Sinaptik Vezikül Ekzositozu

Sinaptik Vezikül Ekzositozu

Doç. Dr. Güvem Gümüş Akay

Ank. Üniv. Disiplinlerarası Sinirbilim Doktora Programı/

Sinapsların Moleküler Nörobiyolojisi

Sinaptik Veziküller

• NT salınımında merkezi rol oynayan ~ 40nm çapındaki organellerdir.

• Her presinaptik aksonal buton NT ile

doldurulmuş yüzlerce sinaptik vezikül içerir.

Ekzositoz sırasında

• Aksiyon potansiyeli presinaptik membranı depolarize ettiği zaman Ca²⁺ kanalları açılır

• Ca²⁺ nöron içerisine doğru giriş yapar

• İçeri giren Ca²⁺ , sinaptik vezikül ekzositozunu tetikleyerek NT’lerin sinaptik yarığa salınmasına neden olur.

• Bu tetikleme Ca²⁺‘un sinaptotagmin’e bağlanması ile gerçekleşir.

Ekzositozdan sonra

• Veziküller endozitozla hücre içerisine alınır ve

geridöşüme uğratılarak tekrar NT ile doldurulurlar.

Vezikül Geridönüşümü

• Çok sayıda paralel yolakla meydana gelebilir:

• «Kiss-and-Run»

• «Kiss-and-Stay»

• «Endozomal aracılı»

Sinaptik Veziküler

• Küçük hacimleri nedeni ile sınırlı sayıda protein içeriğine sahiptirler.

• Vezikül bileşenlerinin tam olarak fonksiyonları

aydınlatılmayı beklemekle birlikte, pekçok vezikül bileşeni 3 temel işleve sahiptir.

1. NT’lerin alınması ve depolanması 2. Vezikül ekzositozu

3. Vezikül endositozu ve geridönüşümü

• Vezikül bileşenlerinin, vezikül biyogenezinde de rol oynadığı düşünülmekle birlikte; veziküllerin nasıl yapıldığı ve büyüklüklerini neyin belirlediği tam olarak net değil.

Membran Füzyonu

• Ökaryotik hücreler için evrensel bir süreçtir.

• Membranöz organellerin oluşturulması ve füzyonu yaşamsal pekçok sürecin temelini oluşturur.

• Hücrelerin kompartmanlar şeklinde organize

edilmesi  sinaptik iletim, fertilizasyon, immün yanıt vb…

SNARE proteinleri sinaptik vezikül

füzyonuna aracılık eder

SNARE proteinlerinin keşf

• Clostridial botulinum ve tetanoz toksinleri

• Güçlü nörotoksinler

• Presinaptik uca girer ve son derece özgül proteazlar olarak davranarak aksonal buton morfolojisini

değiştirmeden membran füzyonunu engellerler

SNARE proteinleri

1. Snaptobrevin/VAMP (R-SNARE) 2. SNAP-25

3. Sintaksin-I

Bu 3 protein membran füzyon makinesinin temel bileşenleridir.

• Clostridial nörotoksin çalışmalarından önce

gerçekleştirilen in vitro füzyon çalışmaları sırasında

«NSF» adı verilen ve membran trafiğinde önemli rol oynayan bir protein tanımlanmıştır

• NSF= N-ethylmaleimide Sensitive Factor

• Nörotoxin verileri ışığında staptobrevin, SNAP-25 ve sintaksin proteinlerinin tanımlanmasının

hemen ardından bu 3 proteinin birbirleriyle

kompleks oluşturduğu ve bir ATPaz olan NSF’nin bu kompleksi bileşenlerine ayırdığı gözlendi.

• Bunedenle komlekse SNARE adı verildi

• Soluble NSF-Attachment protein Receptor

Hipotez

• Trans-SNARE kompleksleri veziküller ve plazma membranı arasında köprü vazifesi görerek

veziküllerin membrana yönelip kenetlenmesi için spesifikliği belirlemektedir.

