Sinaptik Vezikül Endositozu

Sinaptik Vezikül Endositozu

Doç. Dr. Güvem Gümüş Akay

Ank. Üniv. Disiplinlerarası Sinirbilim Doktora Programı/

Sinapsların Moleküler Nörobiyolojisi

• Aksiyon potansiyeli, akson ucuna her

ulaştığında «readily releasable vesicle pool» da

– Akson membranına tutunma – Membran füzyonu

– Ekzositoz ile NT salınması

• Her uyarımda membran füzyonu nedeniyle

–Aksonal butonlardaki plazma membranı genişler

–Sinaptik vezikül kaynakları tükenir

• Akson uçları, bu membran yapılarının yakalanması ve yeniden kullanılabilmesi için bir takım endositik mekanizmalar geliştirmiştir.

• Yapısal olarak sinaps şeklinin korunması amacıyla membran dengesinin sağlanması gereklidir

• Sinaptik vezikül dengesinin sağlanabilmesi için ekzositozla eş zamanlı olarak endositoz süreci de aktive edilir

• Aksiyon potansiyeli akson ucuna ulaştığında sadece ekzositozu tetiklemekle kalmaz

• Aynı anda endositozu da tetikler

Endositozla hücre içerisine alınan plazma membranı ve

diğer proteinler yeniden sinaptik vezikül oluşturulmasında kaynak olarak kullanılır.

ENDOSİTOZ YOLAKLARI

• Aksonal uçlarda istirahat halinde bile ekzo- ve endositoz olayları gerçekleşir.

– Aksonal uçlarda büyük yapısal değişiklikler gözlenmez

• Ancak sinaptik uyarım söz konusu olduğunda bu

uyarımın şiddetine bağlı olarak geri döndürülebilen büyük morfolojik ve yapısal değişiklikler meydana gelir

• Bu koşullar altında meydana gelen endositik ara ürünler EM’da gözlenebilir

• Ancak gözlenen yapılara dayanarak endositoz

sürecinde meydana gelen olayları basit bir modele oturtmak hiç kolay değildir.

• Elektrofizyolojik: Membran kapasitansı

• Görüntüleme: Dinamik floresan görüntüleme

• Endosiztozun çok sayıda mekanizma ile meydana gelebileceğini düşündürmektedir

• Ancak bu tekniklerle elde edilen veriler ile EM verileri arasında ilişki kurmak oldukça zordur.

• Endozitoz ile ilgili olarak yapılan

çalışmaların çoğu non-nöronal hücrelerde gerçekleştirilmiş çalışmalardır.

• Nöronda bunu yapmak zor:

–Akson uçları son derece küçük

Nöronlarda endositoz yolakları

• Klatrin-aracılı endositoz

– Sinaptik vezikül proteinlerinin hücre içerisine alınmasında son derece önemlidir

– Sinaptik veziküller, doğrudan içeri alınan klatrin kaplı bu veziküllerin klatrin kılıfından arındırılması ile oluşturulur

Akson uçlarında endositoz mutlaka klatrin-aracılı olmak zorunda değil

• Caenorhabditis elegans

• Çok kuvvetli bir uyarıya cevaben meydana gelen ekzositik patlamayı takiben «bulk endozitoz» meydana gelmektedir.

KLATRİN-ARACILI ENDOSİTOZ

Sinaptik veziküllerin geridönüşümünde Klatrin- aracılı endositozun önemini destekleyen kanıtlar

1. Ekzositozun indüklenmesinden hemen sonra geçici olarak klatrin kılıflı endozitik yapıların gözlenmesi

2. Katrin-aracılı endozitozun deneysel olarak inhibisyonu sonucu sinaptik vezikül geridönüşümünün bloke

olması

3. Sinaptik vezikül geridönüşümünün belli aşamalarda engellenmesi ile büyük klatrin kılıflı yapıların oluşması 4. Klatrin kılıflı veziküller içerisinde esas kargo

molekülleri olarak sinaptik vezikül proteinlerinin bulunması

5. Klatrin kılıflı veziküllerin en fazla beyin dokusundan elde edilebilmesi

KLATRİN KILIFLAR ve SİNAPTİK VEZİKÜLLERİN OLUŞTURULMASI Presinaptik klatrin kılıflı veziküllerin kaderi: Kılıftan arındırılma ve erken endozomlarla füzyon

Alternatif model: Klatrin kılıflı veziküller doğrudan sinaptik

veziküllere dönüştürülebilir

Destek 1

• Kılıf aracılı tomurcuklanma, en doğru moleküler komposizyona sahip vezikül

oluşturulması için genel bir mekanizmadır

• Çünkü kılıf oluşumu, sadece vezikülün etrafını sarmakla kalmayıp aynı zamanda bir moleküler tasnifleyici olarak iş görmektedir

