ÖZET
Taşların oluşumuyla ilgili olarak birçok teori ortaya atılmıştır. Bu teorilerden biri de inhibitör eksikliği teorisidir. Bu bağlamda eser elementlerin taş oluşumunda inhibitör etkileri olabileceği varsayımı gündeme gelmiştir. Çalışmamızdaki amaç, belirtilen elementlerin üriner sistem taşlarında inhibitör etkilerini araştırmaktır.
Bu çalışmada kurşun (Pb), çinko (Zn), demir (Fe), magnezyum (Mg) ve bakır (Cu) elementleri, üriner sistem taş hastalarının serum, idrar örneklerinde ve taşlarında alevli atomik absorpsiyon spektrofotometrisi (FAAS) ile tayin edilmiştir.
Çalışılan örneklerde organik maddeler nedeniyle girişimlerin söz konusu olması (FAAS’de) ve cihazın bazı elementler için yeterli tayin sınırına sahip olmaması nedeniyle ‘Standart İlave Metodu’ uygulandı.
FAAS yöntemiyle patolojik olarak böbrek taşı hastası ve geçmişinde böbrek problemi olmamış (kontrol grubu) sağlıklı kişilerde (34 + 26); idrar, kan serumu ve hastaların taş örneklerinde eser elementlerin (Pb, Zn, Fe, Mg ve Cu) analitiksel değerlendirmesini bu çalışmamızda gerçekleştirdik. Çalışmamızda kan serumundaki Pb, Zn, Fe, Mg ve Cu için hasta grubunda konsantrasyonları 1.17 ± 0.39 µg/L, 0.86 ± 0.64 µg/L, 5.31 ± 4.21 µg/L, 16.7 ± 5.78 µg/L, 0.49 ± 0.18 µg/L, kontrol grubunda ise 0 µg/L, 2.18 ± 1.39 µg/L, 6.32 ± 3.30 µg/L, 15.1 ± 3.00 µg/L, 0.36 ± 0.15 µg/L’dir. İdrardaki Pb, Zn, Fe, Mg ve Cu için hasta grubunda konsantrasyonları ise 0.12 ± 0.09 µg/L, 0.016 ± 0.021 µg/L, 0.07 ± 0.12 µg/L, 2.32 ± 0.52 µg/L, 0.03 ± 0.02 µg/L, kontrol grubunda ise 0.06 ± 0.06 µg/L, 0.05 ± 0.04 µg/L, 0.09 ± 0.10 µg/L, 4.79 ± 2.98 µg/L, 0.04 ± 0.01 µg/L’dir. Ayrıca hasta grubunun taş analizlerindeki Pb, Zn, Fe, Mg ve Cu konsantrasyonları da 2.41 ± 2.80 µg/L, 253.08 ± 265.9 µg/L, 2.78 ± 2.27 µg/L, 25.97 ± 22.4 µg/L, 0.25 ± 0.36 µg/L olarak bulunmuştur.
Sonuçları değerlendirirken Excel istatistik programı kullanılmıştır, p değerlerine göre iki veri dizisi arasında p < 0.05 ise aralarında anlamlı bir fark var demektir. Çalışmamızda serum demir ve magnezyum düzeylerinin hasta ve kontrol grubu için önemli derecede bir anlam içerecek kadar farklı olmadığını gördük. Serum Zn(p< 0.05), Cu (p < 0.05) ve Pb (p < 0.05) düzeyleri hasta ve kontrol gurubuna göre anlamlı farklıdır. Aynı şekilde idrar demir ve kurşun düzeyleri için anlamlı bir fark olmadığı
buna karşın idrar Mg (p < 0.05), Zn (p < 0.05) ve Cu (p < 0.05) düzeylerinin anlamlı derece farklı olduğu saptandı.
Bizce daha fazla sayıda hasta üzerinde, yaş grupları göz önüne alınarak ve taş cinsleri ayrı ayrı gruplar halinde ve farklı bölgeler de ele alınarak yapılan çalışmalar daha gerçek sonuçlara götürecektir.
SUMMARY
There are lots of theories about stone formations. One of them is inhibitor deficiency theory. In this context, an hypothesis occurred that trace elements may have inhibitor effects in the stone formation. The intention in this study is, researching inhibitor effects of the indicated elements in the urinary tract stones.
In this study, lead (Pb), zinc (Zn), iron (Fe), magnesium (Mg) and copper (Cu) elements are assigned with the flame atomic absorption spectrophotometer in the urinary tract stones and in the blood serum and urine examples of this patients.In the Pb, Zn, Fe, Mg and Cu determinations by Flame Atomic Absorption Spectrophotometer (FAAS), a standard addition technique was used because of the influence of possible interference present in the sample was tested.
With the FASS method, kidney stone patients as pathologic and people in good health (34 + 26) and never been sick about kidney in his past (control group); we realized analitycal practice of trace elements in the urine, blood serum and patients stone examples in this study. In the blood serum; Pb, Zn, Fe, Mg and Cu concentrations are in turn in order 1.17 ± 0.39 µg/L, 0.86 ± 0.64 µg/L, 5.31 ± 4.21 µg/L, 16.7 ± 5.78 µg/L, 0.49 ± 0.18 µg/L for patient group and are in turn in order 0 µg/L, 2.18 ± 1.39 µg/L, 6.32 ± 3.30 µg/L, 15.1 ± 3.00 µg/L, 0.36 ± 0.15 µg/L for control group, in our study. In the urine; Pb, Zn, Fe, Mg and Cu concentrations are in turn in order 0.12 ± 0.09 µg/L, 0.016 ± 0.021 µg/L, 0.07 ± 0.12 µg/L, 2.32 ± 0.52 µg/L, 0.03 ± 0.02 µg/L for patient group and are in turn in order 0.06 ± 0.06 µg/L, 0.05 ± 0.04 µg/L, 0.09 ± 0.10 µg/L, 4.79 ± 2.98 µg/L, 0.04 ± 0.01 µg/L for control group. Besides, in the stone analyses of the patient group, Pb, Zn, Fe, Mg and Cu concentrations are found in turn in order 2.41 ± 2.80 µg/L, 253.08 ± 265.9 µg/L, 2.78 ± 2.27 µg/L, 25.97 ± 22.4 µg/L, 0.25 ± 0.36 µg/L.
Excel statistics program is used while comparing results, according to ‘p’ if p < 0.05 it means that there is a meaningful difference between two datum lines. In our study we see that there is no significant difference in the serum iron and magnesium levels between patient and control group. Serum levels Zn (p < 0.05), Cu (p < 0.05) and Pb (p < 0.05) are meaningful different. In the same way, there is no meaningful difference between urine iron and lead levels and although, urine levels Mg (p < 0.05), Zn (p < 0.05) and Cu (p < 0.05) are meaningful different.
In our opinion, more patient, different age groups, different stone type groups and different regions must be taken into consideration for the realistic consequences.
