REAKTİF VE ÇÖZELTİ HAZIRLANMASI

REAKTİF VE ÇÖZELTİ HAZIRLANMASI

Doç. Dr. Hilâl Özdağ

GÜVENLİ VE ETKİN

LABORATUVAR UYGULAMALARI

111-546

Çözeltiler

• Tampon çözeltiler pH’sı ayarlanmış çözeltilerdir.

• Hücreleri yıkamak, DNA’yı kesmek, elektroforez yapmakta kullanılırlar.

• Kaliteli hazırlanmış çözeltiler sonuçlarınızın

kalitesinin güvencesidirler.

İhtiyaçlarınızı Belirleyin

• Kullanacağınız protokolü okuyup kullanılan çözeltileri listeleyin.

• Her çözeltiden ne miktarda hazırlamanız gerektiğini belirleyin.

• Hazırlayacağınız çözeltilerin konsantre olup olmaması gerektiğini öğrenin.

• Gerekli kimyasalların labda bulunup bulunmadığını

öğrenin.

GÜVENLİK

• Çalıştığınız kimyasalın bileşenlerini ve olası zararlarını öğrenin.

– Kimyasallarla beraber gelen MSDS’ler lab protokol dosyasına konur. Kullanacağınız kimyasalın MSDS’si ne diyor okuyun,

öğrenin.

– Şişe üzerindeki güvenlik işaretlerine dikkat

edin, okuyun.

GÜVENLİK

• Kimyasalları hangi şartlarda

taşıyacağınızı, kullanacağınızı öğrenin

– Eldiven takın – Gözlük takın

– Çeker ocakta çalışın – Maske takın

– Gerekiyorsa hazırladığınız solüsyonun

etiketinin üzerine uyarı yazın

GÜVENLİK

http://www.ehs.ucsf.edu/Manuals/GloveSelectionGuide.pdf

Bazı Zararlı Reaktifler

• Akrilamid: Nörotoksin. Tartarken maske takılmalı.

• EtBr: Mutajen

• Fenol: Korozif, cildi yanıklarına neden olur. Çeker ocakta çalışılmalı.

• SDS: Solunum yollarını tahriş eder.

Maske ile tartılmalı

Çeker Ocak Nasıl Kullanılır?

• Çeker ocağı aç. Çalışınca sesini duyacaksın.

Çeker ocak yanında, yakınında klima veya fan çalıştırılmamalıdır.

• Çeker ocağın ön paneli çene seviyesinin altına kadar indirilmiş olmalıdır.

• Ocağın en az 15-20 cm içinde çalışılmalıdır.

• Ocağın içinde bırakılacak malzemeler hava

akışını etkiler. Ocak boş bırakılmalıdır.

SU

• Musluk su: Bulaşık yıkamak için. Yıkanan cam malzemeler mutlaka distile sudan geçirilmeli.

• Distile su: Reverse osmosis. Rutin çözelti ve tamponlar için uygun.

• Deionize su: Hücre kültürü, biyokimyasal reaktifler ve tampon çözeltiler için

• Ultra saf su: adsorption, uv oksidasyonu,

bazı özel uygulamalar için

Plastik ve Cam Malzeme

Cam Malzeme

• Karıştırmak için

– Beher: Katı kimyasalların çözülmesi için en sık kullanılan beherdir. Cam veya plastik olanı kullanılabilir.

– Erlen: Çözelti hazırlanırken gaz çıkışı olacaksa erlen tercih edilmelidir.

• Karıştırma için kullanılmaması gereken:

– Mezür

Cam Malzeme

• Çözelti saklamak için

– Vidalı kapaklı şişeler: “Duran” şişeler – Hücre kültürü besiyeri şişeleri

• Çözelti saklamak için kullanılmaması gerekenler:

– Kavanozlar

– Vida kısmı zayıf olan kapaklı şişeler

HESAPLAMA

• Çözelti hazırlarken gr, ml, l vs tartım ve hacim ölçüleri değildir bilinmesi gereken.

• Çözeltiler konsantrasyon (molarite)

bilgileri üzerinde hazırlanır.

FORMÜLLER

• Molarite (M)= mol/lt

• mol= gr/MA (moleküler ağırlık)

• M1xV1=M2xV2

Normalite

• Molarite Bir litre çözeltide çözünmüş olan maddenin mol sayısı olarak tarif edilebilirken normalite çözeltinin bir litresinde çözünen maddenin eşdeğer- gram sayısına verilen addır.

• HCl için molarite normaliteye eşit iken,

H

SO

için normalite molaritenin iki

katıdır.

Yüzde %

• W/V: 100 ml içindeki gr miktar

• V/V: 100 ml içindeki ml miktar

• W/W: 100 gr içindeki gr miktar (%10 w/w sukroz solüsyonu. 10 gr sukroz

tartılıp üzerinde 90 gr su eklenir. Teorik

olarak 1 ml su 1 gr suya denktir.