SNARE kompleksi

• Yapı olarak son derece stabil

• Snaptobrevin ve sintaksinin transmembran

domainlerine komşu olan helikal bölgelerinin paralel düzenlenmesi ile oluşur

• SNARE kompleksinin kurulumu enerji açığa çıkarır ki bu enerji membranların füzyonu sırasında

membranlarını birbirine yaklaştırıcı güç olarak kullanılır.

trans-SNARE kompleksi

• SNARE kompleksi parelel 4 heliks demeti içerir

• Hipotez değil

SNARE proteinleri ve Füzyon

• «Kurulma ve Ayrılma Döngüsü» şeklinde iş görürler

• SNARE kompleksinin oluşması: Füzyon için gerekli gücü sağlamak

• SNARE kompleksinin ayrılması: Bir sonraki füzyonda kullanılmak üzere SNARE proteinlerinin hazır olmasını sağlamak

SNARE Döngüsü

• Amino-uç  Karboksi-uç

• Füzyona uğrayacak membranlar arası boşlukta köprü oluşturan trans-SNARE komplekslerinin fermuar gibi kapanması ile başlar

• Fermuarın tam kapanması membranda füzyon- porunun açılmasına neden olur

SNARE Döngüsü

• Porun açılmasından sonra, iki membran tamemen birbiri üzerine çakışmış hale gelir

• trans-SNARE kompleksleri, cis-SNARE komplekslerine dönüştürülür.

• cis-SNARE kompleksleri daha sonra NSF ve SNAPler tarafından monomerlerine ayrılır.

SNARE Döngüsü

• Bu döngüde NSF, SNARE proteinlerini «enerji ile yükler»

• Reaktif SNARE proteinlerinin enerjisi, SNARE

kompleksinin kurulumu yoluyla füzyon işleminde kullanılır.

SNARE Kompleksinin Kurulumundaki Özgüllük

• SNARE proteinleri karakteristik aa dizisine sahiptir

– 6 adet heptad tekrarı içeren 60-70 aa uzunluğunda

• Pek çok SNARE proteini 1 adet SNARE motifine sahiptir.

• SNAP25’de ise 2 adet SNARE motifi bulunmaktadır.

• SNARE proteinlerinde bulunan SNARE motifleri, SNARE kompleksinin 4-heliks sarmal bobin (coiled coil) yapısını oluştururlar

SNARE Proteinleri

• SNARE proteinleri içerisinde en basit yapıya sahip olan Sinaptobrevindir

• SNAP-25de 2 adet SNARE motifi ve bir bağlayıcı bölge bulunur.

– Bu bölgenin palmitoilasyonu ile membrana tutunur

• Sintaksin ise en kompleks yapıya sahip SNARE proteinidir

– Korunmuş amino-terminal bölgesi, buna komşu kendiliğinden katlanan Habc domaini, SNARE motifi ve TM çapa domaini içerir

Sintaksin

• Genel olarak bakıldığında membrana tutunma

domaini ve SNARE motifleri proteinin yaklaşık 1/3’ini oluşturur.

• Proteinin büyük bir kısmı ise «non-SNARE» dizilerden oluşmaktadır.

• Kompleksteki 4-heliks demeti temel olarak hidrofobik etkileşimler sonucu oluşturulur

SNARE Motifleri

• Protein dizi analizleri sonucunda SNARE motiflerinin 4 grup şeklinde sınıflandırılabileceği görülmüştür.

1. Qa-SNARE 2. Qb-SNARE 3. Qc-SNARE 4. R-SNARE

• R-SNARE: Transport vezikülü  v-SNARE

• Q-SNAREs: Alıcı membran  t-SNARE

SM Proteinleri

• Membran füzyonunda SNARE proteinlerinin son derece önemli partneridirler

• Biri veya diğerinin olmadığı koşullarda füzyon meydana gelmez

• Yaklaşık 600 aa uzunluğunda evrimsel olarak korunmuş proteinlerdir.

• Yay şeklinde tokaya benzer

SM Proteinleri

• Sintaksin’lerin amino-ucundaki korunmuş dizi SM proteinleri ile bağlanır

SM Proteinleri

• Bu bağlanma SNARE kompleksinin oluşmasına engel değildir.

• Bağlanma bölgesi SNARE motiflerini içermez

Sinaptik Ekzositoz için SNARE

proteinleri neden SM proteinlerine

ihtiyaç duyuyor?

• Net bir yanıtı yok.

• SNARE kompleksinin paketlenmesinde rol oynayabileceği düşünülüyor.

