FABAD]. Pluırm. Sci., 19, 153~165, 1994
SCIENTIFIC REVIEWS / BILIMSEL TARAMALAR
Deriye Uygulanan Protein İçeren
Kozmetik Preparatlar
Erem Memişoğlu*, Filiz Öner*
Özet: Günümüzde kozmetik preparatlarda protein ve pr-otein hidrolizatlarının kullanımı giderek
yaygınlaşmaktadır. Bu tip preparatlarda kullanılan pro- tein yapısındaki etken maddelere tirnek olarak kollajen, elastin, keratin glikoproteinler, lektinler, kollajen ve ke- ratin hidroliiatlarıııı giisterebiliriz. Bu tip tnaddeler de- riye emülsiyon(mikroemülsiyon, çoklu emülsiyon), nio- zom, jel, krem, lipozom ve sıvı kristal gibi taşıyıcılarla
uygulanabilirler. Ancak protein içeren kozmetik prepa-
ratların hem sıvağ, hem de kullanılan protein yo·niinden
başta stabilite olmak üzere formülasyon sorunları vardır.
Proteinler sıcaklık, pH ve basınç gibi etkenlerle denatiire
olmalarından dolayı etki kaybına uğrayabilirler. Bu der- lemede, proteinlerle ilgili genel bilgi, deriye uygulanan kozmetikler, bunların formülasyon sorunları, deriye pe-
netrasyonları ve bunlara ilişkin bazı örnekler verilmiştir.
Anahtar kelimeler: Protein, peptit, topik preparatlar, kozmetik.
Geliş tarihi Kabul tarihi
13.1.1994 6.10.1994
Son yıllarda değişik proteinler ve bunların hidro- lizatlarmm kozmetik formülasyonlarda kullanımı
oldukça yaygmlaşnuşhr. Proteinler, kozmetik en- düstrisinde birer hammadde olup, fonksiyonel özel- liklerinden dolayı deri ve saç bakım ürünlerinde
yararlı sonuçlar göstermektedirler.
Kollajen veya keratin hidrolizatlarmm etkinlik- leri kanıtlanmıştır. Diğer bazı proteinler ise, koz- metik endüstrisinde kullanılmalarına karşın henüz özellikleri ve fonksiyonları tam olarak açıklığa kavuşturulamamıştır. Kozmetik ürünlere protein eklenmesiyl11, deri ve saçların yapısını ve özelli-
(*) Hacettepe Üniversitesi Eczacılık Fakültesi Farmasötik Teknoloji Anabilim Dalı 06100, Sıhhiye-ANKARA
Protein Cosmetics for Topical Application
Summary: In recent years, there has been an increase in the use of protein and protein hydrolyzates as active ingredients far cosmetic preparations. Some proteins that have taken place as active ingredients in these pre- parations are collagens, elastins, keratins, glycoproteins and lectins. These proteins can be applied topically in dosage forms such as cosmetic emulsions(microemul- sions, multiple ernulsions) or in the form of niosonıes, li- posomes and liquid crystals. I-Iowever, protein contai- ning cosmetic preparations have formulation problems mainly caused by the stability of proteins. Proteins may loose their activity because of their denaturation, caused by the factors sııch as temperature, pH and pressure.
This review article includes general information about proteins, topically applie.d cosmetic preparations contai- ning protein active ingredients, their formulation prob- lems, protein penetration to the skin and some examp- les.
Keywords Protein, peptide, topical formulations, cosmetics
ğini bozmadan sağlıklı ve temiz tutma amacına ulaşılabilecektir.
Proteinler büyük molekül ağırlıkları nedeniyle pe- netre olamamakta ve yüzeyde nemlendirici veya
birtakım bağlanmalar yoluyla onarıcı etki yapma-
ları nedeniyle kullanılmaktadır. Oysa hidrolizat- lar küçük molekül ağırlıkları nedeniyle penetre olabilmektedir ve bunları ve türevlerini içeren deri kozmetikleri irritasyon ve duyarlılığa yol açmayan, deri kimyasıyla büyük ölçüde geçimli ve
geniş bir uygulama alanına sahip ürünler olarak gi- derek yaygınlaşmaktadır. Değişik molekül
ağırlıklarında olan hidrolizahn kendisi, türevleri veya kombinasyonları deriye uygulanabilir ve de-
Mernişoğlu ve Öner
riden penetre olarak etkisini gösterebilir. Bu tip kozmetik preparatlarda kullanılan etken madde- ler arasında kollajen, elastin, glikoproteinler, gli- kolipidler, esansiyel yağ asitleri ve vitaminler
vardır.
Kollajen
Kozmetik preparatlarda sıkça kullanılan kollajen, derinin yapıtaşlarından birisi olarak bilinir. Der- miste, kollajeni oluşturan aminoasitlerden sentezle- nir. Bu amino asitlerin başlıcaları glisin, prolin ve hidroksiprolindirl. Deride% 50 oraıunda kollajen,
% 5 oranında elastin ve % 45 oranında proteoglikan
vardır2. Kollajen ilk üretildiğinde en az çapraz
bağlanrruş haldedir. Kuvveti daha azdır, fakat su tutma ve absorpsiyon kapasitesi mükemmeldir.
Yeni doğmuş bebekler ve çocukların derisinin bu tip kollajeni fazla miktarda içerdiği bilinmektedir.
Zamanla çözünür kollajen daha fazla çapraz
bağlanır, hidratasyonunu kaybeder; gerilme kuvve- ti, aşınmaya karşı direnç ve sertlik gibi özellikleri belirgin bir şekilde artar. Yaşlanma ile çapraz
bağlanmalar artar ve deri pürüzlü, sert, elastik ol- mayan ve kolay kırılan bir hal aJır3-5. Şekil l'de kollajenin şematik yapısı görülmektedir.
~
1Şekil 1. Kollajene ait üçlü heliks yapı
Büyüme ve yaşlanma sonucunda kollajen dokusunda meydana gelen farklılaşmaların en belirginleri:
a) Çözünürlük, ekstre edilebilme ve enzimlere has- sasiyette azalma
b) Mekanik ve termal stabilitede artıştır6.