ÖNSÖZ
Temel ve temel olmayan eser elementlerin biyolojik maddelerde tayin edilmesinin fizyolojik yapımızın açıklanması, mevcut hastalıkların teşhis ve tedavisinin
gerçekleştirilmesi için en uygun yöntemin seçilmesi ve uygulanmasının önemi açıktır. Bu çalışmada kurşun, çinko, demir, magnezyum ve bakır elementleri, üriner sistem taşlarında ve bu hastaların serum ve idrar örneklerinde alevli atomik absorpsiyon spektrofotometrisi ile tayin edilmiştir.
Bu tezin oluşması için ilk adımı atan hocam Prof.Dr.Hilmi İBAR ve hazırlanmasındaki her aşamada desteğini esirgemeyen kıymetli hocam Yrd.Doç.Dr.Gülay ŞEREN’e ayrıca her şeyimi borçlu olduğum ailem, ağabeyim ve eşine sonsuz teşekkürler, saygılar.
İÇİNDEKİLER Sayfa no
Özet... i
Summary... iii
Önsöz... iv
Tablo ve Şekil Listesi... vi
1.GİRİŞ... 1
2.TEORİK BİLGİ... 1
2.1 BİYOLOJİK MATERYALLERDEKİ ESER ELEMENT ANALİZ PROSEDÜRÜ... 4
2.1.1 Örnekleme ve Örnek Kalitesi... 4
2.1.2 Biyomedikal Örneklerin Alınması ve Saklanması... 5
2.1.3 FAAS ve GFAAS İçin Çözünürleştirme Prosedürleri... 7
2.1.4 Biyolojik Materyallerde Örnekleme ve Örnek Hazırlığı... 11
2.1.5 Vücut Sıvıları ve Dokularda Eser Element Analizleri... 12
2.1.6 Eser Element Tayini İçin FAAS Kullanılarak Biyolojik Materyallerdeki Diğer Prosedür ve Metotlar... 19
2.2 CİHAZIN TANITIMI... 24
2.2.1 Işın Kaynakları... 24
2.2.2 Oyuk Katot Lambaları... 25
2.2.3 Spektrofotometreler... 26
2.2.4 Alev atomlaştırıcılar... 27
2.2.5 Alev Atomlaştırıcıların Performans Özellikleri... 27
2.2.6 Alev Tipleri... 29
2.3 AAS’DE GİRİŞİMLER... 30
2.3.1 Spektral Girişimler... 30
2.3.2 Kimyasal Girişimler... 31
2.3.3 Spektral Girişimlerin Giderilmesi... 32
2.3.4 Spektral Olmayan Girişimlerin Giderilmesi... 32
2.3.5 Kaynak Modülasyonu... 32
2.3.6 Standart İlave Yöntemleri... 33
3. DENEYSEL KISIM... 36
3.1 KULLANILAN REAKTİF VE STANDARTLAR... 37
3.2 ENSTRÜMENTAL ŞARTLAR... 38
4. DENEY SONUÇLARI... 39
5.SONUÇ VE TARTIŞMA... 46
Kaynaklar... vii
TABLO LİSTESİ
Sayfa No
Tablo.1 : Temel eser elementler... 2
Tablo.2 : Yaş çözünürleştirmede sık kullanılan asit karışımları... 8
Tablo.3 : FAAS ve GFAAS’li analizler için biyolojik materyallerin mikrodalga destekli off-line çözünürleştirilmesi üzerine seçilmiş makaleler... 10
Tablo.4 : FAAS ile vücut sıvılarında bakır tayini üzerine seçilmiş yayınlar... 13
Tablo.5 : Vücut sıvılarında FAAS ile demir tayini gerçekleştirilmiş seçilmiş makaleler... 14
Tablo.6 : FAAS ile vücut sıvılarında çinko tayini üzerine seçilmiş makaleler... 16
Tablo.7 : GFAAS kullanılarak vücut sıvılarında kurşun tayini üzerine seçilmiş makaleler ve teknikleri... 18
Tablo.8 : Diğer metotlar için deneysel şartlar... 20
Tablo.9 : FAAS kullanılarak biyolojik materyallerdeki Zn, Ca, Mg, K, Na, Cu, Fe ve Mn’nin direkt tayini üzerine seçilmiş yayınlanmış makaleler... 21
Tablo.10 : Alev özellikleri... 29
Tablo.11 : Ölçümlerde kullanılan enstrümantal şartlar... 38
Tablo.12 : Kontrol grubunun serum Mg, Zn, Fe, Cu ve Pb düzeyleri... 39
Tablo.13 : Kontrol grubunun idrar Mg, Zn, Fe, Cu ve Pb düzeyleri... 40
Tablo.14 : Hasta grubunun serum Mg, Zn, Fe, Cu ve Pb düzeyleri... 41
Tablo.15 : Hasta grubunun idrar Mg, Zn, Fe, Cu ve Pb düzeyleri... 42
Tablo.16 : Hasta grubunun taş Mg, Zn, Fe, Cu ve Pb düzeyleri... 43
ŞEKİL LİSTESİ Şekil.1 : Bir temel element için doz – tepki ilişkisi... 3
Şekil.2 : AAS Spektrometrisi diyagramı... 24
Şekil.3 : Oyuk katot lambası... 25
Şekil.4 : Laminar akışlı bek... 27
Şekil.5 : Alev atomizasyonda atomlaşma prosedürü... 28
Şekil.6 : Analit ilave yöntemleri numune ve şahit grafikleri... 35
Şekil.7 : Serum ve idrar ölçümlerinin karşılaştırılması... 44
Şekil.8 : Üriner sistem taşlarının eser element
içerikleri...
1.GİRİŞ
Çoğu element analiz örneklerinde öylesine küçük miktarlarda bulunur ki tayini mümkün olsa bile, mevcut tekniklerle kantitatif olarak tayin edilebilmeleri mümkün değildir. Böyle çok değişken konsantrasyonları ifade etmek ve çok zor tayin edilebilen konsantrasyonları açıklayabilmek amacıyla ‘eser’ terimi kullanılır. Böyle elementlere de ‘eser element’ denir. Son zamanlarda çok düşük konsantrasyonlar, analitik tekniklerin ilerlemesi ve yeni tekniklerin geliştirilmesiyle doğruluk ve kesinlikle tayin edilebilmesine rağmen bugün hala eser element olarak ifade edilmektedirler. Bilindiği gibi ‘eser elementler’ genel olarak konsantrasyonu 100 µg/g’nin altında ifade edilenlerdir. Aşırı derece düşük konsantrasyonlar da, 10 ng/g’nin altındakiler, ‘ultra eser’ olarak adlandırılır.
Eser elementlerin tayini için çalışılan örnek tipine göre (kan serumu,idrar,taş v.s) konsantrasyonun değişkenliği, sonuçların kullanılabilirliği ve analiz örneklerinin sayısı ve miktarı açısından doğrulama karakteristikleri (tayin limiti, doğruluk, kesinlik v.s) verebilen bir analitik metot gereklidir (1).
