Moleküler Yöntemler Kullanılarak Tanılama

(%39,02), 11’i F. oxysporum (%26,82), 8’i F. avenaceum (%19,51) ve 6’sı F. equiseti (%14,63) olarak tanılanmıştır.

Fusarium sambucinum Fuckel: PDA’da gelişimi hızlı, yüne benzer, açık turuncu, somon, kızılımsı-kahverengi renklerde, havai misellere sahiptir. Yalnızca makrokonidial forma sahip tek tür konidium oluşturur.

Konidiumlar kavisli, mızrak şeklinde ve sivri bir tepe noktasına sahiptir. Genellikle 3-5 bölmelidir. F.

sambucinum enfeksiyon başlangıcında yumru içinde koyu kahverengi-siyah renkte tüneller açar. Yumru enfeksiyonunun sıcaklık gereksinimi F. sambucinum için 12-30°C’dir.

Fusarium oxysporum Schltdl: PDA ortamında miselyum bol, kültürde beyazdan soluk menekşe, koyu menekşe renk aralığındadır. Makrokonidilerin genel görünümü kısa-orta uzunlukta, düz-hafif kavisli-orak şekilli, ince, ince duvarlı ve düz yapıya sahiptir. Kavisli bir apikal hücre ve ayak şekilli, sivri uçlu bir bazal hücreye sahiptir. Genellikle 3-4 bölmelidir. Kısa phialidelere sahiptir ve havai misellerde bol miktarda bulunur.

Klamidosporlar genellikle tek başlarına veya çiftler halinde oluşur.

Fusarium avenaceum (Fr.) Sacc.: PDA’da gelişimi hızlı, havai miselyumlar yoğundur, çoğunlukla pembe-ten rengi ve kırmızımsı kahverengi arasındadır. Koloni alt yüzeyi parlak renkli kırmızıdan koyu kahverengiye değişebilir. Makrokonidiler oldukça uzun, ince, ince duvarlı, apikal hücre uzunlamasına ve bükülmüş olabilir (Şekil 4.4). Bazal hücre ise ayak şekilli ve çentiklidir. Mikrokonidiler genellikle seyrek bulunur. Klamidospor bulunmaz.

Fusarium equiseti (Corda) Sacc.: Basit phialidelere sahip, kültüre alındığında PDA’da başlangıçta beyaz, kültür yaşlandıkça taba renginden kahverengiye dönen yoğun havai miseller ile gelişimi hızlıdır. Kırmızı, mavi veya menekşe renkli pigmentasyon gözlenmez. PDA’da miselyum bol, başlangıçta beyaz, fakat yaşlandıkça kahverengi olabilir. Koloninin agarla temas ettiği yerde kahverengi-koyu kahverengi renklenme oluşur.

Makrokonidiler bölmeli, kalın duvarlı, orak şekilli ve bol miktarda bulunur. Karın kısmı düzgün, pürüzsüz ancak sırt kısmı daha fazla kavislidir. Uzun ve ince makrokonidiler tipik dorsiventral eğriliğe sahiptir. Apikal hücre konik ve uzun, kamçı benzeri, bazal hücre uzamış görünümde olan belirgin ayak şeklindedir. Genellikle 5-7 bölmelidir. Mikrokonidiler havai misellerde bulunabilir, oval şekillidir. Klamidosporlar belirgin kalınlıkta, pürüzlü duvarlara sahip, kümeler halinde, eklenmiş ve bol miktarda bulunur.

4.4 Moleküler Yöntemler Kullanılarak Tanılama

Morfolojik ve mikroskobik özellikleri dikkate alınarak tanısı gerçekleştirilen Fusarium türlerinin Thermo DNA izolasyon kiti protokolüne göre DNA izolasyonları yapılmış ve elde edilen DNA örneklerinin PCR Master Mix (Thermo Fisher Scientific) protokolüne uygun olarak PCR çalışmaları yürütülmüştür. Fusarium türlerinin EF-1 (ATG GGT AAG GAR GAC AAG AC) ve EF-2 (GGA RGT ACC AGT SAT CAT GTT) primerleri kullanılarak TEF-1α geni analizi ile tanılanması amaçlanmıştır (O’Donnell et al., 1998).

32

L: 100 bp’lik ladder, N: su kontrol, 1-12: (1.5.4, 1.6.2, 2.7.3, 1.13.3, 4.5.3, 1.5.1, 1.1.3, 3.5.3, 14, 1.7.5, 4.12.7, 3.9.4)

Şekil 4. Fusarium izolatlarına ait EF-1 ve EF-2 primerleri kullanılarak yürütülen PCR elektroforez jel görüntüsü

Şekil 4’e göre Fusarium türlerinde EF-1 ve EF-2 primerleri ile 650 bp uzunluğunda bant elde edilmiştir.