Seri Dilüsyon

• Stok solüsyon

• Dilüsyon faktörü

• Dilüsyon solüsyon; su, stok solüsyonun hazırladığı çözücü, deneyde kullanacağınız besiyeri veya tampon çözelti.

• Hacim; uygun hacimli tüpler kullanılmalı.

• Tüpler; dilüsyon tüpleri önceden hazırlanıp üstleri yazılmalı.

• Pipetler; Pipet veya pipet uçları her dilüsyonda

değiştirilmeli.

Tartım ve Karıştırma

• Tartım

– Tartım kağıdı/kabı – Spatula

– Mezür

– Beher/Erlen

– Manyetik karıştırıcı – Balık

– Kağıt havlu

– Deionize su

Tartım

• Eldiven giy

• Tartacağın kimyasal şişesinin üzerini uyarılar için oku gerekiyorsa maske tak.

• Kimyasalı ilk defa sen açıyorsan üzerine açma tarihini ve ismini yazmayı unutma.

• Tartıyı aç

• Tartım kağıdı/kabının darasını al

Tartım

• Spatüla yardımı ile gerekli miktardaki kimyasalı tart (kimyasalı şişesinden dökerek tartım kabına alma).

• Fazla kimyasalı eğer kontamine olmadıysa

geri şişeye koy (Kimyasal hidroskopik ise

şişesine geri koyulmaz).

Tartım

• Kimyasalın ağzını kapayıp kimyasal dolabındaki yerine mümkün olduğunca kısa sürede yerleştir.

• Tartıyı kağıt havlu veya fırça ile temizle.

• Etrafa dökülen kimyasal varsa sil.

• Tartım tepsisinin altını temizle.

• Tartım tezgahında kağıt havlu, tartım kap/kağıdı, spatüla vs bırakmadan tezgahı temiz olarak terk et.

• Eğer tarttığın kimyasalı hemen çözeltiye

alamayacaksan üzerini streç film ile kapla.

Karıştırma

• Mezür üzerini streç film ile sallama bir karıştırma metodu değildir!

• Manyetik karıştırıcı kullan.

• Son hacmin %80’i kadar suda çözmeye başla.

• Solüsyonun içine balığı at. Karıştırıcıyı aç, hızını yavaşça arttır.

• Zor çözünen maddeler için ısıtarak karıştırma

denenebilir. Ancak bu solüsyonların pH’sı solüsyon

ısısı oda sıcaklığına düşünceye dek ölçülmemelidir.

pH

• pH metrenin en hassas parçası elektrodudur.

• Genellikle ucu içi nötral (3M KCL) bir solüsyonla dolu plastik bir kılıf içinde saklanır.

• pH metrenin kullanacağınız düğmeleri;

standby, calibrate, pH

• pH metre günlük olarak en az 2 tampon

çözelti ile kalibre edilmelidir (4, 7, 10)

pH

• pH eriyebilirliği etkiler. 0,5M EDTA pH 8.0 olmadan erimez.

• pH ortam ısısından etkilenir. Standart

tamponlarla çözeltinizin aynı ısıda

olmasına dikkat edin.

pH metre kalibrasyon

• İhtiyacınız olanlar

– pH 4, 7, 10 standart solüsyonlar (4 ve 10 yeterli olacaktır)

– 3-4 tane beher – Kağıt havlu

– Distile su piseti

pH metre kalibrasyon

• Elektrodu pisetle beherin içine doğru birkaç kez yıkayın.

• pH metre stanby’da olmalı bu aşamada.

• Elektrod üzerinde fazla sıvıyı kağıt havlu ile alın.

• Beher içine 3-4 cm pH4 standardından ekleyin. Elektrodu beher içine daldırın.

• Kalibrasyon düğmesine basın.

• pH 4’ü görene dek bekleyin.

pH metre kalibrasyon

• Standby’a basın.

• Elektrodu distile su ile yıkayıp kurulayın.

• Temiz behere pH10 standardı koyun, elektrodu daldırıp pH10 oluncaya dek bekleyin.

• Standby’a basın. Elektrodu yıkayıp kuruladıktan sonra KCl solüsyonu içine koyun.

• Standart solüsyonların pH’sını okuyup doğru okuyup okumadığını kontrol edin.

• Yanlış okuma durumunda prosedürü tekrar edin.

pH Ölçümü

• İhtiyacınız olanlar:

– Manyetik karıştırıcı – Balık

– Pastör/transfer pipeti – Konsantre HCl (12.1M) – 1M HCl

– Konsantre NaOH (5 veya 10M)

– 0.1M NaOH

pH Ölçümü

• Solüsyon manyetik karıştırıcıda yavaş yavaş karıştırılır.

• pH elektrodu kabından çıkarılıp standby halinde iken distile su ile yıkanıp fazla sıvı kağıt havlu ile silinir.

• Elektrod pH’sı ölçülecek solüsyonun içine daldırılır (balığın elektroda çarpmamasına özen gösterilir).

• pH ölçülür.

pH Ölçümü

• Alınan ilk pH okumasına göre ayarlamak istediğiniz pH değerine uygun olarak NaOH veya HCl ile pH ayarı yapılır.