2. TEORİK BİLGİ
İnanlar ve hayvanlar normal bir büyüme ve çeşitli biyolojik fonksiyonlar için besinler ve vitaminlerin yanında inorganik elementlere de gereksinim duymaktadırlar. Bu elementleri temel ve temel olmayan diye ikiye ayırabiliriz. Bir element canlı organizmada bir eksiklik sendromuna neden olup (fizyolojik ve yapısal bozukluk) ve bu bozukluk ilaçla tedavi edilebiliyorsa ‘temel element’ olarak tanımlanır. Makro ve mikro temel elementlere, H, C, N, O, Mg, P, S, Cl ve K ilaveten bazı eser elementlerin de, F, Si, V, Cr, Mn, Fe, Co, Ni, Cu, Zn, As, Se, Mo, Sn ve I temel olduğu düşünülmüştür. Canlı organizmada bulunan diğer tüm elementler de ‘temel olmayan’ eser elementler grubunu oluşturmaktadır fakat ‘temel karakter’ henüz tam olarak ispatlanamamıştır.
Tablo.1 Temel eser elementler
Element Bazı fonksiyonları ve eksiklik durumları
Demir (17.yy)* Oksijenle karışır ve elektron taşır, eksikliğinde anemi, aşırısı çok tehlikeli hemakromatoz.
İyot (1850) Tiroid hormonlarının bileşeni, eksikliğinde guatr ve tiroid fonksiyonlarının bozulması, aşırısında tirotoksikoz.
Bakır (1928) Oksidatif enzimlere bağlanır, demirle birbirini etkiler, elastinin (katılgan doku) çapraz bağlanması için temeldir, eksikliğinde anemi, gebe kadınlarda hassaslık, alınganlık.
Mangan (1931) Mukopolisakkarit metabolizmasına katılır, insanlarda bilinen eksiklik etkisi yoktur, teneffüs edilirse toksiktir, aşırısında nörolojik rahatsızlıklar ortaya çıkar.
Çinko (1934) Temel metabolik proseslerde 100’den fazla enzimin bileşenidir, eksikliğinde önemli büyüme bozuklukları, deri lezyonları, bağışıklık sisteminde bozukluk vs.
Kobalt (1935) B-12 vitaminin bileşenidir, vejeteryan diyetleri gibi düşük alımlarda ciddi etkilere neden olur.
Molibden (1953) Ksantin aldehit ve sülfür oksidaz enzimlerinde bulunur, eksikliğinde insanlarda önemli bir etkisi yoktur, aşırısı ‘gout-like’ sendromu.
Selenyum (1957) Glutation peroksidazın bileşeni, insanlarda bilinen hastalığı kardiyomiyopati; dışarıdan selenyum verilerek tamamen iyileştirilebilir, hayvanlarda toksik etkisi kanıtlanmıştır.
Krom (1959) İnsülini aktive ettiğine inanılır, glukoz düzeyini zayıflatmasına bağlı olarak serum limitlerini yükseltir ve bunun sonucu kalp rahatsızlıklarına sebep olabilir, aşırısında krom alerjisi, egzema ve kanser.
Kalay (1970) Hayvanlarda gelişim için gerekliliği bilinmektedir, metabolik etkileşimi bilinmemekte, yüksek konsantrasyonlarda demir absorpsiyonuyla girişim yapar.
Flor (1971) Dişlerin yapısında temel bileşendir, kemik gelişimi için gereklidir, eksikliğinde osteoporoz, diş ve kemik çürümesi, aşırısı toksiktir.
Silisyum (1972) Katılgan doku oluşumuna katılır, eksikliği genel olarak bilinmemektedir.
Nikel (1976) Demir absorpsiyonuna girişim yapar, diğer metabolik etkileşimleri bilinmemekte, aşırısı egzema ve kansere sebep olur.
Arsenik (1977) Hayvanlarda organizma için gerekli olduğu bilinmekte, metabolik etkileşimleri bilinmemektedir.
*Verilen yıllar temel element olarak keşfedildiği yılı göstermektedir (1).
Bu konsantrasyonlarına rağmen bu elementler pek çok alanda önemli rol oynarlar .Diğer yandan, bir elementin çok yüksek konsantrasyonda olması da problemler yaratabilir. Bundan dolayı bu tip elementlerin yiyeceklerle vücuda alınması belirli limitlerle sınırlandırılmıştır. Şekil.1 temel eser elementlerin alımı sonucu, sağlık üzerindeki kalitatif etkilerini göstermektedir (1).
Şekil.1 Bir Temel Element İçin Doz – Tepki İlişkisi
Üriner sistem taş hastalığı oldukça sık rastlanan hastalıklardan biri olup üriner patolojiler arasında üçüncü sırayı alır. Bu açıdan üriner sistem taşlarının oluşumuyla ilgili olarak bazı önemli fizyolojik gelişmeler kaydedilmiştir.
Taşların oluşumu fiziksel, kimyasal, diyetik, bakteriyolojik vb. faktörlerle ilgilidir. Bunlar tek tek olabildiği gibi birlikte de olabilir.
Taş örneklerinin oluşumunun anatomik yönüne gelince; 2 tip’ten bahsetmek mümkündür.
1. Böbrekteki lokalize lezyon: Papillarda oluşan harabiyet üzerine kalsiyum tuzları çöker, supepitalyal kalsiyum plakları teşkil eder (Randall Plakları). Carr 1954’te intrarenal lenf akımının bozulmasının taş oluşumunda rol oynadığı ileri sürülmüştür. Önce taşlar ufak mikrolitler halinde böbrekte oluşmakta, lenfatiklerle pelvise taşınmaktadır. Lenfatik staz olunca mikrolitler büyümekte ve cidarı nekroze edip pelvise düşmekte ve taş meydana getirmektedir (2-4).
2. Taş oluşumunun doğrudan doğruya idrar içinde (üriner sistem boşluklarında) başladığı görüşü çeşitli teorilerle açıklanmıştır (Matriks teorisi, kristalizasyon- inhibisyon teorisi, Hibereksresyon- Kristalizasyon teorisi).
Üriner sistem taş hastalığında eser elementlerin rolü henüz detaylı olarak bilinmemektedir. Taş oluşması ve büyümesi mekanizmasının açıklanması amacıyla birkaç teori ortaya atılmıştır (5). Bu teorilerden biri inhibitör eksikliği teorisidir. Bu bağlamda eser elementlerin taş oluşumunda inhibitör etkileri olabileceği varsayımı
0 20 40 60 80 100 120 Ölümcül
Marjinal Optimum Zehir etkisi Ölümcül Sa ğl ık düzeyi Alınan doz
gündeme gelmiştir. Özellikle iki değerli eser elementlerin etkisi inceleme konusudur. Fakat genellikle problemle ilgili olarak tatmin edici bir açıklama sunulmamıştır ve bu hastalığın patolojisinde hastaların idrarındaki belirli eser elementlerin varlığının yada yokluğunun birleştirilip sunulduğu pek az kesin bilgi bulunmaktadır (6). Birkaç çalışmada, farklı üriner sistem taşlarında bazı eser element konsantrasyonlarının farklı olabildiği bulunmuştur (7,8,9).