Bir kollajen süspansiyonu olan Zyderm®'in deride yeni doku oluşumunu hızlandırmak amacı ile kul-
lanılması FDA(Food and Drug Administration) ta-
rafından onaylanmıştır. Çözünür kollajen ayrıca
Revlon® ve Croda® firmaları tarafından Ultima !l®
ve Collasoı® ürünlerinde kullanılmıştır?. Kollajen ve parçalanma ürünleri granülositler, makrofajlar ve hatla fibroblastlar üzerindeki kemotaktik etki- leri ile tanınırlar. Kemotaksis, spesifik kimyasal
uyarıcıya doğru enflamatuar hücrelerin amaçlı ha- reketidir. Yani bir dokuda, perkütan transport veya direkt enjeksiyonla, eksojen kollajen bulun-
ması enflamasyonda karakteristik değişikliklere
yol açar. Topik uygulanan kollajenin yara
iyileştirici özelliği olduğu deneysel bulgularla
kanıtlanmıştırB. Kollajen enjeksiyonunun sonucunda endojen kollajen oluşumu artmakta; bu da fibrotik yara dokusunun yeniden yapılanmasına yol
açmaktadır. Bu bulgulara dayanılarak kollajen, kozmetikten çok ilaç olarak kabul edilebilir. Koz- metiklerde kullanılan değişik kollajen formları arasında kollajen aminoasitleri, molekül
ağırlıkları 1000 ile 25000 Dalton arasında olan kol- lajen hidrolizatları ve 1.000.000 Dalton olan kolla- jen lifleri vardır. Lif dışında hepsinin nemlendirici
özelliği bulunmaktadır. Kollajen lifleri kozmetik maskelerde kullanılıp, mikrosünger görevi yapa- rak ağırlığının otuz katı su absorbe eder ve nemle- nince jel benzeri bir yapı oluşturarak deriye düzgün
şekil verir. Ayrıca kondroitin sülfat adlı mukopoli- sakkaride bağlanarak yanıklarda yaralı yere ek- leme yaparak iyileşmesini sağlarlar. Enjektabl olarak uygulanan çözünür kollajen ise, dermal doku
tarafından absorbe edildiğinde kırışıklıkların gi- derilmesinde olumlu etki yapar9.
Yüksek molekül ağırlıklı(300.000 civarında) kolla- jenler sıcaklık ve pH değişikliklerine çok duyarlı
dır ve bu tip etkenlerle daha düşük molekül ağırlık
lı peptidlere dönüşürler. Deri üzerinde çok iyi film
oluşturucu özelliğe sahiptirler. Etkilerini artırmak
için daha düşük molekül ağırlıklı polipeptidleriy- le karıştırılarak kullanıhrlarl. Suda çözünen diğer
FABAD J. Pharm. Sci., 19, 153-165, 1994
proteinler gibi kollajenin de alkol içeren kozmetik preparatlarda çözünürlüğü çok düşüktür. Bu tür pre- paratlarda kullanılabilmesini sağlamak için kol- lajenin glutamin ve asparajin amino asit yan zincir- lerinin kısmen esterleştirilmesi ile elde edilen Collapurol El® kullanılır. Collapurol El®, kollajen molekülünün modifikasyonu yoluyla kozmetik formülasyonlara yeni çözümler getirmektedirlD.
Elas!in
Elastin, çapraz bağlı, hidrofobik polimerik skle- roprotein yapıda olup, non-polar aminoasitler
açısından zengin bir fibröz proteindir. İki tipi bi- linmektedir. Bunlar, sığır boyun bağından elde edi- len Tip 1 ile kıkırdak ve türevlerinden elde edilen Tip 2'dir. Dermiste yaklaşık % 50 oranında kolla- jen varken, elaslin oranı % 5 kadardır?. Elaslin su
varlığında plastik bir esneklik gösteren birkaç po- limerik maddeden biridir. Bu özelliğin ortaya
çıkabilmesi için elastinin çevresi yaklaşık % 40 suyla kaplı olmalıdır. Elaslin, kollajenden sonra
bağ dokusunda en fazla görülen maddedir. Cildin
yaşlanmasıyla görülen mekanik özelliklerdeki
değişiklikler elastin ağının degradasyonuna, yani hidrofobik gruplarına lipit eklenmesine ve kal- siyum, ınagnezyum içeriğindeki artışa bağlıdır.
Elastinin kozmetiklerde kullanılmasının başlıca
nedenleri, maddenin viskoelastik özelliği nedeni ile derinin elastikliğini artırması ve çözünür elas- tinin derinin kendi elastinindeki kayıpları
önleyerek yaşlanmayı gidermesidir. Elastin türevi peptidleri içeren preparatlar temizleyici krem ve yara iyileştirici olarak kullanılır. Bu sistemlerde elastin deriden lipidleri absorbe eder ve yara do- kusunun glikoprotein ve elastin miktarını artırır.
Elastin içeren cilt bakım ürünleri:
1) Kuru ve çatlak ciltleri iyileştirir
2) Doğal nemlendirici görevi yapar, esnekliği art-
tırır
3) Deriyi gerginleştirir ve düzeltir 4) Hiperırofik yaraları yumuşatır
5) Radioderitis raceus vakalarında hızla iyileşme sağlar
6) Perkütan transportu hızlandırır ve dolaşımı
stimüle eder
7) Çözünür kollajenle birlikte kullanıldığı zaman tropakollajen liflerinin oluşumuna yol açar
Ayrıca elastin, topik olarak romatizma, ateroskle- roz, fibrozis, yaşlanma ve bağ dokusundaki genetik
hastalıkların tedavi ve incelenmesinde kul-
lanılmaktadır 11.
Keratin
Keratin önemli miktarda sistin amino asili içeren ve çözünmeyen fibröz bir proteindir. Epidermal hücrelerde iki yolla sentezlenir: ince lifler halinde sentezlenip biraraya gelip kalınlaşır veya amorf keratin granülleri oluşturup lifler halinde bira- raya gelir ve bu işlemle, yaşayan ve büyüyen doku, ölü çözünmeyen fibröz maddeye çevrilerek elastik, koruyucu bir tabaka oluşturur.
İlk keratinli kozmetik ürün saç uzatıcı bir ürün olup, tavşan kürkü ve insan saçından elde edilen keratin hidrolizatı içerir12.
Keratinin deri üzerindeki yararları:
1) Koruyucu kolloid etkisi yapar
2) Derinin nem tutucu özelliğini arttırarak sertlik ve kırışıklığı en aza indirir.
3) Deterjanlarla oluşan çatlama ve irritasyona
karşı cildi korur Glikoproteinler
G!ikoproteinler epidermal değişme işlemini sağlarlar. Bunlardan biri olan fibronektin, fibrob- lastlarda kollajene bağlanmış şekilde bulunur. Fib- roneklinin hücre adhezyonunda rol oynadığı bili- nir. Deneysel sonuçlara göre hem fibronektin, hem de fibrinojen yara kapanmasında epitel hücrele- rinin göçü için uygun bir substrat oluşturarak önemli rol oynarlar?.
Memişoğlu ve· Ôner
Lektinler
Lektinler karbohidrata bağlanmış proteinlerdir.
Bağ dokusunda bulunup bu dokunun yapısını
güçlendirerek deri esnekliğini sağlarlar. Hücre
membranlarına bağlanabilir veya hücre içi ve ara-
larında serbestçe hareket edebilirler. Lektinlerin
etkileşmeleri sonucu viskoelastik jeller oluşur ve doku esnekliği artar7.