• «Bu bağlanmanın SNARE komplekslerini uzaysal

organizasyonunu sağlıyor ve füzyone olan membranlar arasındaki boşluğun içine doğru kaymalarını

engelleyerek kompleksin oluşmasına yardımcı oluyor olabilir»

• «Füzyon sırasında doğrudan fosfolipid karışmasını katalizliyor olabilir»

SM Proteinleri

• Primer fonksiyonları füzyonu regüle etmek değil, yönetmek

• Delesyonları füzyonu ortadan kaldırıyor

• Ca²⁺, fosforilasyon ve diğer ikincil mesajcılar gibi klasik sinyal iletim mekanizmaları ile düzenlenmiyorlar

SNARE- ve SM-protein kompleksleri

• Veziküllerin hedef membranlara tutunmasını stabilize ederek «kenetlenme»de rol oynarlar

• Vezikül yönlendirilmesi sırasında, ekzositozdan önce meydana gelmektedir.

SNARE Şaperonları: CSP- α ve Sinükleinler:

• Herbir NT salınma olayı, SNARE kopmlekslerinin kurulması ve bu komplekslerin NSF ve SNAPler aracılıyla ayrılması süreçlerini

içermektedir.

• Belirli bir zaman anında pre-sinaptik uçta yüzlerce katlanmamış veya kısmen katlanmış SNARE-protein molekülleri bulunur.

• Bu katlanmamış veya kısmen katlanmış proteinler spesifik olmayan etkileşimlere veya yanlış katlanma olaylarına yatkın SNARE

motiflerine sahiptir.

• Bu nedenle nöronlarda bu katastrofiyi engelleyecek, yani SNARE proteinlerini işlevsel konformasyonlarında tutacak ve SNARE- kompleks oluşumunu destekleyecek en azından iki şaperon sistemi bulunmaktadır.

• CSP- α, Hsp70 ve SGT

• Sinükleinler

• Her ikisi de nörodejenerasyon ile ilişkili

• Yanlış katlanmış ve/veya anormal yapılanma gösteren SNARE proteinlerinin varlığı nöronal sağ kalıma engel olmaktadır.

CSP- α

• Evrimsel olarak korunmuş sinaptik vezikül proteinidir

• Şaperonlara özgü DNA-J domain içerir.

• DNA-K domain içeren Hsp-70 ve tetratrikopeptid tekrar proteini SGT ile kompleks oluşturduğunda, deneysel olarak

– Denatüre edilmiş proteinlerin katlanmasına aracılık ettiği – SNAP-25’lerin agregasyonunu engellediği

gösterilmiştir.

• Farede CSP-α delseyonu

– NT salınmasına hemen etkisi görülmüyor

– SNAP-25lerin ubiquitin aracılı degredasyonunu artıyor – 2-3 aylıkken nörodejenerasyon nedeni ile ölüyor

Sinükleinler

• α-, β- ve Ɣ-sinükleinlerden oluşan bir protein ailesi

• α -sinüklein mutasyonları veya aşırı ifadesi Parkinson hastalığı ile ilişkili

• Pek çok nörodeneratif hastalıkta gözlenen Lewy cisimcikleri alfa-sinüklein içeriyor

Sinükleinler

• Negatif yüklü fosfolipidlere bağlanan küçük proteinlerdir.

• CSP-α KO farelerde orta seviyede ekspresyonları bile letal nörodejenerasyonu engelleyebiliyor.

• Tüm sinüklein izoformalarının delete olduğu farelerde

– Letalite gözlenmiyor

– 1 yaştan sonra yaşa-bağlı nörojenerasyon gözleniyor

• α-sinüklein normal olarak SNARE-kompleksinin kurulumuna aracılık eder.

• Ancak bu genin duplikasyonu veya triplikasyonunun gözlendiği hastalarda, alfa-sinüklein’in aşırı ifadesi neden nörodejenerasyona neden oluyor?

1. Artmış SNARE-şaperonlanması füzyon dengesini bozacağı için zararlı olabilir 2. α-sinükleinin yanlış katlanması

nörodejenerasyona neden oluyor

olabilir.

SNARE/SM Protein Füzyon

Makinesinin Aktif Zona Montajı

• Sinaptik ekzositoz sırasında sinaptik veziküller

proteince son derece zengin aktif zona kenetlenir ve füzyon gerçekleşir.