2.1 BİYOLOJİK MATERYALLERDEKİ ESER ELEMENT ANALİZ PROSEDÜRÜ
Örnekleme ve Örnek Kalitesi, ↓
Biyomedikal Örneklerin Alınması ve Saklanması, ↓
Örnek Çözünürleştirme, ↓
Enstrümantal Tekniklere Uygun Örnek Hazırlanması, ↓
Eser Element Örneklerinin Analizi, ↓
Örneklerin Saklanması, ↓
2.1.1 Örnekleme ve Örnek Kalitesi
Başlıca biyolojik sıvı olan kanın kantitatif analizleri özenle yapılmalıdır. Bütün kanlar kan bankasından alınmalı veya hematolojik testlerden geçmelidir.
Gerçek örneklerde örneğin belirli bir kademede olması gerekmektedir. Uygun olmayan örnekler sadece analitik sonuçlar açısından kullanılışsız olmakla kalmayıp her türlü tehlikeye açıktır, sabır ve zaman gerektirir. Genellikle belirlenen analitik metotlarda ve enstrümantasyonda analitiksel girişimlere karşılık gelir ve hiç kullanışlı değildir. Böylece hiçbir girişim veya bozulmaya maruz kalmayan örnek analizleri doğrudan doğruya analizcinin güvenilirliğini yansıtır. Başka bir şekilde söyleyecek olursak tüm analiz edilen numuneler ‘ideal örnek’ olmalıdır (9).
‘İdeal bir örneği’ özetlemek gerekirse:
1. Kararlı ve doğru hastadan alınmış örnek olmalıdır,
2. Eğer plazma ile çalışılacak olursa doğru antikoagülant ilave edilmiş olmalıdır, 3. Hemolize olmamalıdır,
4. Bulanık olmamalıdır, 5. Örnek taze olmalıdır, 6. Koruyucu ilave edilmelidir,
7. Örnekleme zamanı doğru olmalıdır, idrar örnekleri için bu süre 24 saattir, 8. Örneğin alınmasından önce uygun hastalar seçilmelidir,
9. İlaç girişiminden mümkün olduğu kadar kaçınılmalıdır. 2.1.2 Biyomedikal Örneklerin Alınması ve Saklanması Kan Örnekleri:
Genellikle kan sabah aç karnına alınır. Saklama kapları olarak genellikle polipropilen ve polietilen malzemeler kullanılmaktadır. Malzemeler bir gece önceden 6N nitrik asit içerisinde bekletilmeli ve temizlendikten sonra çift destile edilmiş su ile iyice çalkalanmalıdır.
Literatürde serum örneklerinin saklanma şartları genellikle –18° ile –25° C arasındadır. Tam kan 2000- 3000 rpm’de 10 dakika santrifüj edilir ve plazma ayrılır. Oda ısısındaki serum ve plazma en geç 4 saat içinde kullanılmalıdır. Buzdolabında, +4°C, 1 günden fazla saklanmamalıdır. Aksi taktirde bakteri üreyebilir. Bakteri üremesini önlemek amacıyla her 10 mL serum başına 1mg streptomisin veya 1mL
seruma 10 mg NaF + 1 mg timol karışımı ilave edilebilir. Numuneler dondurularak 3- 4 gün, en iyisi –20°C derin dondurucuda uzun süre saklanabilir. Dondurulmuş serum kendi haline bırakılarak veya oda ısısında su içinde eritilmeli, tamamen çözününce homojenize edilmelidir (10).
Kan alımında kullanılan malzemelerin ıslak olması hemolize neden olacağından yapılacak analizleri etkiler. Hemoliz özellikle eritrositlerde bol bulunan K, Mg, Fe ve Cu’nun tayinlerinde yanlış sonuçlar verir. Alınan plazma veya serumun ağzı açık tüplerde bekletilmesi, buharlaşmaya bağlı olarak madde konsantrasyonlarında yükselmeye sebep olur.
İdrar Örnekleri:
İdrarın temiz ve steril kaplara alınması ağzı kapalı olarak tutulması çok önemlidir. Bu durum hem buharlaşmaya engel olmak hem de kirlenmeyi engellemek için önemlidir. Hemen analiz yapılmıyorsa idrar +4°C’de soğutucuda bekletilmelidir. Soğutucuda bekletmenin 48 saat süre ile mikro organizma üremesini engelleyebileceği bildirilmişse de bu sürenin 24 saati geçmemesine dikkat edilmelidir. Oda ısısında tutulan idrarda ise 45dk sonra bakteriyel üremeler başlamış olacaktır ve neticede idrarın kimyasal, fiziksel ve mikroskobik değişikliklere yol açacaktır. Bundan dolayı idrar hemen analiz edilemiyorsa veya uzak mesafedeki laboratuarlara gönderiliyorsa bozulmayı engelleyen maddeler ilave edilir. Bu maddelerin bazıları şunlardır: Timol, kloroform, borik asit, toluen ve formol (10).
İdeal olarak biyolojik materyal hemen çalışılmalıdır. Serum veya plazma elde edilecekse, gerekli işlemler en kısa zamanda tamamlanmalıdır.
Hemoliz: Eritrosit bütünlüğünün kaybolarak hemoglobinin plazma veya seruma çıkmasıdır.
Serum: Antikoagülantsız tüpe kan alınır ve 20dk kadar pıhtılaşması beklenir. Pıhtılaştıktan sonra tüpün iç cidarına yapışmış olan pıhtı ince uçlu cam bir çubukla yerinden oynatılır ve tüp santrifüj edilir. Santrifüjden sonra üstte toplanan sıvı kısma verilen isim serumdur.
Plazma: Antikoagülantlı tüpe alınan kan santrifüj edilir. Tüpün üst kısmına toplanan sıvı plazmadır.
Antikoagülantlar: Plazma gerektiğinde veya tam kanla çalışılacağı zamanlarda, kanın pıhtılaşmasına engel olan özel kimyasal maddelere, pıhtılaşmayı önleyici anlamında antikoagülant denir. Bunlara örnek ise EDTA (etilen diamin tetra asetkasit), okzalatlar (potasyum ve sodyum okzalat ve bunların karışımı, lityum okzalat), sitratlar (sodyum sitrat ve lityum sitrat), sodyum florür ve heparin (11).
Taş Örnekleri:
Taşlar üriner sistemin değişik yerlerinde ve sıklık sırasına göre de böbrek, üreter, mesane ve üretra taşları olarak bulunurlar. Böbrek ve mesane taşları primer olarak oluştuğu halde, üreter ve üretra taşları genellikle göç eden taşlardır ve bulundukları yere göre isimlendirilirler.