Deriye Uygulanan Protein İçeren
Kozmetik Preparatlar
Deriye uygulanan ve etken madde olarak protein veya türevlerini içeren kozmetik preparatlar
şunlardır:13
1) Emülsiyonlar (SiY, Y IS) (Şekil 2.a)
a) Mikroemülsiyonlar (SiY, Y IS) (Şekil 2.b) b) Çoklu emülsiyonlar (Y ISIY, SiY IS, SiY iSi
sıvı kristal, SiY ISljei) (Şekil 2.c) 2) Niozornlar (Şekil 2.d)
3) Lipozomlar (Şekil 2.e) 4) Sıvı kristaller (Şekil 2.f) 5) Jeller
YIS SfY
A) Emıll•iyon49 B) Mikr0<1t1ôlsiyonl06
Koi..terol vcya lipofılik maılde
D)Niozcmlar
LınıellarFaı: Heksagonal faz K~bik fa!
i) Llpozoml~j
Şekil 2. Değişik kozmetik taşıyıcıların şematik görünüşü
Emülsiyonlar
Emülsiyon, karışmayan bir sıvının diğer bir sıvı
içerisinde üçüncü bir bileşen(emülgatör) yardımıyla dağıtılmasıyla oluşur. İlaç şekilleri içerisinde önemli bir sınıfı oluşturan emülsiyonlar, Becher'e göre14, bir sıvı içerisinde kendisiyle karışmayan en az bir başka sıvıyı damlacıklar halinde sıkı sıkıya bağlanmış olarak bulunduran ayrışık(hete
rojen) sistemlerdir. Sıvılardan biri diğer sıvının
içinde kürecikler şeklinde dağılmıştır ve dispers ya da iç faz olarak isimlendirilir. Bu sıvıyı
çevreleyen diğer sıvı ise dış fazdır15. Damlacık iriliği 0.2-50 µm arasında olan geleneksel emül-
siyonların stabilitesi üzerinde etkili pekçok etken
bulunduğundan iyi optimize edilmeleri gerekir.
Termodinamik olarak stabil olmayan böyle bir sis- teme emülgatör eklendiğinde dispers küreciklerin çevresinde film tabakası oluşur ve böylece koale- sans engellenir16,ı7.
Kozmetik emülsiyonlarda olması gereken özellik- ler şunlardır:
1) Fiziksel, kimyasal ve mikrobiyolojik olarak
dayanıklı olmalı
2) Duyarlılığa ve irritasyona yol açmamalı 3) İstenilen reolojik özelliklere sahip olmalı
4) Uygun koku ve görünüşe sahip olmalıdır
5) Nemlendirme, temizleme, yumuşatına, koruma gibi özelliklere sahip olmalı
6) Yumuşaklık, ipeksi dokunuş ve silinince çıkma
gibi özellikleri olmalıdır.
Kozmetik emülsiyonlarda vitamin E, jojoba, aloe ve gliserin gibi hammaddelerin yanısıra sistin, nükleik asit, enzimler, Çözünür kollajen ve elastin- den oluşan etken maddeler de kullanılmaktadır!O.
Mikroemülsiyonlar
Mikroemülsiyonlar yağ, su ve surfaktandan oluşan
ve formülasyon serbest enerjisi sıfır veya negatif olan, izotropik, şeffaf, dayanıklı ve damlacık iriliği 100-1000 A 0 arasında olan sistemlerdir18.
Herhangi bir alet kullanılmadan spontane olarak
,
FABAD J. İ'!uırm. Sci., 19, 153-165, 1994
oluşturulabilirler19-23. Emülsiyonlar farmasötik ve kozmetik deri bakım ürünlerinde, diğer dozaj şekil
lerine göre daha avantajlı oldukları için kul-
lanılır. İlacın deriye penetrasyonunu kolaylaştı
rırlar.
Çoklu emülsiyonlar
Çoklu emülsiyonlar (Y /S/Y veya S/Y /S) kozmetik uygulamalar için ideal sistemler olarak bildiril-
miştir. Bunun nedenleri şunlardırlS:
1) Etken maddeler üç değişik fazda çözündü- rülebilir. Örneğin S/Y /S çoklu ernülsiyonlarda suda çözünen iki değişik madde (protein, enzim, vita- min) ve yağda çözünen bir madde(parfüm) kullanı
la bilir.
2) Uygulama sonrası çok ince olan ara fazın kırılması, değişik yöntemlerle engellenerek gecik-
tirilmiş salım sağlanabilir.
3) Krem kıvamında viskoelastik yapılar elde edi- lebilir.
Üç çeşit çoklu emülsiyon tipi bilinmektedir: Dam-
lacık büyüklüğüne göre yapılan bu sınıflandırmaya
göre Tip A'da iri bir iç damlacık vardır, Tip B'de pekçok ufak iç damlacık vardır, Tip C'de ise çok
sayıda çok küçük damlacık hapsedilmiştir24-27.
Üç Fazlı Emülsiyonlar:
Friberg28 tarafından 1969'da su-paraksilen- oktaetilen glikol nonil fenol eter sisteminin iki
değil, üç fazı olduğu ve bu üçüncü fazın sıvı kristal
yapıda olduğu görülmüştür. Sıvı kristal yapıdaki
üçüncü fazın varlığı sistemin stabilitesini arhrmış
tır. Bu daha sonra diğer araştırmacılar tarafından
da gösterilmiştir29-31.
Niozomlar
Niozomlar çapları genellikle 25-5000 nm arasında değişen küresel veziküllerdir. Vezikü!ler, amfifi- lik maddelerin bir çifte tabaka(unilarne!lar vezi- kül), dört çifte tabaka(oligolame!lar vezikül) ve- ya çoklutabaka(multilamellar vezikül) oluştur-
mak üzere sıralanmasıyla oluşur. Genellikle iç ve
dıştaki yüzler hidrofilik karakterdedir, çünkü çekirdek ve dispersiyon ortamı genelde sudur.
Ayrıca oligo ve multilamellar veziküllerde lamel- ler arasındaki alanlar da hidrofiliktir. Lipofilik bölgeler ise, çift tabakalar arasıdaki alkil zincir- leridir. Niozomlarda hidtofilik ve lipofilik ilaç- lar hapsedilebilirler32-35.
Niozomlar, uygun nan-iyonik surfaktanlar kul-
lanılarak hazırlanırlar. En sık olarak kullanılan
surfaktanlar polioksietilen alkil eter, polioksieti:
len alkil ester ve sakkaroz diesterlerdir. Niozom-
ların kozmetik preparatlarda deri ve özellikle boynuzsu tabakanın özelliklerini iyileştirdiği bili- nir. Bunu da hem transepidermal su kaybını azal- tarak, hem de kaybolan deri lipidlerini tekrar ka-
zandırarak yapar. İlaç yüklenmiş niozomların
enfekte olmuş epidermal dokuyla etkileşmesi,
ancak ani ve güçlü bir sistemik etki göstermemesi istenir. Niozomların lipozomlara üstünlüğü, kul-
lanılan noniyonik yüzey etkin maddelerin fosfoli- pidlere göre çok daha dayanıklı olmasıdır36-37.