Destek 2

• Endositik klatrin kılıfın yapısal bileşenleri, yardımcı diğer moleküller ile birlikte akson uçlarında en yoğun olarak bulunan kılıf

proteinleridir

• Bu nedenle sinaptik vezikül oluşumunda son derece önemli oldukları aşikardır

Destek 3

• Bu model sinaptik vezikül geridönüşüm

sırasında iki ayrı tomurcuklanma basamağına ihtiyacı ortadan kaldırmaktadır

– Plazma membranından klatrin-aracılı tomurcuklanma

– Enzomdan tomurcuklanma

• Sürecin hızlı işlemesi açısından son derece önemlidir

Destek 4

• Klatrin kaplı çukurcuklar belirgin bir biçimde küçük ve homojen büyüklüğe sahiptir

• Büyüklükleri sinaptik veziküllere benzer

Klatrin Kılıflı Çukurcuk ve Veziküllerin Oluşumu

• Klatrin kılıflı çukurcukların nükleasyonu klatrin- adaptör proteinleri ve/veya bir grup yardımcı (accessory)

faktörün fosfolipid bilayer’la etkileşmesi ile başlar

• Adaptörlerin birbirleriyle, diğer yardımcı faktörlerle,

kargo proteinleriyle ve klatrinle etkileşmesi klatrin kılıflı çukurcuğun hızla büyümesine neden olur.

• Böylece ince bir boyun bölgesi ile plazma

membranından sitoplazmaya doğru uzanan büyük bir tomurcuk oluşmuş olur

• Tomurcuğun vezikülden ayrılması ile serbest bir klatrin kılıflı bir vezikül meydana gelir

• Bu vezikül hemen klatrin kılıfından arındırılır

• Tüm bu süreç endositozun gözlendiği

hücrelerde temel olarak aynı olmakla birlikte, nöronların akson uçlarında bu sürecin özgün özellikleri bulunmaktadır.

– Kargonun spesifikliği – İşlemin hızı

• Sinaptik veziküllerin son derece kritik ve hata

götürmeyen fonksiyonları nedeni ile yeni oluşan vezikülün gerekli olan tüm membran proteinlerini uygun stokiyometride içermesine olanak

sağlayacak mekanizmaların varlığına ihtiyaç duyulmaktadır

– Örneğin bazı membran proteinleri yaklaşık 10 kopya bulunurken bazıları ise sadece 1 kopya olarak

bulunmaktadır.

– Tüm bu süreçlerin doğru işlediğinden emin olacak kontrol noktalarının bulunduğu düşünülmektedir.

Klatrin Kılıfın Merkez Bileşenleri

• Klatrin kılıf, hücredeki diğer kılıflara benzer biçimde iki tabakalı bir yapılanma

göstermektedir.

• Adaptör proteinlerden oluşan iç tabaka

• Bunu dıştan çevreleyen klatrin tabaka

Klatrin Adaptörleri

• Tipik olarak membrana bağlanan bir merkezi modül ve buna bağlı esnek kollardan oluşur.

• Bu esnek kollar da ilave küçük katlanmış modüller ile sonlanır.

• Plazma membranının hangi bölgesinin

endositozla geri

alınacağını membran üzerinde bulunan bazı hedef proteinler belirler

• Örn: Sinaptobrevin 2

Hedef proteinler

• Bu proteinler endositoz için hedefi belirten kısa özel aminoasit dizilerine sahiptirler.

• Bu dizilere «endositik motif» adı verilir.

Endositik motif

Endositik Motifler

• Proteinin sitoplazmik domaininde bulunan ve adaptör proteinler

tarafından tanınabilen özel dizilerdir.

• -NXXY-

• -YXXφ- ^Endositik _motif

Adaptör Protein: AP2

• 4 altbirimden oluşur

• Herbir alt birim

«adaptin» proteinleridir

• α-adaptin

• β-adaptin

• µ-adaptin

• σ-adaptin

• AP-2’nin, endositozla alınacak hedef

proteinlerin bulunduğu plazma membranına yönlendirilmesi

Sinaptotagmin 1/2’nin C2B domaini aracılığı ile

• AP2’nin gövde domainin olur bir tarafı C2B ile diğer tarafı ise hedef proteinin endositik motifi ile

etkileşime girer

Endositik motif

C2A

C2B

• AP2’nin plazma membranına bağlanması için aynı zamanda membran lipidleri ile etkileşim de

gereklidir.

• PIP2 (Fosfatidilinozitol-4,5-bisfosfat)

• PIP2 bağlanmayı kuvvetlendirir.

