı yumrunun korunmasının arttırılmasında uygun bir mücadele yöntemi olabileceği yapılan çalışmalarla ortaya konmuştur. Tarlada yapraktan mefenoxam, fosforoz asit ve Bacillus subtilis uygulaması ile depoda fosforoz asit, B. subtilis, azoxystrobin, fludioxonil+difenoconazole karışımı fungisit uygulamasının denendiği bir çalışmada deneme iki farklı depolama sıcaklığında (4-10°C) ve iki farklı çeşitte (FL1879, Goldrush) yürütülmüştür. Sonuç olarak; B. subtilis veya mefenoxam ile tarlada yapılan uygulamayı takiben depoda B. subtilis, azoxystrobin, fludioxonil+difenoconazole karışımı fungisit veya fosforoz asit ile yapılan ilaçlamaların patateslerde kuru çürüklük etkisini azalttığı ortaya konmuştur (Kirk et al., 2013).
Trichoderma harzianum izolatının, kuru çürüklüğe neden olan Fusarium solani izolatlarına karşı biyolojik kontrol potansiyelini araştırmak için yapılan bir çalışmada, İran’ın kuzeyindeki Horasan eyaletinde depolarda hastalık belirtisi görülen yumrulardan izole edilen toplam 135 Fusarium izolatının 84’ü F. solani olarak tanılanmıştır. T. harzianum'un F. solani izolatı üzerindeki etkileri hem ikili kültür analizinde testlenmiş, hem de uçucu metabolit analizlerinde F. solani izolatına karşı etkili bir biyolojik kontrol başarısı göstermiştir. T.
harzianum ile ve tek başına F. solani ile gelişen kültürler arasında fungal koloni çapında önemli farklılıklar tespit edilmiştir. T. harzianum tarafından salınan uçucu metabolitlere maruz bırakılan F. solani kültürlerinde, kontrole kıyasla daha düşük bir miselyal büyüme gözlenmiştir. Bu yöntem; yaygın olarak kullanılan fungisitlere oranla doğal ve sağlıklı bir alternatif olarak teyit edilmektedir (Eshghi et al., 2015).
Azoxystrobin, imazalil, thiabendazole, azoxystrobin+difenoconazole ve fludioxonil+difenoconazole aktif maddelerini içeren beş fungisit, İran’ın Mashhad bölgesinde patateslerde kuru çürüklüğe neden olan iki Fusarium solani ve iki F. oxysporum izolatına karşı denenmiştir. PDA ortamına eklenen fungisitler, 7 gün boyunca 25°C'de inkübe edilen tüm Fusarium izolatlarının miselyal büyümesini önemli ölçüde engellemiştir;
22
ancak sadece en düşük konsantrasyonlarında imazalil (40 ppm) ve thiabendazole (5 ppm), testlenen tüm fungal izolatların miselyal gelişimini engellemiştir. Azoxystrobin, azoxystrobin+difenoconazole ve fludioxonil+difenoconazole, testlenen tüm Fusarium izolatlarının miselyal büyümesini, kontrole oranla %45'ten fazla engellemiş, ancak fludioxonil+ difenoconazole, özellikle 10 ppm'de daha iyi bir etki göstermiştir (Vatankhah et al., 2019).
3. MATERYAL VE METOT 3.1. Materyal
Çalışmanın ana materyalini İzmir ili Ödemiş ve Torbalı ilçelerindeki patates depolarından toplanan hastalık belirtisi gözlenen patates yumruları ve bu yumrulardan yapılan izolasyonlardan elde edilen Fusarium spp. izolatları oluşturmuştur. İzolasyon, tanılama ve patojenisite çalışmalarında kullanılan tüm besi ortamları (Potato Dextrose Agar, Water Agar, Carnation Leaf Agar), laboratuvar malzemeleri, mikroskop, inkübatör, buzdolabı, çalışmanın diğer materyallerini oluşturmuştur.
Çeşit denemelerinde bölgede yaygın olarak depolanan Melody, Marabel, Granola, Madalay, Van Gogh, Laura, Desiree, Lady Anna, Lady Amarilla, Alegria, Triplo, Lady Olympia ve Russet Burbank patates çeşitleri kullanılmıştır.