• NaOH veya HCl aktarımında pastör veya transfer pipeti kullanılır.

• Eğer pH değerindeki farklılık 1 birimin

üzerindeyse konsantre NaOH veya HCl 1

birim veya altındaysa seyreltik solüsyonlar

kullanılmalıdır.

pH Ölçümü

• pH istenilen değere geldiğinde ph metre standby’a alınır.

• Elektrod çözeltiden çıkarılıp distile su ile yıkandıktan sonra kağıt havlu ile kurulanıp içinde 3 M KCl bulunan saklama kılıfına konur.

• Hazırlanan çözelti mezüre konup hacim

tamam %100’e tamamlanır.

pH Ölçümü

Olası Problemler

• Elektrod: çatlak veya kırık olmamalı.

• Standartlar: taze olmalı. Kullanılan standartlar ana şişeye geri dökülmemeli.

• Isı: Çözeltinin ısısı oda sıcaklığında olmalı pH ölçümü sırasında.

• Saklama tamponu: Elektrodun ucunun

içinde bulunması gereken tampon

kuruduysa elektrod çalışmaz hale gelir.

Sterilizasyon

• OTOKLAV

– Birçok tampon çözelti

– Bakteri ve maya besiyerleri

Sterilizasyon

• OTOKLAVA UYGUN OLMAYANLAR

– Deterjan içeren çözeltiler

– Organik çözeltiler (fenol dahil)

– Serum, vitamin, antibiyotik ve protein

benzeri ısıya dayanıklı olmayan moleküller – Memeli, bitki ve böcek besiyerleri

– HEPES içeren çözeltiler

– DTT veya -mercaptoetanol içeren

çözeltiler

OTOKLAV

• Şişenin ¼’ünü boş bırakın. Taşmaya karşı.

• Şişe kapakları sıkıca kapatılmamalı gevşek bırakılmalıdır ki basınç oluşmasın.

• Otoklava koyduğunuz bütün malzemelerin bir köşesine otoklav bandı yapıştırılmalı ki malzemenin sterilize edildiği anlaşılsın.

• Otoklavı boşaltırken ısıya karşı korumalı

eldiven giyin.

OTOKLAV

• Otoklavdan şişeleri çıkarırken kapaklarını sıkılaştırın.

• Çözeltileri oda sıcaklığında soğumaya

bırakın. Doğrudan soğuk ortama almayın,

cam şişeler çatlayabilir.

OTOKLAV

Çökelti, kahverengileşme ve substrat yıkımı olmaması için

• Glukozu aminoasit/pepton veya fosfatlı bileşiklerden ayrı olarak otoklavlayın.

• Fosfatı aminoasit/pepton veya diğer mineral tuz bileşiklerinden ayrı olarak otoklavlayın.

• Mineral tuz bileşenlerini agardan ayrı olarak otoklavlayın.

• pH’sı 7.5’den yüksek olan besiyerlerini otoklavlamaktan kaçının. Nötral olarak otoklavladıktan sonra steril bazik solüsyon ile pH ayarı yapın.

• pH’sı 6’nın altında olan agar çözeltisini otoklavlamayın.

FİLTRE STERİLİZASYONU

• Sıvı ısıya dayanıklı değil veya uçucu ise veya 20 ml’den az hacimde ise filtre ile sterilizasyon tercih edilmelidir.

• Solüsyon vakum yardımıyla 0.2 veya 0.1 m por çaplı filtreden süzülür.

• Virüsler filtre sterilizasyonu ile uzaklaştırılamaz.

• Viskoz solüsyonlar önce 0.4 m filtreden

sonra da 0.2 m filtreden geçirilmelidir.

FİLTRE STERİLİZASYONU

• Tek kullanımlık steril filtrasyon üniteleri.

• Cam filtrasyon üniteleri (Filtreleri tek kullanımlık).

• Şırınga uyumlu filtreler.

Çözeltilerin saklanması

• Besiyerleri +4oC’de saklanır.

• Tampon çözeltiler +4oC veya oda sıcaklığında (protokole bakılmalı).

• Işığa duyarlı reaktifler amber renkli

şişelerde (Alüminyum folyo ile kaplanmış

şişelerde) saklanmalıdır.

Tampon Çözeltiler Ne Zaman Atılmalı

• Renkleri bozulduğunda: Solüsyonun normaldeki rengini bilmelisiniz.

• Kontaminasyon: Küf, bakteri veya tanımlanamayan herhangi yabancı materyel görüldüğünde solüsyonu dökmek için ikinci bir defa düşünmeye gerek yoktur.

• Çökelti: Tuz çökeltisi 37oC su banyosunda çözülür.

Çökelti kalıcı ise solüsyon dökülmelidir. Kontaminasyon ile

çökeltiyi birbirinden ayırmak için bir damla solüsyon lama

damlatılıp lamelle kaplandıktan sonra 100X’da mikroskop

altında incelenmeli. Kristal yapı çökeltiyi, küçük düzgün

cisimcikler kontaminasyonu işaret eder.