• PIP2 olmasa da AP2 bağlanabilir, ancak zayıftır

KLATRİN YAPISI

• Bir ağır, bir hafif olmak üzere 2 polipeptid

zincirinden oluşur

• Hafif zincir ağır zincirin proksimal domaini ile etkileşir

Distal domain

Distal domain

Proksimal domain Proksimal

domain Ağır zincir Ağır zincir Hafif

zincir Hafif zincir

TRİSKELE

• Sitoplazmada klatrin tek başına bulunmaz

• Triskele yapısında bulunur

• Triskele: Bir merkezden çıkan 3 bacak/çizgi şeklindeki sembol

AP-2’nin uzantıları ile etkileşerek membranla ilişkiye geçer

• Klatrin kılıflı çukurcukların oluşması için hücre içerisinde herhangi bir sinyale ihtiyaç yok

• İlk aşamalar aksiyon potansiyeli olsa da olmasa da başlar

• Çukurcuğun iki yanında kalan membranların

birleştirilmesi ve serbest bir vezikül oluşturulması için aksiyon potansiyeline ihtiyaç vardır.

• Klatrin tek başına bu finali gerçekleştiremez

• Membranın iki tarafını birbirine yaklaştıracak gücü yoktur

İki ucun sıkıştırılması nasıl olur ve düzenlenir?

α1 Ɣ

α-2δ

Readily releasable vesicle pool

Readily releasable vesicle pool

• Hücre içerisine giren Ca²⁺ diğer taraftan membranın iki kenarının birleştirilmesini tetikler.

• Bunu nasıl gerçekleştirir?

• Ca²⁺ hücre içerisine girdiğinde bir taraftan Syt 1/2’ye bağlanırken, diğer taraftan da

Kalmodulin (CaM) adı verilen başka bir proteine bağlanır

Kalmodulin(CaM)

Bağlayıcı lob Bağlayıcı lob

N-lobu

N-lobu C-lobuC-lobu

• Herbir lobda ikişer adet EF-hand motifi

• Her bir lob 2 adet Ca²⁺

bağlar

• Kalsinörin

• Enzim

• Serin/Treonin fosfataz

Ca²⁺-CaM akson terminalinde farklı proteinlerle interaksyona girerek onları aktive eder

Kalsinörin

• Proteinlerin Serin/Treonin rezidülerine bağlı fosfat gruplarını kopartır

Dinamin

• Endositoz işlemini sonlandıran asıl proteindir.

• Enzim

• GTPaz

• GTP  GDP + Pi

• Enerji açığa çıkarır

• Fosforile iken sitoplazmada serbest halde bulunur

• Kalsinörin tarafından defosforile edildiğinde, oluşan vezikülün boyun kısmında spiral şeklinde polimerize olmaya başlarlar

• Oligomerizasyonla birlikte GTPaz aktivitesi daha da artar

• Açığa çıkan enerji ile oluşturduğu spiralde dönüşe ve sıkışmaya neden olur

Endofilin

• Bu arada «endofilin» adı verilen bir protein de sürece dahil olur

• Boyun kısmında bir halka oluşturarak, dinamin oligomerizasyona aracılık eder

Oluşan Endositik Veziklün Endozoma Dönüşmesi

• Oluşan endositik vezikül bu haliyle hiçbir işe yaramaz

• Klatrin klıfından kurtulması gerekir

• Endofilin, başka bir enzimi bulunduğu veziküllere yönlendirerek bu işte rol alır

Sinaptojanin

• Enzim

• Fosfataz

• Fosfalipid bilayerdaki PIP2’leri defosforile eder

• Fosfatidilinozitol-4-fosfat’a çevirir

• Bu olayla birlikte klatrin kılıf ortadan kalkar

• Bu süreçte HSP70 ve Auxilin’de önemli rol oynar

Oluşan Endositik Vezikülün Kaderi?

Sinapslarda ve Aksonal Büyüme

Konilerinde Lokal Endozomal Sistemler

Hücre membranı reseptörleri ve adezyon moleküllerinin

– Sayı

– Erişilebilirlik

• Nöronlar büyük ve yapısal-fonksiyonel olarak özelleşmiş hücreler

• Uzak mesafelerde ve lokal olarak etki gösteren, büyüme faktörleri, nörotrofik faktörler ve

elektriksel aktivite gibi hücre dışı uyaranlara duyarlı olan özelleşmiş endozomal sistemlere ihtiyaç duymaktadır

“Housekeeping” fonksiyon

• Çok sayıda reseptör sisteminin integrasyonu, nöral gelişme sırasında hücre davranışına yön verme

açısından son derece kritik öneme sahip

• Hangi reseptör?

• Nerede?

• Ne zaman?

• Ne kadar?

• Sinyal iletimi üzerinde ne süre ile etkili?

• https

://www.youtube.com/w atch?v=-

yMvYaj8t0I