Moleküler çalışmalarda DNA ekstraksiyonu için; Thermo marka DNA izolasyon kitleri, ayarlanabilir mikropipetler, pipet uçları, eppendorf tüpler, vortex cihazı, Sigma marka santrifüj kullanılmıştır. PCR çalışmalarında ise; Thermo PCR Master Mix ve çözeltiler, ultra saf su, PCR tüpleri, ayarlanabilir mikropipetler ve pipet uçları, Eppendorf marka thermocycler, Fusarium türlerine spesifik primerler, jel elektroforez düzeneği, örneklerin ve jellerin hazırlanması ve boyanmasında kullanılan kimyasallar, çözeltiler, derin dondurucu, 6x loading buffer, DNA ladder materyal olarak kullanılmıştır. Tüm jellerin fotoğrafları ETX-20.M marka jel görüntüleme cihazında çekilmiştir.
Hastalıkla mücadele çalışmalarında in vitro ve in vivo denemelerde kullanılan preparatlar Çizelge 4’de yer almaktadır. Çeşit denemeleri ve hastalıkla mücadele çalışmaları kapsamında kullanılan patateslerin depolanması için kurumumuzda bulunan soğuk hava deposu kullanılmıştır.
Çizelge 4. In vitro ve in vivo denemelerde kullanılan preparatların aktif madde ve miktarı, ticari adı, firması, formülasyonu ve uygulama dozu (100 kg tohum)
Aktif madde ve miktarı Ticari adı-Firması Formülasyon Uygulama dozu (100 kg tohum) 100g/l Fludioxonil Celest Max 100 FS-
Syngenta FS 20 ml
464 g/l Flutolanil Moncut 40-AMC-TR SC 17,5 ml
%70 Thiophanate methyl Sumitop WP-SumiAgro WP 60 g/100 l su 500 g/l Imazalil Bestnate 50 EC-Agrobest EC 30 ml/100 l su 50g/l Fludioxonil+40g/l
Sedaxane
Vibrance Premium-
Syngenta EC 50 ml
23
300 g/l Fluxapyroxad Sercadis-BASF SC 20 ml
%20 Tolclophos-methyl +%30 Thiram
Rizolex-T 50 WP-
Sumiagro WP 40 g
Bacillus subtilis QST 713 ırkı %
1,34 (min.1x109 cfu/ml) Serenade-Bayer SC 300 ml
Pseudomonas fluorescens strain
Pf1 %1,5, 1x108 kob/ml min Cedriks-Agrobest SL 500 ml
%42 Carboxylic acid Supa Link-Hektaş - 200 ml/100 l su
3.2. Metot
3.2.1. Örnek Toplama Çalışmaları
Örnek toplama çalışmaları 2015-2016 yıllarında İzmir ili Ödemiş ve Torbalı ilçelerinde bulunan depolama alanlarında hastalık belirtisi gözlenen patates yumrularından yapılmıştır. Örnekleme söz konusu ilçelerde, ilkbahar ve sonbahar olmak üzere 2 farklı üretim dönemi sonunda yapılmıştır. Hastalıklı patates yumruları, hasat sonrasında depolama alanlarında yapılan yığınlardan veya çuvallardan çeşit isimleri, depolanma tarihleri ve örnek alım tarihleri kaydedilerek toplanmıştır. Örnekler depolardan güdümlü örnekleme metoduna (Bora ve Karaca, 1970) göre alınmış ve hastalık belirtisi görülen yumrular önce kese kağıdına daha sonra polietilen torbalar içine konularak buz kutusu içinde laboratuvara getirilmiştir. Örnekler izolasyon yapılana kadar +4°C sıcaklıktaki buzdolabında muhafaza edilmiştir.