Analizden önce taşlar destile su ile iyice yıkandıktan sonra 60°C’de 2 saat kurutulması, dış yüzeydeki organik kirliliklerin bir çözücü veya çözücü karışımı (etil alkol, hekzan) yardımıyla uzaklaştırılması gerekmektedir. Daha sonra ağzı sıkıca kapanabilen cam, polietilen veya polipropilen kaplarda 2 ay civarında analize kadar saklanabilir.
2.1.3 FAAS ve GFAAS İçin Çözünürleştirme Prosedürleri
Yapılan analizler için geçerli olan en önemli parametre çözünürleştirmenin tam anlamıyla gerçekleştirilmesidir. Bu amaçla en çok mineral asitler ve çoğunlukla yükseltgeyici asitler kullanılır. Bu yöntem hem organik hem de inorganik maddelerin çözünürleştirilebilmesi için etkili bir yöntemdir. Bazı girişimlerin azaltılmasına neden olduğu için örnek matrikslerini uzaklaştırır. Yaş çözünürleştirmede çoğunlukla asit karışımları kullanılır. Tablo 2’de yaş çözünürleştirmede kullanılan asit karışımları belirtilmektedir.
Tablo.2 Yaş çözünürleştirmede sık kullanılan asit karışımları (1)
Asit karışımı Karışım oranı Açıklama
HNO3 / H2O2
1mL der.: 3 mL %30
Son derece yararlı bir tekniktir. Katılar için 500mg örnek uygundur. Sıvılar için
0.25 M HNO3 ve 3 mL %30 H2O2
kullanılır. HNO3 / HCl
1 mL : 3 mL der.
Altın suyu, karasızdır, saklanamaz. İhtiyaç halinde taze hazırlanır.
HNO3 / H2SO4
5 mL : 1 mL der.
Bazen sedimentler için kullanılır. Organik maddelerde kullanılırken dikkatli olmak gerekir çünkü çok hızlı reaksiyon vererek sıçramalara neden olabilir.
HNO3 / HClO4 / H2SO4
10 mL : 5 mL : 3 mL
Organik maddelerde kullanılırken dikkatli olmak gerekir çünkü çok hızlı reaksiyon vererek sıçramalara neden olabilir. Jeokimyasal numuneler ve gübreler vs. için kullanılır.
HNO3 / HCl / HF 5 mL : 15 mL : 3 mL
Genel olarak alaşımlar, silikatlar kül analizleri için kullanılır.
HF / HBr 6 mL der. : 50 mL
%4
Genel olarak alaşımlar, silikatlar kül analizleri için kullanılır. Çözünürleştirmede sadece teflon kaplar kullanılmalıdır.
HNO3 / HF / HBr
6 mL der. : 1 mL der : 50 mL %4
Genel olarak alaşımlar, silikatlar kül analizleri için kullanılır.
HCl / Su / HNO3
5 mL der. : damla damla : 5 mL der.
Örnek hazırlama kademeleri daha çok örneğin tipine bağlıdır. Tayin için kullanılan analiz tekniğini çok geniş ölçüde analitin konsantrasyonu etkiler. 1960 ve 1970’lerde biyolojik materyallerde çözünürleştirme için daha çok kuru çözünürleştirme kullanılmaktaydı (12-22). Organik içerik kalıntı olmaksızın tamamen parçalanıyor ve analizler mineralizasyondan sonra yapılıyordu ki eğer bir ön çözünürleştirme basamağının ardından çözünürleştirme gerçekleştiriliyorsa çok avantajlıydı (23-24). Kuru çözünürleştirme doğrudan yada magnezyum nitrat, nitrik asit ve sülfürik asit gibi bir çözünürleştirme reaktifinin ardından kullanılabilmektedir. Günümüzde kuru çözünürleştirme işlemi diğer çözünürleştirme teknikleri hızla geliştiği için zaman zaman uygulanmaktadır (25-31). Ayrıca değerler sık sık sistematik olarak çok düşük olmakta ve eser element analizinde analit kaybına neden olmaktadır (32,33-36).
Oksidatif yaş çözünürleştirme FAAS yada GFAAS ile gerçekleştirilen analizler için fizyon yada kuru çözünürleştirmeden çok daha fazla kullanılmaktadır. Bu işlemde eğer gerekli ise reflüks kondensatlama yada kapalı sistemlerde basınç altında (otoklav) ve açık sitemlerde gerçekleştirilmektedir. Birkaç çalışma biyolojik materyallerde yaş ve kuru çözünürleştirmeyi karşılaştırmış ve sonuçlarda çok fazla önemli olmayan farklar bulmuşlardır (37-40). Örneğin; basınç altında yaş çözünürleştirmenin avantajı zamandır (41).
Perklorik asit oksidasyon potansiyeli çok yüksek olduğu için çözünürleştirmede geçmişten günümüze kadar oldukça sık kullanılan bir asittir (42,43), genellikle nitrik asit (44-51), nitrik ve sülfürik asit (52-58) yada nitrik asit ve hidroflorik asit (59) ile beraber kullanılır. Genellikle bu asit karışımları analitin mineralizasyonunu tamamen gerçekleştirebildiklerinden beri bunlar ön çözünürleştirme ve seperasyon öncesinde gerekliyse, örneğin, solvent ekstraksiyonu (27,53,57,60-63) yada ön çöktürme (64,65), kesinlikle uygulanabilir. Perklorik asit ile çözünürleştirme FAAS ve GFAAS’li direkt tayin öncesi için sıkça kullanılır (44-46,51,54). Bu prosedürlerdeki çokça oynadığı rol ise gereken zamanı azaltmaktır.
Tablo.3 FAAS ve GFAAS’li analizler için biyolojik materyallerin mikrodalga destekli off-line çözünürleştirilmesi üzerine seçilmiş makaleler.
Test örneği Analit Çözünürleştirici sistem Asit Referanslar Biyolojik materyal Cd, Cr, Cu, Fe, Pb, Zn, Kapalı, basınç H2SO4 HNO3 66
Se Kapalı, basınç HNO3 67,68
25 element Kapalı, basınç HCl-
HNO3- HF
69
As, Ca, Cd, Cu, Fe, K, Mg, Mn, Na, Pb, Zn
Kapalı, basınç HNO3 70
Cu, Cd, Pb, çeşitli
Yüksek basınç, açık, odaklanmış HNO3- HCl yada HNO3- H2SO4 H202 71,72 B, Cd, Cu, Fe, Mn, P, Pb, Zn
Kapalı, basınç HNO3-
H202 yada HNO3 -HClO4 73 Cd, Cu, Fe, Mn, Pb Açık HNO3-HCl 74
Hayvansal doku Cu, Fe, Zn Açık HNO3H2SO4 75
Se Açık HNO3- H202 76
Cd, Cu, Fe, Pb, Zn
Kapalı, basınç HNO3 77
Ni Kapalı, basınç HNO3-
HCl- H202
2.1.4 Biyolojik Materyallerde Örnekleme ve Örnek Hazırlığı
Örnek hazırlığı biyolojik materyal analizinin doğru gerçekleştirilebilmesi için önemlidir. Örnek mutlaka laboratuarda homojenize edilmeli (79), korunmalı ve özel olarak saklanmalıdır; doğal olarak hepsi özenle tanımlanmalıdır. Öte yandan aletlerden, kimyasallardan ve laboratuar ortamından birtakım kirlilikler kaynaklanabilmektedir. Ayrıca buharlaşabilen yada adsorpsiyonlama özellikleri kesinlikle göz önüne alınmalıdır. Bu konuyla ilgili olarak KRATOCHVİL ,TAYLOR (80) ve JONES ve arkadaşları (81,82) tarafından yayınlanmış makaleler vardır.
