HİSTOLOJİDE KULLANILAN
RUTİN BOYAMA
TEKNİKLERİ
Doç.Dr.Şerife TÜTÜNCÜ
Boyalar amaca göre yapılır.
En basit boyamada hücrenin iki temel bölümü ayrı
renklerde boyanır.
* Çekirdek Haematoksilen,
* Sitoplazma Eosin ile boyanır.
Boyama işlemi sonunda kesitler su içindedir. Kesitlerin
ve boyanın dayanıklı olabilmesi için kapatıcı bir medyum
ile kapatılması gerekir.
Bu amaçla öncelikle kesitlerdeki suyun giderilmesi
gerekir. Suyun giderilmesi amacı ile kullanılan dereceli
alkollerden ve xylollerden geçirilir.
Xylol hem kapatıcı medyum ile uyuşur, hem de dokuları
parlatarak saydamlaştırır.
Kapatıcı medyumdan kesit üzerine bir damla
damlatılarak, lamel ile arada hava kabarcığı
kalmayacak şekilde kapatılır.
Düz bir zeminde kurumaya bırakılır.
Preperatlar mikroskop altında incelenmeye hazırdır.
BOYA SOLUSYONLARININ
HAZIRLANIŞI
İodin Alkol Solusyonu:
İodine (İyot)………2 gr.
%70 alkol………..100 ml.
Sodyum Tiyosülfate Solusyonu:
Sodyum Tiyosülfat………...2 gr.
Distile su………..100 ml.
Weigert Hematoxylin Solusyonu:
Solusyon A ; Hematoxylin ( Crist)……….1 gr.
% 95 alkol……….100 ml.
Solusyon B ; Distile su……….99 ml.
Demir-3-Klorür………1 gr.
(sıvı ile 4 ml.)
HCL (Hidroklorik asit)………….1 ml.
A ve B solusyonları eşit miktarda hazırlanıp
karıştırılır.
Metil Alkol ( Metil Karbonat) Solusyonu
Distile su………...125 ml.
Metil alkol (Metanol)…125 ml.
Az miktarda Sodyum Karbonat ilave edilir, karıştırılır,
karbonat eritilir.
Asit Fuksin Orange G Solusyonu
Asitfuksin………0,7 gr.
Orange G……….0,3 gr.
Distile su...200 ml.
Tymol………0,13 gr.
Asetik asit………2 ml.
Anilin-Blue Solusyonu Anilin-Blue………..2 gr Distile su……...100 ml Asetik asit……….2 ml.
Asetik Asit Solusyonu
Asetik Asit…………..2 ml.
Distile su.………..100 ml
Phosphotungstic Asit Solusyonu Phosphotungstic Asit………….3 gr Distile su………...100 ml.
Triple Boyama Tekniği
Xylol I………..5 dk.
Xylol II………5 dk.
Absolu alkol I.……….…3 dk.
Absolu alkol II………3 dk.
% 96 Alkol………....3 dk.
%80 Alkol………3 dk.
%70 Alkol………3 dk.
İodin Alkol solusyonu……… 3 dk.
Sodyum Tiyosülfat sol. ………....30 sn.
Distile suda çalkalama………2 şale Akarsuda yıkama………....5 dk.
Weigert Hematoxylin………8 dk. (boyanın tazelik derecesine göre)
Akarsuda çalkalama………..5 dk.
Metil alkolde çalkalama……….1 dk. (yarıyarıya metil alkol ve su karışımına biraz sodyum karbonat ilave edilerek hazırlanır veya asit alkol)
Akarsuda yıkama……….5 dk.
Distile suda çalkalama………5 dk.
Asit Fuksin……….1 dk. (5- 10 sn)
Distile suda çalkalama………(2 kez)
Phosfotungstic asitle dekolere………15 dk. (bağ doku beyazlaşıncaya kadar)
Distile suda çalkalama ………7 dk.
Distile suda çalkalama ………...7 dk.
Anilin-Blue (Light Gren) de boyama…....1 dk.
Distile suda çalkalama………..10-15 sn.
%2 Asetik asitte………....1-5 dk.
Distile suda çalkalama………..10-15 sn.
%96 alkolde çalkalama………..….2 şale
%100 alkolde çalkalama……….…...3 şale
Xylolde çalkalama……….…2 şale Entellan ve lamelle kapatma
PAS Boyama
Organizmada değişik karbonhidrat gruplarını
boyama amacı ile kullanılır.
Dokularda PAS
reaksiyonunu tespit etmek amacı ile alkol içeren
tespitlerin kullanılması gerekir.