3.2.2. İzolasyon Çalışmaları
Laboratuvara getirilen hastalıklı patates yumruları, öncelikle topraklarından arındırılmak amacıyla musluk suyu altında temizlendikten sonra, steril bir bistüri yardımıyla hasta ve sağlam dokuyu içerecek şekilde kesilen 4-5 mm büyüklüğündeki parçalar yüzey sterilizasyonu için %1’lik sodyum hipoklorit (NaOCl) solüsyonunda 3 dakika bekletilmiş, daha sonra 2 kez steril saf sudan geçirilerek kurutma kağıtları arasında kurutulmuştur. Kurutulan parçalar PDA içeren petrilere, her petriye 3-4 adet yerleştirildikten sonra 22±2°C’de yaklaşık 7 gün süreyle inkübe edilmiştir (Ciesniewska et al., 2015). İnkübasyon süresi sonunda petrilerde gelişen funguslar PDA ortamlarına alınarak saflaştırılmış, elde edilen izolatlara ait saf kültürler eğik agar içeren tüplere alınarak sonraki çalışmalarda kullanılmak üzere +4°C’de saklanmıştır (Nirenberg, 1976).
3.2.3. Patojenisite testleri ve virülenslik düzeylerinin belirlenmesi
Patojenisite testleri sağlıklı patates yumruları kullanılarak yürütülmüştür. Bu testlerde her izolat için yaklaşık 100-120 g ağırlığındaki 5 yumru kullanılmış ve deneme, tesadüf parselleri deneme desenine göre 3 tekerrürlü olarak yürütülmüştür. Bu denemelerde öncelikle yumrular topraklarından arındırılması için musluk suyu altında yıkanmıştır. Daha sonra %0,5’lik sodyum hipokloritte 10 dakika süreyle tutulmuş ve 3 kez steril saf sudan geçirilerek kurutulmuştur (Lui and Kushalappa, 2002; Lui et al., 2005). Kurutulan yumruların üzerinde cork borer (mantar delici) ile 4 mm çapında ve 4 mm derinliğinde yara açılarak, PDA içeren besiyerinde gelişen ve taze Fusarium miselleri içeren agar blokları bu kısımlara inokule edilmiştir (Choiseul et al., 2007; Peters et al., 2008). Kontrol olarak kullanılan yumrulara temiz agar blokları yerleştirilmiştir. Yaralı kısımlar parafilmle sarılmış ve uygulama yapılan yumrular siyah polietilen poşetler içinde 3 hafta süreyle 20°C’de karanlıkta yığın
24
şeklinde depolanmıştır (Manici and Cerato, 1994; Lui and Kushalappa, 2002). Bu depolama süresinden sonra hastalık şiddetini değerlendirirken; yumrular yaralı kısım üzerinden ikiye kesilmiş ve patates kuru çürüklük hastalığı değerlendirme skalası (Çizelge 5)’na göre değerlendirme yapılmıştır.
Çizelge 5. Patateslerde kuru çürüklük (Fusarium spp.) hastalığı değerlendirme skalası (Anonim, 2014)
Skala değeri Tanım
0 Enfeksiyon yok (doğal ve yapay bulaşık yumrularda)
1 % 1-20 enfekteli doku
2 % 21-40 enfekteli doku
3 % 41-60 enfekteli doku
4 % 61-80 enfekteli doku
5 % 81 üzeri veya yumrunun tamamı hastalanmış
Bu skalaya göre yapılan değerlendirmelerle, patojenisite testleri sonucunda patojen çıkan izolatların yumrularda hastalık oluşturma şiddeti Index formülü ile hesaplanmıştır (Karman, 1971). Ayrıca izolatların patojenisitelerini doğrulamak için, inokulasyon yapılan yumrulardan reizolasyonlar yapılmıştır. Patojenisite testleri sonucu belirlenen en virulent Fusarium izolatı, çeşit duyarlılık testleri ve hastalıkla mücadele çalışmalarında fungal materyal olarak kullanılmıştır.
3.2.4. Tanılama çalışmaları
3.2.4.1 Morfolojik karakteristiklerine göre tanılama
İzolasyon çalışmaları ve patojenisite testleri sonucunda elde edilen Fusarium türlerine ait izolatların morfolojik olarak koloni rengi ve gelişimleri, mikroskobik olarak phialide tipleri, klamidospor varlığı, makrokonidi formu, mikrokonidi varlığına göre ayrımları Fusarium teşhis anahtarlarından yararlanılarak yapılmıştır (Gerlach and Nirenberg, 1982; Nelson et al., 1983; Leslie and Summerell, 2006). Morfolojik tanılama çalışmalarını doğrulamak amacıyla, moleküler yöntemler kullanılarak tanılama çalışmaları yürütülmüştür.