Niozomlarla ilgili çalışmalar, hemoglobin en- kapsülasyonu, kanser tedavisinde ilaç taşınması (doksorubisin, metotreksat) ve kozmetik uygulama- lara yöneliktir. Deriye uygulandıklarında niozom- lar, etken maddelerin epidermise geçişini kontrol eder, tahrip olmuş deriyi biyomimetik bir işlem so- nucunda onarır38.
Lipozomlar
Çift tabakalı fosfolipit mernbranlar, canlı doku
yapısındaki hücre membranlarına çok benzerler ve
kolaylıkla yapay olarak üretilebilirler. Fosfoli- pitlerin suda disperse edildikleri zaman bimo- leküler lipit tabakaları oluşturdukları gösteril-
miştir39. Oluşan yapılar, lipozomlar veya vezikül- ler olarak bilinirler. Ancak stabilitelerinin iyi ol-
maması nedeniyle farmasötik uygulamaları sınırlı kalmaktadır40.
Son yıllarda yumurta sarısı ve soya lesitini fosfoli- pitlerinden stabilitesi yüksek lipozomlar elde edi-
Memişoğlu ve Öner
lebilmektedir. Günümüzde pekçok etken madde li- pozomlar içerisinde doğrudan deriye uygulanabil- mektedir. Lipozomlara vitaminler, peptit ve pro- teinler gibi pekçok madde hapsedilrnektedir41-45.
Sıvı Kristaller
Sıvı kristaller, katı kristal ile izotropik sıvı hal
arasındaki maddenin dördüncü halidir. Bu faza mezomorfik faz denir. Sıvı kristaller tarafından
gösterilen bazı özellikler canlı sistemlerin özellik- lerine benzemektedir. Işık, ses, mekanik basınç, sıcaklık, elektrik ve manyetik alanlar ve kimya- sal çevredeki değişikliklerden büyük ölçüde etkile- nir. Bu özellikler canlı hücrelerin tipik özellik- leridir46-47.
Sıvı kristaller bir ara faz oldukları için bir krista- lin optik ve bir sıvının akış özelliklerini gösterir.
Bazı sıvı kristallerin dönmüş heliks yapısı dolayısıyla sıcaklık değişikliklerine yanıt vere- bildikleri bilinir. Sonuç olarak sıvı kristalce
kırılan ışığın dalga boyu sıcaklığa bağlı olarak
değişir. Eğer bu ışık görünür bölgede ise, gözle bariz bir renk değişimi görülür. Görünümlerine ek olarak
sıvı kristallerin kozmetik uygulamalarının pekçok
işlevsel üstünlükleri vardır. Sıvı kristal matrikse
alınan lipofilik maddeler sıcaklık ve ışık etkisin- den korunabilirler48-49.
Vitaminler, deri lipitleri, serbest radikaller ve an- tienlamatuar ilaçlar gibi lipofilik etken maddeler,
sıvı kristaller içerisinde verilebilir. Tek dezavan-
tajları, yüksek konsantrasyonda yüzey etkin madde içermeleridirSO.
Proteinlerle Formülasyon Sorunları
Proteinlerin yapısal karmaşıklığı formülasyon
geliştirme çalışmalarında pekçok zorluğa yol açar.
Proteinler, a-amino ve a-karboksil gruplarının bağlanması ile oluşmuş amino asit polimerleri olup, dört çeşit yapı gösterirler(Şekil 3):
a) Birincil Yapı: Amino asitlerin doğrusal dizilişi
dir. Belirli sayıda amino asitlerin belitli sayıda
---,.
fi
ve bir diziliş sırasına göre peptit bağları ile
birleşmelerinden oluşur.
Sekonder Yapı Tersiyer Yapı Kuatemer Yapı Şekil 3. Protein yapı çeşitlerinin şemaili;: görünüşü
b) İkincil Yapı: Düzenli ve tekrarlanan kıvrılma olayıdır(a-helezon ve fl yapıları gibi) ve yapı bir- birine yakın peptit gruplarının hidrojen bağlarıyla
birarada tutulmasıyla stabilize edilir.
c) Üçüncül Yapı: Sekonder yapı parçalarının kendi üzerine yumuşak şeklinde katlanması ile oluşan
globüler proteinlerdir. Birbirine uzak grupların et-
kileşmeleriyle stabilize olur.
d) Dördüncü! Yapı: Değişik polipeptit zincirlerinin alt birimlerinin oligomerik yapı oluşturmak üzere
polimerleşmesiyle oluşur ve sadece nonkovalan
bağlarla stabilize olurlar51
Üçüncül ve ikincil yapılar bozulduğunda protein de- natürasyona uğrar(Şekil 4).
Nativ
Denatüre/ açılmış
Şekil 4. Proteinin denatürasyonunun şematik görünüşü
!
FABAD]. Pharm. Sci., 19, 153-165, 1994
Formülasyon açısından proteinlerin degradasyonu önemli olup, nonkovalan ve kovalan yollarla olur.
Nonkovalan Degradasyon Yolları
1) Elektrostatik Güçler
Sadece bazik ve asidik yan zincirleri olan amino asitler bu güçlerden etkilenir. Proteinler sıcaklık
ve pH etkisiyle izoelektrik noktadan sonra denatüre olurlar. İzoelektrik nokta amino asitlerin elektrikçe nötr olduğu pH değeridir. Her amino asit için karakteristiktir. pH skalasının uç noktalarına doğru proteinin net yükü artar ve katlanmış protein
açılmaya başlar52-55.
2) Hidrojen Bağları ve Protein Hidratasyonu
Doğal proteinlerin ikincil yapılarında hidrojen
bağları bol miktarda bulunur ve bu da yapının oluş
masından sorumludur. Bir proteini oluşturan yak-
laşık 150 hidrojen bağından birkaçının kırılması
ile protein yapısı denatüre olmaz. Bir proteinin stabilitesi hidratasyon derecesi ile yakından ilgi- lidir. Bazı proteinlerin su içeriği onları 100°C'lik
ısıtmaya karşı bile korur56-57.