MAURER ve arkadaşları (83) temsili örneklemenin problemleri üzerine çalışma rapor etmişlerdir. KRİVAN ve SCHALDACH (84) analitik sonuçlar üzerine hazırlık aşaması basamaklarında ve gerekli olan temizliğin faydalarını gösteren bir araştırma yapmışlardır. MATTER sebzeler ve hayvansal yemlerden örnek hazırlanmasındaki problemler üzerine bir tartışma, görüş bildirmiştir (85). SCHLADOT ve BACKHAUS (86) gerçek deniz canlılarından hazırlanan örnekleme üzerindeki problemleri ayrıntısıyla tartışmışlardır. IYENGAR’ın da (87) benzer çalışmaları vardır. IHNAT (88) biyolojik materyallerde elementel analizin gerçekleştirilebilirliği, örnek ön hazırlığı, kalibrasyon ve örneklemenin faydası konusunda genel bir görüş sunmuştur.
2.1.5 Vücut Sıvıları Ve Dokularda Eser Element Analizleri Bakır
Bakır vücuda girmesinden atılımına kadar tespit edilebilen bir elementtir. Konsantrasyonu karaciğer, beyin, kalp ve böbreklerde en yüksektir. Serum ve plazmadaki konsantrasyonu yaklaşık 1.1mg/L’dir. İdrarda ise normal bakır değerleri 36µg/24 saat arasındadır. AAS (Atomik Absorpsiyon Spektroskopisi) vücut sıvılarındaki bakırın tespiti için en çok kullanılan tekniktir (10). Birkaç araştırmacı TCA (Triklor asetik asit) ile deproteinleştirilmiş serumun FAAS (Alevli Atomik Absorbsiyon Spektrofotometrisi) analizinde viskozite probleminden kaçınılması gerektiği kanısına varmışlardır. Ayrıca sistematik hatalara hacim değişikliklerinin de sebep olduğu belirtilmiştir.
1971’de MERET ve HENKIN (11) vücut sıvılarında bakırın direkt tayini için bir teknik geliştirmişlerdir ki bu teknik kolay ve basittir. 0.5 mL serumu 1-butanol’ün %6’lık sulu çözeltisi ile 1+ 4 sulandırmayla taşıyıcı girişimler ortadan kaldırılmıştır. Hava-Asetilen alevi kullanan araştırmacılar günden güne %1.0- 1.8 ve serilerde %0.4-1.0’lık bir tekrarlanabilirlik belirlemişlerdir. DELVES (10) 0.3mg/L’den daha az olan patolojik örneklerde bile 1500’den fazla bakır tayini yaparak bu tekniği geliştirmiştir.
MANNING (89) injeksiyon tekniği kullanarak serumda bakır tayini için yaklaşık 100µL örneğe ihtiyaç duyulduğunu belirtmiştir. Bu tekniği kullanarak WEINSTOK ve UHLEMANN (90) rutin olarak sulandırmadan ve işlemlerden geçirmeden serumda analiz yapmışlar ve onlar 500 ölçümden sonra bile ne aktarmada ne de burner ya da nebulizerde tıkanma yaşamadan analiz etmişlerdir. Tekrarlanabilirlik günden güne %2.2 ve serilerde %1.8’di. SHERWOOD ve arkadaşları (91) FI (Flow Injektion) tekniği uygulayarak bu prosedürü geliştirmiş ve 120 µL’lik bir injeksiyon için serilerde %1’den az tekrarlanabilirlik bulmuşlardır. Tablo.4’te bakır tayini için FAAS teknikleri kullanılan birkaç makale seçilmiştir.
Tablo.4 FAAS ile vücut sıvılarında bakır tayini üzerine seçilmiş yayınlar.
Örnek Prosedür Örnek girişi Referanslar
Plazma Direkt tayin İnjeksiyon tekniği 92
Plazma Çeşitli Konvensiyonel veya
injeksiyon Tekniği
93
Plazma, serum Çeşitli Çeşitli 94
Plazma, serum On-line sulandırma FI tekniği 91
Serum Direkt tayin Konvensiyonel 95
Serum %6 butanol ile 1+9
sulandırmadan sonra direkt tayin
Konvensiyonel 96
Serum Direkt tayin İnjeksiyon tekniği 97, 98, 99, 90
Serum Direkt tayin FI tekniği 100
Serum Direkt tayin Konvensiyonel 101
Serum, idrar On-line sulandırma FI tekniği 102
İdrar Direkt tayin Konvensiyonel 103
İdrar ‘Atom tuzaklı’ tayin Konvensiyonel 104
İdrar Metal-Protein türü HPLC-FAAS 105
İdrar On-line çözücü
ekstraksiyon
FI tekniği 106
İdrar ‘Atom tuzaklı’ tayin FI tekniği 107
İdrar Direkt tayin Konvensiyonel 108
Demir
Demirin yaklaşık %67’si kırmızı kan hücrelerinde hemoglobine, yaklaşık %27’si dokularda ferritine bağlıdır ve sadece %6’sı serumda transferrine bağlı olarak bulunur. Serumda (650-1750 µg/L) ve karaciğer dokusunda demir tayin edilmiştir. Direkt teknikte kolorimetrik tekniğe göre daha yüksek sistematik sonuçlar bulunmuştur. Çeşitli araştırmacılar deproteinleştirme (109,110,111) ya da ekstraksiyon (111,112,113) önermektedirler fakat bu işlemler rutin analizler için fazla efor gerektirirler. Öte yandan demir bağlama kapasitesi (111,114,115) ve hemoglobindeki demir (116,117,118) FAAS ile avantajlı bir şekilde tayin edilebilmektedir.
Konvensiyonel FAAS’de tıpkı kolorimetrik tekniklerdeki gibi yaklaşık 2 mL örnek gerektirmektedir. Alternatif örnek hazırlama teknikleri (serum miktarları düzenli değil ise), injeksiyon yada FI tekniği, tercih edilebilir. FI ile örnek hazırlanması basamakları örneğin çözünürleştirme, sulandırma ve tampon ilavesi yöntemleri ile tamamlanır. Tablo.5’te FAAS kullanılarak vücut sıvılarında demir tayini üzerine son birkaç çalışma verilmiştir.