3.2.4.2 Moleküler yöntemler kullanılarak tanılama
İzolatların moleküler yöntemler kullanılarak tanılanması için 22±2°C’de, PDA ortamında 5-7 gün süre ile geliştirilen fungal kültürlerden steril bistüri ile fungal miselyum alınarak 1,5 ml’lik eppendorf tüplere aktarılmış ve Thermo Scientific GeneJet Plant Genomic DNA Purification MiniKit protokolüne uygun olarak DNA ekstraksiyonları yapılmıştır.
25
DNA İzolasyonu:
GeneJet Plant Genomic DNA Purification MiniKit protokolü aşağıda yer aldığı şekilde yürütülmüştür:
1,5 ml eppendorf tüpe alınan yaklaşık 100 mg miselyum üzerine 350 µl Lysis Buffer A eklenmiştir. 10-20 sn iyice karışıncaya kadar vortekslenmiştir. Karışan sıvı üzerine 50 µl Lysis Buffer B ve 20 µl RNase A eklenmiş ve 1 dakika vorteks işlemi yapılmıştır. Örnek 65°C’de 10 dakika süre ile (ara sıra vortekslenerek) sıcak su banyosunda inkübe edilmiştir. Belirtilen süre sonunda tüplere 130 µl Precipitation Solution eklenmiş, tüp 2-3 kere ters çevirilerek karıştırılmış ve 5 dakika buzda inkübasyona bırakılmıştır. Daha sonra 5 dk. ≥ 20,000 × g (≥14000 rpm)’de santrifüj edilmiştir. Üstte kalan sıvı kısım (450-550 µl) temiz bir mikrosantrifüj tüpüne aktarılmış, üzerine 400 µl Plant gDNA Binding Solution ve 400 µl %96’lık ethanol eklenerek iyice karıştırılmıştır. Hazırlanan karışımın yarısı (600-700 µl) spin column tüpüne aktarılmış ve 1 dakika 6,000 × g (~8,000 rpm)’de santrifüj edilmiştir. Bu süre sonunda alttaki tüpte kalan kısım atılarak karışımın kalan kısmı aynı tüpe aktarılmış ve 1 dk. 6,000 × g (~8,000 rpm)’de santrifüj edilmiştir. Bu sürenin sonunda altta biriken sıvı atılıp spin column’a 500 µl Wash Buffer I (30 ml %96’lık ethanol eklenen) eklenmiş ve 1 dakika 8,000 × g (~10,000 rpm)’de santrifüj edilerek, altta kalan kısım atılmıştır. Daha sonra aynı tüpe 500 µl Wash Buffer II (30 ml %96’lık ethanol eklenen) eklenmiş, 3 dakika ≥20,000 × g (≥14,000 rpm) maksimum hızda santrifüj edilmiştir. Bu süre sonunda altta biriken sıvı atılarak spin column tüpü temiz bir mikrosantrifüj tüpüne yerleştirilmiş, genomik DNA’yı elde etmek için 100 µl Elution Buffer eklenmiş ve 1 dakika 8,000 × g (~10,000 rpm)’de santrifüj edilmiştir.
DNA izolasyonu çalışmalarında elde edilen örnekler ve türe spesifik primerler kullanılarak PCR amplifikasyonları gerçekleştirilmiştir (Mishra et al., 2003). PCR uygulamasında PCR Master Mix (Thermo Scientific, USA) (2x) protokolü kullanılmıştır. Her PCR uygulaması için toplam 25 µl’lik hacimde reaksiyon karışımı hazırlanmıştır (Çizelge 6).
Çizelge 6. PCR Master Mix (2x) protokolü.
Her bir örnek için
PCR Master Mix (2x) 12,5 µl
Forward primer 1 µl
Reverse primer 1 µl
DNA 1 µl
Nuclease Free Water 9,5 µl
Toplam 25 µl
26
PCR çalışmalarında TEF-1α ve türe spesifik primerler kullanılarak hazırlanan reaksiyon karışımını içeren PCR tüpleri thermal cycler cihazına yerleştirilmiş ve PCR programlarına göre yürütülmüştür (Çizelge 7).