3) Hidrofobik Etkileşmeler
Hidrofobik etkileşmelerin protein denatürasyonu- na neden olduğu bilinmektedir. Pekçok proteinin nonpolar kısımları bir çekirdek etrafında dizilerek suyla etkileşmeyi önlerler. Hidrofobik etkileşme
ler bir başka denatürasyon şekli olan protein agre- gasyonunda önemli rol oynar. Kısmen veya tama- men dalları açılmış olan proteinin iç hidrofobik bölgesi suyla etkileşir. Bu, termodinamik açıdan
istenmeyen bir durumdur. Hidrofobik bölgenin çev- resinde su moleküllerinin yerleşmesini önlemek
amacıyla hidrofobik kısımlar kümeleşmeye baş
lar; bu da proteinin çözünürlüğünde bir azalmaya yol açar58-59.
Kovalan Degradasyon Yolları
Pekçok kimyasal reaksiyonun proteinleri etkile-
diği bilinir. Bunlar, deamidasyon, disülfür bağ değişimi, oksidasyon, 15-eliminasyon ve hidroliz- dir. İki veya daha fazla sistein içeren proteinlerin en büyük stabilite problemi, disülfür bağlarının ko-
runmasıdır. Ditiyoeritrol ve merkaptoetanol gibi redükleyici ajanlar disülfürleri dönüşümlü olarak tiol gruplarına çevirir. Oksidanlar ise, disülfürleri sülfinik ve sülfonik asitlere dönüştürür. Pekçok nük- leofil(siyanür, sülfit ve hidroksil iyonları) ve elektrofiller(protonlar, Hg+2, Ag+ gibi metal iyon-
ları) disülfürleri dönüşümlü olarak kırabilirler60-64.
Formülasyon Geliştirme Sırasında
Denatürasyon Tipleri
Sıcaklık, pH, tuzlar, basınç, ara yüzeyler, sürtünme gibi özelliklerin protein stabili lesini nasıl etki-
leyeceğini bilmek protein degradasyonunu en aza indirmeyi sağlayabilir.
Isı Denatürasyonu
Proteinlerin ısı ile denatürasyonu, formülasyon
geliştirme esnasında önemlidir, çünkü özellikle
hızlandırılmış stabilite çalışmalarında yüksek
sıcaklıklar kullanılır. Sıcaklık arthkça tüm pro- teinler biyolojik aktivitelerini kaybeder. Bu kayıp
geri döhüşlü veya geri dönüşsüz olabilir. Isı denatü- rasyonunun kapsadığı pekçok degradasyon yol-
larından dolayı, hızlandırılmış stabilite çalış
maları proteinler açısından pratik olmayabilir ve
yanlış yönlendirilmeye yol açabifü65-66.
Soğuk Denatürasyonu
Biyolojik materyallerin en etkin koruma ve sakla- ma yolu dondurmadır. Ancak düşük sıcaklıklarda
saklama sonucu oluşan denatürasyon geri dönüşlü
bir olay olmasına rağmen, bazı proteinlerde biyolo- jik aktivitede geri dönüşsüz bir kayba yol açar.
Soğuk denatürasyonundan korunmak amacıyla aşa
ğıdaki yollar izlenebilir:
1) Tampon sisteminde yüksek konsantrasyonlarda Na2HP04 kullanmaktan kaçınılmalıdır
2) Yüksek konsantrasyonda protein kullanılmalı
dır
3) Karbohidratlar, amino asitler ve polihidrik al- koller gibi kriyoprotektanlar kullanılmalıdır
Memişoğlu ve Öner
4) Dondurma işlemi, soğutma hızı ve inkübasyon
sıcaklığı ayarlanmahdır67-7D,
pH Denatürasyonu
Proteinler genellikle elektrostatik etkileşmelere bağlı olarak izoelektrik noktada en dayanıklı ve en az çözünür duru1]1dadırlar. Farmasötik dozaj
şekillerinde proteinin çözünürlüğü fazla sorun
oluşturmamaktadır, çünkü kullanılan protein mik-
tarı µg-mg sınırları arasındadır71-72,
Tuz Denatürasyonu
Tuzların proteinler üzerindeki en belirgin etkileri protein çözünürlüğünde değişiklik yapmalarıdır.
"Salting in" çözünürlükteki artışa, "salting out" ise azalmaya verilen addır. Protein çözünürlüğünde
tuzun yapısına bağlı olarak önemli değişiklikler
görülür, ancak bu değişiklikler protein yapısına bağlı değildir ve ancak yüksek tuz konsantrasyon-
larında oluşur(>0.15 M)
Tuzların eklenmesi protein çözünürlüğünü ve konfor- masyonunu değiştirir ve kümeler oluşturur. İkincil yapıdaki bu tip değişiklikler, biyolojik aktivitede kayba neden olurlar69-73.
Basınç ve Sürtünme Denatürasyonu
Albümin, Faktör VIII ve insülin gibi proteinler
yaklaşık 30 yıldır steril olarak süzülüp kullanıl
maktadır. Filtrasyon işlemi sırasında hızı arttır
mak için 'basınç uygulanır ve üç çeşit denatürasyon ortaya çıkabilir. Basınçla, sürtünme ile veya filt- reye adsorbsiyonla denatürasyon.
Çok yüksek basınç değerlerinde geri dönüşsüz
denatürasyon ortaya çıkar. Sürtünme denatüras- yonu karıştırma, tüpten akış, steril süzme ve ultra- filtrasyon işlemleri sırasında ortaya çıkar ve fibri- nojen, katalaz ve karboksipeptidazda olduğu gibi, aktivite kaybıyla kendini gösterir. Basınç ve sürtünme ile ortaya çıkan denatürasyon işlemleri
zamana bağımlıdır. Proteinler steril filtrasyon sı
rasında basınç ve kayma hızından dolayı denatüre olmazlar, çünkü uygulama süresi kısadır ve basınç
uygun sınırlar içindedir. Burada başlıca sorun, pro- teinlerin adsorbsiyona bağlı kaybıdır74-75.
Yüzey Denatiirasyonu
Proteinler amfifilik polielektrolitler olduğuna
göre, bir dereceye kadar yüzey etkinlik gösterir ve yüzeylere adsorbe olurlar. Adsorbsiyona bağlı de- natürasyon işlemi üç ana aşamada gerçekleşir:
1) Protein molekülünün ara yüzeye difüzyonu ve ad- sorbsiyonu
2) Ara yüzeyde polipeptit zincirlerinin açılması
(yüzey denatürasyonu)
3) Denatüre olmuş proteinin koagüle olması
Protein yapısındaki ilaçlar için yüzey denatüras- yonu daha çok sıvı/katı ve sıvı/hava ara yüzeylerinde ortaya çıkar. Yüzey denatürasyonuna yol açabilecek ana faktörler ise, membran filtrenin polimerik materyali, kullanılan kap, donanım ve
saflandırma sırasındaki çalkalamadır. Genel ola- rak proteinlerin yüzey adsorbsiyon ve denatürasyo- nu arayüzey yapısına, protein-protein etkileşme
lerine, zamana, sıcaklığa, pH'ya ve ortamın iyonik kuvvetine bağlıdır76-78,
Dondurarak Kurutma Denatürasyonu
Protein yapıdaki pekçok ilaç raf ömrünü uzatmak için liyofilize edilir. Eğer protein dondurarak ku- rutmaya karşı hassas ise kriyoprotektan ve/veya liyoprotektan eklenerek önlem alınabiJir79-80, Bun- lar, karbohidrat yapıda laktoz, mannoz ve treha- loz gibi maddelerdir.