PAS reaksiyonu, periyodik asidin glikol kalıntıları
üzerinde Schiff reaktifi ile reaksiyon veren aldehid gruplarının oluşması esasına dayanır.
Reaksiyon sonucu mor ya da lila rengi kompleks
bileşik oluşur.
PAS BOYASI
Schiff Reaktifinin Hazırlanması 100 cc saf su kaynatılıp hemen ateşten alınır.
1 gr bazik fuksin içinde eritilir.
Solusyon 60ºCe soğutulur.
Süzülür, 2 gr Na, sülfit ya da
Potasyum meta disülfit(K2S2O5) ile 20 cc 1NHCL eklenir.
Oda ısısında ya da buzdolabında 18-24 saat bekler.
300 mg aktif kömür konur, 1 dakika kuvvetlice çalkalanır.
2-3 kez süzülür.
0-5ºC de saklanır. Solusyon açık sarı parlak renkte olmalıdır.
Pembeye dönüşünce atılır.
1N HCL
HCL (%37’lik Konsantre)83.3cc Safsu………16.7cc Asit üzerine su konmaz!!!!!!!!!
Yıkama Solusyonu
a) %10’luk K2S2O5 ( 10 cc saf su + 1 gr K2S2O5 )
b) %10N HCL (10 cc) ( 1 cc 1N + 10 cc distile su = %10 N )
Yıkama solusyonu hazırlanırken a ve b ürünlerinden 10’ar cm3 alınır üzerine 180 cm3 musluk suyu
eklenir. 3 boya kabına paylaştırılır.
Yıkama solusyonu karışımı her boyada daima taze olarak
hazırlanmalıdır.
Periodik Asit Solusyonu
Periodik asit (1 gr) + Saf su (100 cc)
Boyama Prosedürü
Kesitlerin parafini giderilir, suya indirilir.
P.A………30 dakika Akarsuda………10 dakika çalkalanır
Saf su……… 3 kez çalkalanır Schiff solusyonu (karanlıkta)………30 dakika
Yıkama solusyonu………3 kere 5 dakika
Akarsu ………5 dakika Harris hematoksilen………7 dakika (hazır boyada süre azalır)
Akarsuda mavileştirme………10 dakika Alkol ve Xylol’lerden geçirilir ve Kapatılır.
Haematoksilen Eosin Boyama Tekniği
(Harris)Hematoxylen alkolde eritilir, ısıtılarak suda eritilen
alumla sıvı haldeki hematoxylen birleştirilir.
Kaynama noktasına kadar bir miktar ısıtılır (1 dk. kadar)
ocaktan indirilir. Civa oksit yavaş yavaş ilave edilir.
Solusyon koyu pembe bir renk alır. Soğuduktan sonra
her 100 ml solusyon için 24 ml. Glacial asetik asit
ilave edilir ( çekirdeğin güzel boyanması için) her
kullanımdan önce solusyon süzülür.
HARRİS HEMATOXYLEN SOLUSYONUNUN
HAZIRLANMASI
Hematoxylen (Crist.)...1 gr.
Absolu alkol...10 ml.
Amonyum veya Potasyum
aluminyum sülfat...20 gr.
Distile su...200 ml.
Civa oksit...0.5 gr.
ASİT ALKOL
HCl ...1 ml.
% 70 Alkol....100 ml.
AMONYAKLI SU Amonyak....1 ml.
Distile su...100 ml.
% 1 lik STOK ALKOL-EOZİN SOLUSYONU
HAZIRLANMASI
Eozin... 1 gr.
Distile su...20 ml. (Eozin suda eritilir)
% 96 Alkol...80 ml.
BOYA SOLUSYONU (200 ml)
Eozin (Stoktan)...50 ml
% 80 Alkol...150 ml
Glasial asetik asit....5 ml
XYLOL III
15Dakika % 80 ALK.
3 Dakika % 70 ALK.
3 Dakika AKARSU
3 Dakika HARRİS HEMATOXY.
10 Dakika
ABS. ALK.
3 Dakika XYLOL III 5 Dakika
XYLOL II
15Dakika % 96 ALK.
3 Dakika AKARSU
3-4 kez Daldır ASİT-ALKOL
3-4 Kez Daldır DİSTİLE SU
3 Dakika % 96 ALK.
3 Dakika XYLOL II 5 Dakika
XYLOL I
15Dakika ABS. ALK.
3 Dakika EOZİN
3 Dak. AMONYAKLI
(Doku mavi-SU leşinceye
kadar)
% 70 ALK.
3 Dakika % 80 ALK.
3 Dakika XYLOL I 5 Dakika