Tablo.5 Vücut sıvılarında FAAS ile demir tayini gerçekleştirilmiş seçilmiş makaleler.
Örnek Prosedür Örnek girişi Referanslar
Plazma Direkt tayin İnjeksiyon tekniği 119
Serum Direkt tayin Konvensiyonel 120
Serum Direkt tayin ve demir
bağlama kapasitesi, diğer metotlarla karşılaştırma
Konvensiyonel 121
Serum Direkt tayin İnjeksiyon tekniği 98,99
Serum On-line sulandırma FI tekniği 122
Serum Protein uzaklaştırması,
toplam demir ve demir bağlama kapasitesi
FI tekniği 123
Serum, tükürük On-line sulandırma FI tekniği 124
Serum, idrar Direkt tayin Konvensiyonel 125
İdrar Direkt tayin Konvensiyonel 103
İdrar Metal komplekslerde özel
analizler
HPLC-FAAS eşleştirme
Çinko
İnsan vücudu ortalama 2.5 g Zn barındırır ki bunlar kaslarda (%60) ve iskelet sisteminde (%30) bulunur. Günümüzde çeşitli hastalıkların teşhisinde çinko düzeyine bakılmaktadır. Günlük normal değerler 0.8-1.2 µg/L arasındadır. Fakat bu değerler yaşa, cinsiyete ve kişinin sağlık durumuna bağlıdır (126,127). Kirlilik çinko tayininde sık sık karşılaşılan bir problemdir ve normal değerlerden daha fazla değer okunmasına sebep olabilir. VERSIEK ve arkadaşları (128) 1988’de kirlilikten bağımsız olarak referans serumda çinko konsantrasyonu 0.873± 0.018 µg/L olarak bulmuşlardır. Belki de doğru olan normal değere çok yakındır.
Çünkü başlıca vücut sıvılarındaki çinko konsantrasyonu oldukça yüksektir ve enjeksiyona yada paslanmaz çelik malzemelere gerek duyulduğundan örnekleme esnasında kirlilik riski ,örnekleme şayet çok fazla değilse, güvenle uygulanabilir. Potansiyel kirlilik kaynakları özellikle reaktiflerden, laboratuar ortamındaki havadan ve lastik tıpalardan ileri gelmektedir (129,130). Çinko tayini çok az miktarda reaktifle ve sadece ultra-saf reaktifler kullanılarak yapılır. En büyük tehlike antikoagülantlardandır ki çinko ile çok sık kirlilik meydana getirebilmektedirler. Başka bir risk de kırmızı kan hücrelerindeki yüksek çinko konsantrasyonudur; her kullanılan serum yada plazmada hemoliz kesinlikle bertaraf edilmelidir (126).
Vücut sıvılarında ve dokularda çinko konsantrasyonu yüksek olduğu için bu elementin tayininde normal olarak FAAS kullanılabilir. Vücut sıvıları mineralizasyondan önce olmaksızın örnek sulandırılmasından sonra analiz edilebilmektedir (32). Tablo.6’da başlıklarıyla belirtilmiştir.
DELVES (10) örnek çözünürleştirme ve ön hazırlığında çeşitli teknikleri detaylı olarak karşılaştırmıştır. Sadece çok az örnek miktarı olduğunda, oldukça düşük çinko konsantrasyonlarında ve çok hassas ölçümler gerektiğinde GFAAS (Grafit Fırınlı Atomik Absorbsiyon Spektrofotometresi) kullanılabileceğini belirtmiştir. Fakat GFAAS ile çinko tayininde FAAS’den çok daha şiddetli kirlilik problemiyle karşılaşıldığını belirtmiştir.
Tablo.6 FAAS ile vücut sıvılarında çinko tayini üzerine seçilmiş makaleler.
Örnek Prosedür Örnek girişi Referanslar
Serum 1+9 sulandırmadan sonra
direkt tayin
Konvensiyonel 96
Serum *Brij-35 ile 1+5
sulandırmadan sonra direkt tayin
Konvensiyonel 131
Serum Direkt tayin İnjeksiyon tekniği 99,132
Serum Direkt tayin Konvensiyonel 101
Serum Triklor asetik asit ile
deproteinleştirme
FI tekniği 133
Serum, idrar On-line sulandırmadan
sonra direkt tayin
FI tekniği 102
Serum, tam kan HNO3+HClO4’lü çözünürleştirme
FI tekniği 134
İdrar HNO3+HClO4’lü
çözünürleştirme
Konvensiyonel 103
İdrar, tamkan HNO3+H2O2 ile çözünürleştirme
Konvensiyonel 134
*Brij® 35: Polioksietilen lauril eter, iyon değiştirici katı maddedir. Kurşun
Kemikler üzerinde yapılan araştırmalar, antik Roma’da yaygın olarak kullanılan kurşun içeren kurşun-kalay karışımı araçlar kullanımının yol açtığı kronik kurşun zehirlenmelerini göstermektedir. Yüzyılımızda çevremizdeki başlıca kurşun kaynakları yakıtlardan, boyalardan ve su borularından ileri gelmektedir. Son yıllarda kirlilik seviyesi sürekli azalmaktadır ve bu da belirgin düzenlemelerin sonucu olmaktadır . Sigara ve alkol (özellikle şarap) tüketiminden dolayı kandaki kurşun konsantrasyonunun önemli derecede arttığı gözlenmiştir (136). Devamlı azaltılma etkisine rağmen kurşun hala, özellikle ABD’de, en çok araştırılan elementlerden biridir. Bunun sebebi de çocuklarla ilgili olarak öğrenme yeteneği ve hafıza kapasitesi üzerinde kurşunun rolüdür (137,138,139,140).
Kurşun çoğunlukla elektrolitlere bağlı olarak bulunduğundan dolayı tayin tercihen tam kanda gerçekleştirilmektedir. Bazen de kurşun zehirlenmesi tıpkı bir indikatör gibi idrara salgılanmakta ve burada tespit edilmektedir. Kurşun kemiklerde ve dişlerde çok büyük miktarda depo edilmektedir ve bundan dolayı da 10 yıldan fazla bir zaman geçmiş olmasına rağmen bile biyolojik olarak yarı ömür tayininde kullanılmaktadır.
Kirlenmenin başlamasından önceki doğal kurşun konsantrasyonunun 2 µg/L olduğu tespit edilmiştir (141). Günümüzde endüstri bölgelerinde bu değerin ortalama 40-200 µg/L olduğu tespit edilmiştir.