Proteinlerin Salım ve Penetrasyon Özellikleri Deriye uygulanan bir molekül ilk olarak sebum, hücresel döküntüler, bakteriler ve deriyi kaplayan
diğer eksojen maddelerle temas eder. Difüze olabi- len molekülün bu aşamadan sonra izleyebileceği üç
giriş yolu vardır: Bunlar, kıl follikülleri ile bunla- ra bağlı yağ bezleri, ter kanalları ve stratum cor- neum arasındaki açıkhklardır81,
Ana hatları bu şekilde açıklanabilen perkütan ab- sorbsiyonu etkileyen pek çok faktör vardır. Bunlar,
FABAD /. Pharm. Sci., 19, 153-165, 1994
A). Deri yaşı: Çocuklarda, fetus' da ve yaşlılarda
normal veya iltihaplı deri geçirgenliği yetişkinle
re oranla çok daha fazladır.
B) Deri koşulları: Asit ve alkali maddeler engel hücreleri tahrip edip, perkütan permeasyonu arttı
rırlar. Genel olarak stratum corneum'da bozulmala- ra yol açan hastalıklarda perkütan absorbsiyon artar.
C) Bölgesel deri kısımları: Vücudun kısımlarına
göre derinin geçirgenliği değişir. Bu da stratum cor- neum kalınlığı, yapısı ve deri uzantılarının yoğun
luğuna bağlıdır.
D) Deri metabolizması: Deri, topik uygulanan
ilaçları etkisiz hale veya metabolitlerine çevire- rek terapötik etkiyi kontrol eder.
E) Dolaşım etkileri: Uygulama yerindeki kan akış
hızı etkilidir. Kan akış hızındaki artış, ilacın
dermiste kalış süresini azaltıp derideki konsantras- yon gradyanını arttırır.
F) Tür farklılıkları: Memeli derileri türlere göre büyük farklılık gösterir. Bunun sebebi, türler ara-
sındaki stratum corneum kalınlığı, ter bezi sayısı
ve yüzey alan başına düşen kıl folikülü farklı
lığıdır.
Deriye uygulanan kozmetik formülasyonlarda en çok kullanılan proteinlerden biri olan kollajenin perkütan absorbsiyonu ile igili pekçok araştırma
yapılmıştır. Huc ve arkadaşları82 biyosentetik olarak hazırlanmış ve [14C] ile işaretlenmiş asitte çözünen kollajen ve [125!] bağlanmış kollajenin canlı sıçan derisine penetrasyonunu incelemiş ve [14C] ile
işaretli kollajenin absorbe olmadığını, ancak iyo- dun hızla absorbe edildiğini bulmuştur. Kollajenin iyotu salıverdiği ve bu küçük molekülün de deriye penetre olduğu bulunmuştur.
Nagelschmidt ve Struck83, stratum corneum'a
yapılan uygulamadan sonra epidermiste eser mik- tarda kollajene raslamıştır, dermiste ise hiç rast-
larnamıştır. Tronnier'in84 araşhrmasında ise yara, keloid ve pirürit gibi etkenlerin giderilmesiyle
iyileştirilmiş deride kollajen penetrasyonunda ar-
tış görülmüştür. Chvapil ve Eckmeyer8 yapılan
araştırmaları taradıktan sonra, 1.<ollajenin epider- mise geçtiğine dair bulguların çoğunun otoradyogra- fi için dondurulmuş dokuların dilimlenmesi sıra
sında oluşan safsızlıktan ileri geldiğini belirt-
mişlerdir. Johnson85 tarafından topik uygulamada penetrasyon derinliği, kollajenin soyulmuş deriye
geçişi incelenerek bulunmuştur. Johnson'un bulgula-
rına göre kollajen, stratum corneumun ancak üst ta-
bakalarına ulaşmaktadır.
Coapman ve Lichtin86 tarafından yapılan çalışmada ise, doğal kollajen ve kollajen alfa zin- cirlerinin dermise geçtikleri bulunmuştur. Tam bir
kanıt olmamasına rağmen epidermise penetre ola- bilen % 30 oranında tritium işaretli kollajen alfa zincirlerinin proteazlar tarafından parçalanmış
küçük peptidler olduğu düşünülmüştür. Surfaktan- ilaç etkileşmeleri(kompleksleştirme ve çözündür- me gibi) genellikle permeasyonu azaltır. Ancak bu, ilaç tamamen çözünmüşse geçerlidir. Eğer sistem ilaca doyduysa, bu gerçekleşmez. Surfaktan ile deri
arasındaki etkileşenler ise penetrasyonda artışa sebep olur.
Kullanım Alanları
Protein içeren kozmetik preparatlar:
1) Doğal nemlendirici olarak
2) Deri elastikiyetini arttırmak amacıyla 3) Kuru ve çatlanuş derilerin tedavisinde 4) Dış etkenlere karşı koruyucu olarak
5) Deterjanlarla oluşan irritasyonda tedavi ama-
cıyla kullanılırlar.
Bu preparatlara ilişkin örnekler Tablo: l'de görül- mektedir.
Tartışma
Deriye uygulanan protein içeren kozmetik prepa-
ratların kullanılışı son yıllarda çok artmıştır. Bu
Memişoğlu ve Öner
Tablo 1. Piyasada Bulunan Peptit, Protein ve Aminoasit İçeren Preparatlara Örnekler87-89.