Morfolojik özelliklerine göre farklılık gösteren izolatlara ait DNA örnekleri ile türe spesifik primerler kullanılarak PCR çalışmaları yürütülmüştür.

Buna göre; Fusarium oxysporum yönüyle testlenmiş izolatlardan FOF1 (ACA TAC CAC TTG TTG CCT CG) ve FOR1 (CGC CAA TCA ATT TGA GGA ACG) primerleri kullanılarak ~340 bp uzunluğunda bant elde edilmiştir (Şekil 5). Elde edilen PCR ürünleri sekansa gönderilmiş, DNA sekansları BLAST analizi yardımıyla kontrol edilmiş ve veri tabanında mevcut olan türlerle benzerlik oranlarına bakılmıştır. Fusarium oxysporum türüne ait izolatlar Blast analizi sonucunda veri tabanına kayıtlı MH171926.1, MK595325.1, KY082687.1, MG020429.1, MH171940.1, MN653388.1, MN658644.1, KY910850.1, KU556099.1, KU556136.1 ve MN709614.1 nolu F. oxysporum türleri ile %98,47-100 oranında benzerlik göstermiştir.

L: 100 bp’lik ladder, 1-6: (1.4.5, 4.9.5, 4.12.4, 3.5.4, 1.5.7, 1.5.2 )

Şekil 5. F. oxysporum izolatlarına ait FOF-1 ve FOR-1 primerleri kullanılarak elde edilen PCR elektroforez jel görüntüsü

Fusarium sambucinum’a ait FSF1 (ACA TAC CTT TAT GTT GCC TCG) ve FSR1 (GGA GTG TCA GAC GAC AGC T) primerleri kullanılarak 315 bp uzunluğunda bant elde edilmiştir (Şekil 6). Fusarium sambucinum türüne ait izolatlar Blast analizi sonucunda veri tabanına kayıtlı MN429186.1, KP710619.1,

650 bp

340 bp

340 bp

33

KC899119.1, KT224127.1, KP710613.1, MK968310.1 ve KP400719.1 nolu F. sambucinum türleri ile

%96,16-%100 oranında benzerlik göstermiştir.

L: 100 bp’lik ladder, N: su kontrol, 1-6: (2.10.3, 1.2.8, 3.25, 3.6.4, 1.13.4, 13)

Şekil 6. F. sambucinum izolatlarına ait FSF-1 ve FSR-1 primerleri kullanılarak elde edilen PCR elektroforez jel görüntüsü

Fusarium equiseti’ye ait FEF1 (CAT ACC TAT ACG TTG CCT CG) ve FER1 (TTA CCA GTA ACG AGG TGT ATG) primerleri kullanılarak 390 bp uzunluğunda bant elde edilmiştir (Şekil 7). Fusarium equiseti türüne ait izolatlar Blast analizi sonucunda veri tabanına kayıtlı KU891589.1 ve MH161273.1 nolu F. equiseti türleri ile %98,56-%99,70 oranında benzerlik göstermiştir.

L: 100 bp’lik ladder, N: su kontrol, 1-3: (21, 1.2.7, 2.8.3)

Şekil 7. F. equiseti izolatlarına ait FEF-1 ve FER-1 primerleri kullanılarak elde edilen PCR elektroforez jel görüntüsü

Fusarium avenaceum’a ait FAF1 (AAC ATA CCT TAA TGT TGC CTC GG) ve FAR (ATC CCC AAC ACC AAA CCC GAG) yönüyle testlenen izolatlardan 314 bp uzunluğunda bant elde edilmiştir (Şekil 8).

Fusarium avenaceum türüne ait izolatlar Blast analizi sonucunda veri tabanına kayıtlı MK271268.1 ve MK271266.1 nolu F. equiseti türleri ile %99,16-100 oranında benzerlik göstermiştir.

315 bp

L N 1 2 3 L

L N 1 2 3 4 L

390 bp

34

L: 100 bp’lik ladder, N: su kontrol, 1-4: (23, 4.2.4, 1.14.1, 4.2.5)

Şekil 8. F. avenaceum izolatlarına ait FAF-1 ve FAR primerleri kullanılarak elde edilen PCR elektroforez jel görüntüsü

Genel olarak bakıldığında Fusarium türlerinin benzerlik oranları %96,16-100 arasında dağılım göstermiştir. Fusarium sambucinum türüne ait 3.25 numaralı izolat Blast analizi sonucunda veri tabanına kayıtlı MN429186.1 nolu tür ile %100 benzerlik göstermiştir. Bu izolat patojenisite testlerinde en yüksek hastalık şiddetine sahip olması nedeniyle çeşit duyarlılık çalışmaları ile hastalıkla mücadele çalışmalarında kullanılmıştır.