Çizelge 7. PCR çalışmalarında kullanılan Fusarium türlerine ait primerler, baz dizilimi, bant uzunluğu ve PCR programları
Fusarium
türleri Primer Baz dizilimi (5’, 3’)
Bant uzunluğu
(bp)
PCR programı Referans
TEF-1α EF1-F EF2-R
ATG GGT AAG GAR GAC AAG AC
GGA RGT ACC AGT SAT CAT GTT 650-700
94°C’de 85 saniye 95°C’de 30 saniye
58°C’de 55 saniye 33 döngü 72°C’de 2 dakika
72°C’de 10 dakika
Du et al., 2012
F.
culmorum
175F 430R
TTTTAGTGGAACTTCTGAGTAT
AGTGCAGCAGGACTGCAGC 245
94°C’de 1 dakika 94°C’de 1 dakika
58°C’de 30 saniye 25 döngü 72°C’de 1 dakika
72°C’de 7dakika
Mishra et al., 2003 F.
sambucinum
FSF1 FSR1
ACATACCTTTATGTTGCCTCG
GGAGTGTCAGACGACAGCT 315
F.
oxysporum
FOF1 FOR1
ACATACCACTTGTTGCCTCG
CGCCAATCAATTTGAGGAACG 340
F. equiseti FEF1 FER1
CATACCTATACGTTGCCTCG
TTACCAGTAACGAGGTGTATG 389
F.
avenaceum
FAF1 FAR
AACATACCTTAATGTTGCCTCGG
ATCCCCAACACCAAACCCGAG 314
F.
acuminatum
FAC-F FAC-R
GGGATATCGGGCCTCA
GGGATATCGGCAAGATCG 600
95ºC’de 5 dakika 94ºC’de 50 saniye
56ºC’de 50 saniye 35 döngü 72ºC’de 1 dakika
72ºC’de 7 dakika
Williams et al., 2002
F.
graminearum
Fg16F Fg16R
CTCCGGATATGTTGCGTCAA
GGTAGGTATCCGACATGGCAA 420-520
95ºC’de 5 dakika 94ºC’de 50 saniye
56ºC’de 50 saniye 35 döngü 72ºC’de 1 dakika
72ºC’de 7 dakika
Nicholson et al.,1998
Çizelge 7’ye göre hazırlanarak elde edilen PCR ürünleri %1,5 agaroz jelde, SYBR® Safe DNA gel stain (Invitrogen) eklenmiş TAE buffer içinde, 100 V’ta 1 saat elektroforezde yürütülmüş ve daha sonra UV ışık altında görüntülenmiştir. Elde edilen PCR ürünleri sekansa gönderilmiş, DNA sekansları BLAST analizi yardımıyla kontrol edilmiş ve veri tabanında mevcut olan türlerle benzerlik oranlarına bakılmıştır.
3.2.5 Çeşit duyarlılık seviyesinin belirlenmesi
Ödemiş ve Torbalı ilçelerinde yaygın olarak depolanan patates çeşitlerinin kuru çürüklük hastalığına olan duyarlılıklarını belirlemek amacıyla yürütülen çalışmalarda; tanılama çalışmaları ve patojenisite testleri sonucunda belirlenen Fusarium sambucinum izolatı kullanılmıştır. Deneme; tesadüf parselleri deneme desenine göre 3 tekerrürlü olarak yürütülmüş, her tekerrürde ve kontrolde 10’ar adet yumru kullanılmıştır. Bu çalışmalarda; Fusarium sambucinum izolatı; çeşit reaksiyonu çalışmalarında kullanılmak üzere PDA içeren petrilerde 24°C’de geliştirilmiştir. Gelişen kültürler saf su içeren bir erlene aktarılmış ve 30 dk. çalkalayıcıda karıştırılmıştır. Elde edilen süspansiyon süzülerek besi yerinden kalan parçalar uzaklaştırılmış ve spor süspansiyonu en az 5x104 spor/ml olacak şekilde ayarlanmıştır (Anonim, 2019b).Yumrular ise inokulasyon için