Preparat Özelliği İçeriği
Traş sonrası preparatı nemlendirici+cilt yumuşatıcı alkolde çözünen kollajen
Güneş sonrası kozmetik maske nemlendirici+serinletici
Banyo köpüğü yumuşatıcı
Gençleştirici krem cilt elastikiyeti sağlayıcı kırışık giderici
Besleyici krem nemlendirici
El ve vücut besleyici krem nemlendirici+besleyici
Güneş sonrası losyonu UV'ye marl)Z kalan ciltleri koruyucu
Nemlendirici krem nemlendirici
mentol türevli kollajen lifleri hidrolize buğday proteini kollajen(Collasol % 1)
lizin + arjinin
palmitoil hidrolize hayvan proteini desamidokollajen
çözünür buğday proteini(Tritisol) Deri yapısını onarıcı krem nemlendirci+hücre yenileyici hidrolize buğday proteini(V egepro)
Noniyonik nemlendirici nemlendirici Proteinli traş sonrası losyonu nemlendirici Tüm hava koşullarında cilt koruyucu cilt koruyucu
Bronzlaştırıcı losyon bronzlaştırıcı
Protein cilt kremi nemlendirici + koruyucu Kuru cilt losyonu kuru ciltleri nemlendirici
Lip_ozom nemlendirici
Zyderm® hücre yenileyici
Deodorant terlemeyi önleyici
preparatların hızla artışına karşın pekçok formülasyon sorunu sözkonusudur ve literatürde rastlanan bilimsel çalışmalar piyasaya çıkan
ürünlere oranla çok azdır. Eldeki verilere göre formülasyon sırasındaki sorunlar protein yapısının
iyi aydınlatılması sonucu çözülebilmekte ve
değişik etkenler gözönünde bulundurularak formülasyon tasarımı yapılabilmektedir. Bir diğer
önemli konu ise, proteinlerin penetrasyonudur. Bu konuda yapılmış az sayıdaki çalışmaya göre bazı tartışmalar olsa bile, proteinlerin deriye penetre
hidrolize kollajen kollajen hidrolizatı türevi kollajen hidrolizatı türevi
oleil fosfolipid polipeptit kompleksi oleil fosfolipid polipeptit kompleksi oleil fosfo)ipid polipeptit kompleksi L-Arjinin, kazein
çözünür kollajen a-Fenetilserin
olmadığı, ancak küçük peptitlerin dermise
geçebildiği sonucu ağırlıktadır.
Gerek formülasyon, gerekse penetrasyon ile ilgili
sorunların çözümüne yönelik olarak tercih edilen ilaç taşıyıcı sistemler olan mikroemülsiyonlar, çoklu emülsiyonlar, niozomlar, lipozomlar, jeller ve sıvı kristaller, kozmetik formülasyonlarda da
kullanıma girmişlerdir. Gelecekte de daha pekçok
yapımın üretilmesine olanak sağlayacaklardır.
FABAD J. Plıarnı. Sci., 19, 153-165, 1994
Referanslar
1. Riso, R., "Protein Derivatives in Cosmetics", Cos-
nıet. Perf., 89, 45-48, 1974.
2 Kuchel, P.W., Ralston, G.B., Schaunı's Outline Theory and Problenıs of Bioclıenıistry, New York, McCraw-Hill lnc., Chapter 5, pp. 113-116, 1988.
3. Beyssac, I., "Alcool, Glycosaminoglycanes, Colla- gene: Nouvelles Applications Cosmetiques", Bull.
Teclı. Gattefosse Report, 77-87, 1984.
4 Flandin, F., Herbage, D., Beyssac, L, Glas, B., "Age Related Changes in the Thermal Stability of Rat Skin Collagen", Bııll. Teclı. Gnttefosse Report, 89- 99, 1984.
5. Rigby, R, "Aging Patterns in Collagen ln Vivo and in Vitro", J. Soc. Cosmet. Clıenı., 37, 199-210, 1986.
6. Kaplan, D. G., Furtek, A.B., Aklonis, ).)., "Crosslin- king in Collagen(rat tail tendon)", J. Sac. Cosmet.
Chem., 82, 163-169, 1987.
7. Idson, B., "Natural Moisturizers for Cosmetics", Drug Cosm. Ind., 5, 24-26, 1985.
8. Chvapil, M., Eckmyeer, Z., "Role of Proteins in Cosmetics", Int. J. Cosmet. Science, 8, 41-49, 1987.
9. Idson, B., "Skin Treatment in Cosmetics: An Over- view", Drug Cosm. Ind. 1, 26, 28, 30 32, 1987.
10. Wachter, R., "Proteins in Cosmetics" Skin Care Forum, 4, 2, 1992.
11. Lower, E. S., "Elastin in Cosmetics" Drııg Cosm.
Ind., 9, 41-42, 44, 46, 48, 1987.
12. Brooks, G. J., "Keratin is Cosmetics", Drug Cosnı.
Ind., 10, 38-40, 116-117, 1983.
13. ldson, B., "Skin Care Products: Formulating for Today", Drug Cosm. Ind., 1, 26-27, 77-78, 1989.
14. Becher, P., Emulsions: Theory and Practice, 2nd·
Ed., New York, Reinhold Publ. Co., 1966.
15. Bhargava, H. M., "The Present Status of Formula- tion of Cosmetic Ernulsions", Drug Dev. lnd.
Pharm., 13, 2363-2387, 1987.
16. Lower, E. S., Water in Oil Cosmetic Emulsions, Par!!", Drug Cosm. Ind., 2, 42-43, 126-129, 1972.
17. Lower, E. S., "Water in Oil Cosmetic Emulsions, Part il'', Drug Cosm. Ind., 3, 58, 62, 64, 125-126, 1972.
18. Tadros, T. F., "Future Developrnents in Cosrnetic Formulations", Int. J. Cosmet. Sci., 14, 93-111, 1992.
19. Jayakrishnan, A., Kalairasi, K, Shah, D. O., "Mic- roemulsions: Evolving Technology for Cosmetic
Applications", J. Sac. Cosnıet. Clıerıı., 34, 335-350, 1983.
20. Osborne, D.W., Ward, A. ). L, O'ncil K )., "Mic- roemulsions as Topical Drug Delivery Vehicles I.
Characterization ofa iviodel Systen1", Drug Deve- İop. Iııd. Plıarm, 14, 1203-1219, 1988.
21. Denis, J ., "How to Formulate Superior Microemul- sions'', Bull. Tech. Gattefosse Report, 79-88, 1988.
22. Eln1alan, P., "Essais de Formulation de Iviicroe- mulsions Gelifi6e", Bııll. Tech. Gattefossi Report, 85-88, 1989.
23. Rosano, H. L., Cavallo, ].!., Chang, D. L., Whittcn,
J. H., "Microernulsions: A Comrnentary on Their Preparation", J. Soc. Cosmet. Clıem., 39, 201-209, 1988.
24. Seiller, M., Vaution, C., De Luca, M., "Contribution a la Connaisancc Des :Emulsions Multiples", Bııll.
Teclı. Cattefosse Report, 27-31, 1987.
25. Florence, A. T., Whitewill, D., "The Formulation and Stability of Multiple Emulsions'; Iııt.]. Plınrnz.,
11, 277-308, 1979.
26. De Luca, M., Grossiord, ). L., Medard, J.M., Vau- tion, C., "A Stable W /0/W Multiple Emulsion",
Cosnıetics Toiletries, 105, 65-69, 1990.
27. Prybilski, C., De Luca, M., Grossiord, J.L., Vaution, C., "W /O/W Multiple Emulsions-Manufacturing and Formulation Considerations", Cosmetics Toi- letries, 106, 97-100, 1991.