• Aktif zonda en az 4 anahtar protein bileşeni bulunmaktadır

1. Munc13’ler 2. RIM’ler

3. RIM-BP’ler 4. Alfa-riprinler

Piccolo/Bassoon, ELKS(CAST)

• CASK, Velis, Mints , endositik iskele proteinleri (intersektin, sindapin, amfifisin,…)

• Bu aktif zon proteinleri bütün sinaps türlerinde mevcut

– Eksitatör/inibitör

– Nöromusküler junction – Ribbon sinapslar

Aktif zon

• Pre-sinaptik uçların birbiri ile örtüşen 3 temel fonksiyonuna aracılık eder

1. Sinaptik veziküller, Ca²⁺ kanalları ve diğer pre-sinaptik bileşenleri tek bir kompleks şeklinde fiziksel olarak birbirine bağlamak

• Hızlı sinaptik iletim için tüm bileşenlerin kolokalizasyonunu gereklidir.

Aktif zon

2. Pre-sinaptik reseptörleri organize ederek NT salınımının pre-sinaptik modülasonuna olanak sağlamak.

3. Kısa- ve uzun-süreli plastik plastisitenin pek çok formuna aracılık etmek.

Munc13’ler ve RIM’ler

• Yapısı en iyi tanımlanmış ve fonksiyonları en iyi anlaşılmış aktif zon proteinleridir

• Multidomain protein yapısındadırlar

Munc13

• Çok sayıda promotor’dan eksprese olan çok sayıda izoformu söz konusudur

• Munc13 izoformlarında

– Amino- ucunda C2A domaini bulunur. Ca²⁺ bağlamaz ve homodimerizasyonda rol oynar

– Ca²⁺ bağlayan bir merkezi C2B domaini – Yönetici MUN domaini

– Ca²⁺ bağlamayan C2C domaini

yapısında bulunan diğer domainlerdir.

Munc13

• Sinaptik vezkülün hazırlanması ve yönlendirilmesi için gereklidir

• Ca²⁺ ve RIM tarafından sıkı düzenlenmesi söz konusudur

• Büyük bir olasılıkla SNARE ve/veya SM proteinleri ile etkileşerek vezikülü yönlendirmektedir

RIM Proteinleri

• Munc13lerle karşılaştırıldığında domain yapıları daha karmaşıktır

• İzoformaları söz konusudur

• α-RIM’ler en baskın olan izoformdur

• Amino ucunda bulunan iki bölge ile bir yandan GTP- bağlama proteini olan Rab3 ile diğer yandan da

Munc13’ün C2A domaini ile etkileşir.

• Eğer RIM varsa Munc13 homodimer oluşturmak yerine RIM ile Munc13/RIM heterodimerini oluşturur.

RIM Proteinleri

• Merkezi PDZ domaini ile ELKS proteinlerine ve Ca²⁺

kanallarına bağlanır

• İki adet Ca²⁺ bağlamayan C2A ve C2B domainleri bulunur

• Bu domainler arasında yer alan kısa Prolince zengin dizi ile RIM-BP’lere bağlanır

• İkinci C domaini ile de alfa- liprine bağlanır

• Diğer aktif zon proteinleri ile bağlantıyı sağlayan merkezi bir proteindir.

RIM Proteinleri

RIM Proteinlerinin İşlevleri

1. Munc13’ün «priming» aktivitesini düzenlemek.

2. Ca²⁺ kanallarını aktif zona bağlamak

Doğrudan: Ca²⁺ kanallarına PDZ domainleri aracılığı ile bağlanırlar

Dolaylı yoldan: RIM-BP aracılığı ile bağlanırlar

• RIM proteinlerinin delesyonları pre-sinaptik membranda Ca²⁺ kanallarının kaybolmasına

• Aksiyon potansiyeli ile indüklenmiş Ca²⁺ girişinin engellemesine neden olur

RIM Proteinlerinin İşlevleri

ÖZET

• Sinaptik ekzositoz hiyerarşik olarak organize olmuş bir grup protein aracılığı ile gerçekleşir.

• SNARE ve SM proteinleri bu organizasyonun çekirdeğini oluşturur

• İşlevselliği için NSF, SNAPler ve spesifik SNARE şaperon proteinleri rol oynar

• Diğer aktif zon proteinleri tarafından düzenlenir.