28. Friberg, S., "Three-phase Emulsions", J. Soc. Cos- met. Clıem., 30, 309-319, 1979.
29. Friberg, S., Mandell, L., Larrson, M., "Mesomorp- hous Phases, a Factor of Importance for the Pro- perties of Emulsions", J. Colloid Interface Sci., 29, 155-156, 1969.
30. Bulut, F., Yalabık-Kaş, H.S., Hıncal, A.A., "Phase Studies of Ethoxylated Surfactants- Oil Water- Undecylenic Acid~ ]. Plıarm. Plıarmacol. 35, 3486- 3488, 1983.
31. Bonina, F., Bader, S., Montenegro, L., Scrofani, C., Visca, H., "Three Phase Emulsions for Controlled Delivery in the Cosmetic Field", Int. J. Cosnzet.
Science, 14, 65-74, 1992.
32. Junginger, H.E., Hoffland, H.E.J., Bouwstra, j.A., "Li- posomes and Niosomes: Interactions With Human Skin", Cosmetics Toiletries, 106, 45-50, 1991.
33. Abate, K., "Non-Phosholipid Liposomes in Cos- rnetics", Soap, Cosmetics, Chemical Specialites, 5, 37-40, 1993.
Memişoğlu ve Öner
34. Handjani-vila, R.M., "Non-ionic Vesicles as Drug Delivery Systems", in Hıncal A. A., (ed), Minutes- Sth International Pharmaceutical Technology Sym- posium, Editions de Sante Paris, pp. 213-227, 1990.
35. Bouwstra, J.A., Holand, H.E.j., Goorls, G.S., jungin- ger, H.E., "Characterisation of Niosomes", Emul- sions-A Fundamental and Practical Approach, Holland, Kluwer Academic Publ., pp. 227-238, 1992.
36. Florence, A.T., Baillie, AJ., "Non-ionic Surfactant Vesicles-Alternatives to Liposomes in Drug Deli- very", Novel Drug Delivery and Its Tlıerapeutic
Application, Landon, john Wiley & Sons Ltd., pp.
282-296, 1989.
37. Baillie, A.J., Florence, A.T., Hume, L.R., Muirhead, G.T., l{ogerson, A., "The Preparation and Proper- ties of Niosomes- Nan Ionic Surfactant Vesicles", ]. Plıarm. Plıarmacol., 37, 863-868, 1985.
38. Hofland, H.E.j., Bouwstra, J.A., Gooris, G.S., Spies, F., Talsrna, H., Junginger, J.E., "Nonionic Surfac- tant Vesicles: A Study of Vesicle Formation, Cha- racterisation and Stability," J. Colloid Interface Sci., 161, 366-376, 1993.
39. Suzuki, K., Sakon, K., "The Application of Liposo- mes to Cosmetics", Cosmetics Toiletries, 105, 65- 66, 68-69, 74-76, 78, 1990.
40. Nusimovich, A.D., Casado, FJ, "Complex Liposo- mes", Drug Cosm. Ind., 9, 37-42, 1989.
41. Colome, C., Alsina, M.A., Hano, I., Reig, F., "Inte- raction of Aminoglycosides and . Colistin with Model Membranes: Liposomes and Monolayers", Int.]. Cosmet. Science, 90, 59-71, 1993.
42. Lautenschlager, H., "Liposomes in Dermatologi- cal Preparations, Part I", Cosmetics Toiletries, 105, 89-96, 1990.
43. ,Lautenschlager, H., "Liposomes in Dermatologi- cal Formulations, Part II", Cosmefics Toiletries, 106, 79-93, 1991.
45. Strauss, G., "Liposomes: From Theoretical Model to Cosmetic Tool", J. Soc. Cosmet. Chem., 40, 51-60 1989.
46. Gioca, G., Calvo, L., "Liquid Crystals and Cosmetic Applications", Cosmetics Toiletries, 105, 57, 6Ü-62, 1969.
47. Loll, P., "Liquid Crystals in Cosmetic Emulsions", in ·cosmetics Conference Notes, London, 1993.
.48. Dahrns, G., "Properties of Oil in Water Emulsions with Anisotropic 1:-amellar Phases", Cosmetics Toi- letries, 101, 113-115, 1986.
49. Bouwstra, J.A., jousma, H., Van Der Meulen, M.M., Vijvenberg, C.C., Gooris, G.S., Spies, F., )un·
ginger, H.E., "A Structural Study of the Mesopha- ses of Two Oxyethylene Alkyl Ether-Decane- Water Systems, A Comparison Between Techni- cal Grade C12E07 and Pure C12E06'', Colloid Polym. Sci., 267, 531-538, 1989.
50. Bevacqua, A.J., Lahanas, K.M., Cohen, I.D., Cioca, G., "Liquid Crystals in Multiple Emulsions", Cos- metics Toiletries, 106, 53-56, 1991.
51. Kuchel, P.W., Ralston, G.B., Schaum's Outline Se- ries - Theory and Problems of Biochenıistry, New York, McGraw Hill ine., Chapter 4, pp. 819-92, 1988.
52. Pezzuto, J.M., johnson, M.E., Manasse, H.R., Jr., Biotechnology and Pharmacy, New York, Chap- man and Hail, pp. 117-151, 1993.
53. Matthew, J.B., Gurd, F.R.N., "Stabilisation and Destabilisation of Protein Structure by Charge In- teractions", Methods Enzym., 130, 437-453, 1986.
54. Stigter, D., Dili, K.A., "Charge Effect on Folded and Unfolded Proleins", Biochemistry, 29, 1262- 1271, 1990.
55. Anderson, D.E., Becker, W.J., Dahiquist, F.W.,
"pH-Induced Denaturation of Proteins: A Single Salt Bridge Contributes 3-5 kcal/ mole to the Free Energy of Folding of T4 Lysozyme", Biochemistry, 29, 2403-2408, 1990.
56. Perutz, M.F.1 "Electrostatic Effects in Proteins", Science, 29, 1187-1191, 1978.
57. Rupley, J.A., Carreri, G., "Protein Hydration and Function", Advances in Protein Chemistry, 41, 37- 172, 1991.
58. Mitraki, A., King, )., "Protein Folding Intermedia- tes and Inclusion Body Formation", Bio- Technology, 7, 690-697, 1989.
59. jaenicke, R., Rudolph, R., "Refolding and Associa- tion of Oligomeric Proteins", Methods Enzynı., 131, 218-250, 1983.
60. Geiert, )., "Overview of the Stability and Handling of Recombinant Protein Drugs", J. Parenteral Sci.
Tech., 43, 220-224, 1989.
61. Wetzel, R., "Harnessing Disulfide Bonds Using Protein Engineering", Trends Biochemical Sci., 12, 478-482, 1987.
62. Srinivasan, N., Sowdhamini, R., Ramakrishnan, C., Balaram, R., "Conformation of Disulfide Bridges in Proteins", Int. J. Peptide Protein. Res., 36, 147-185, 1990.