Kandaki kurşunun tayini için en çok kullanılan tekniklerden biri de GFAAS’dir. Kanın sadece birkaç mikrolitresinde bile doğrudan tayine imkan sağlayan bir tekniktir. Direkt teknikte kan sadece Triton X-100 ile sulandırılırdı ki bu FERNANDEZ tarafından gerçekleştirildi (142). Bu araştırmacı sonraları STPF şartları için tekniği yenilemiştir ve yenilikte ise amonyum fosfat denemiştir (143). Bu tekniğin prensibi günümüzde hala uygulanmaktadır; bazen, Triton X-100 ve amonyum fosfat, nitrik asit (144) yada magnezyum nitrattan (145) bir kısım alınarak yenilenmiş ve kalibre edilmiş Spike kan serumu örneklerine uygulanmıştır (144,145,146). Zeeman BC (girişim düzeltme) etkisi için sürekli BC kaynak birkaç araştırmacı tarafından kullanılmış (144,145,146,147) ve karşılaştırılmıştır. Ve daha iyi sonuçlar elde edilmiştir (148). Tablo.7’de GFAAS kullanılarak vücut sıvılarında kurşun tayini üzerine seçilmiş makaleler ve teknikleri yer almaktadır.
Tablo.7 GFAAS kullanılarak vücut sıvılarında kurşun tayini üzerine seçilmiş makaleler ve teknikleri.
Örnek Prosedür Atomizasyon Dönüştürücü Referanslar
İdrar 1+3 sulandırmadan
sonra direkt tayin
Probe tip Yok 149,150
İdrar Piroliz olmaksızın
direkt tayin
THGA Yok 151
İdrar Dönüştürücü ile sulandırmadan
sonra direkt tayin
Platform NH4H2PO4 – Triton X-100 – HNO3 152 İdrar Dönüştürücü ile 1+1 sulandırmadan sonra direkt tayin
Platform NH4H2PO4 153
İdrar Direkt tayin, Zeeman BC etkisi
Platform NH4H2PO4 154
Tam kan Zeeman etkisine karşı sürekli kaynak
Platform NH4H2PO4 –
Triton X-100 – HNO3
155
Tam kan Direkt tayin, hava
külleyici
Platform Pd-Sitrik asit 156
Tam kan Direkt tayin, AS-4090 (Avustralya Std Metodu)
Platform (NH4)2HPO4Triton X-100
157
Tam kan Direkt tayin THGA NH4H2PO4 –
EDTA- NH4OH
158
Tam kan %1 Triton X-100 +
%0.2 HNO3 ile
sulandırmadan sonra direkt tayin
THGA (NH4)3PO4-
Mg(NO3)2
2.1.6 Eser Element Tayini İçin FAAS Kullanılarak Biyolojik Materyallerdeki Diğer Prosedür ve Metotlar (160)
1.Metot: Perklorik ve nitrik asit metodudur. 100mL’lik cam behere 0.2g ağırlığındaki örnek konur ve üzerine 10mL nitrik asit ilave edilir. 30dk basit ısıtıcı üzerinde orta derecede ısıtılır. Üzerine 10mL daha nitrik asit ve 4mL perklorik asit ilave edilir. Perklorik asit dumanı görülünce 1mL nitrik asit daha ilave edilir. 5mL destile su ilave edilir ve 25mL’lik kaba süzüntü ayrılır, soğutulur, 25mL’ye tamamlanır ve analiz için saklanır.
Eğer numune silisli materyal içeriyorsa sonraki basamakta 1mL nitrik asit ilave edilmelidir.
2.Metot: Nitrik ve hidroklorik asit metodudur. 100mL’lik cam behere 0.2g ağırlığındaki örnek konur ve üzerine 5mL nitrik asit, 15mL hidroklorik asit ilave edilir. 60dk orta derece ısıtıcı üzerinde çözünürleştirilir. Kuru hale gelene kadar buharlaştırılır. Yine 1mL nitrik asit ilave edilir ve ısıtılır. 5mL destile su ilavesinin ardından 25mL’lik cam bir kaba süzülür, soğutulur ve 25mL’ye tamamlanır.
Her iki metot için de perklorik asit yerine hidroflorik asitli metotlar kullanılabilir. Analizler için standartlar ve ölçülecek numunelerin deneysel şartları Tablo.8’de verilmiştir. Standartlar her 10-20 ölçümden sonra tekrarlanmalıdır. Referans örnek ise numuneler ve kalibrasyon standartları ile birlikte ölçülmelidir. Tayin sınırı 0.2ppm çözeltiden az olduğu zaman belirlenememektedir.
Tablo.8 Deneysel şartlar
Element Analitiksel çizgi (A°)
Slit genişliği (A°) Alev tipi Kaynak lamba
Cr 3579 7 A/A HCL Mn 2795 2 A/A HCL Fe 2483 2 A/A HCL Co 2407 2 A/A HCL Ni 2320 2 A/A HCL Cu 3247 7 A/A HCL Zn 2139 7 A/A HCL Cd 2288 7 A/A HCL Pb 2833 7 A/A EDL Bi 2231 2 A/A HCL V 3184 7 N/A HCL Mo 3133 7 N/A HCL Sb 2176 2 A/A HCL Ag 3281 7 A/A HCL
HCL: Oyuk katot lambası A/A: Hava/Asetilen
EDL: Elektrotsuz boşalım lambası N/A: Azot oksit/asetilen Klasik FAAS Metotları
Buradaki teknikler sadece optimum çalışma şartlarında uygulanmaya yöneliktir. FAAS biyolojik materyallerde K, Na, Ca, Mg, Cu, Fe, Zn, ve bazı şartlar altında Mn’nin direkt tayini için ayrım yapmaksızın uygundur. Tablo.9’da bunların birkaçı verilmektedir. Belirli şartlar altında Al (54,161,162), Cr (163,166), Ni (167,168), Si (169,170) ve Sn (171) FAAS tarafından direkt olarak tayin edilebilmektedir. Kuru çözünürleştirme basamağında, ki çok büyük özenle gerçekleştirilmelidir, FAAS için matriks nispeten problemsiz sayılabilir ve bu avantaj sık sık sulandırmayla sınırlıdır. Azot oksit /Asetilen alevi hatasız sonuçlar verecek şekilde bu elementlerin pek çoğunun ön çözünürleştirilmesi için kullanılır.
Tablo.9 FAAS kullanılarak biyolojik materyallerdeki Zn, Ca, Mg, K, Na, Cu, Fe ve Mn’nin direkt tayini üzerine seçilmiş yayınlanmış makaleler
Analit Test örneği Yöntemler Referanslar
Ca, Mg Biyolojik
maddeler
Kuru çözünürleştirme 172
Ca, Mg, K, Na Hayvansal doku Kuru çözünürleştirme 173
Ca, Mg, K, Na, Cu, Fe, Zn Biyolojik referans maddeler 75 mikroL direkt injeksiyon 174 K, Na Biyolojik maddeler
Cs gibi bir tamponlu deneme
175 Cu Büyükbaş
hayvan serumu
FAAS 176
Cu, Fe, Zn Biyolojik
maddeler
FI tekniği 177
Fe Hayvansal doku İnjeksiyon tekniği 178
Cd yada Pb gibi eser elementlerin FAAS ile direkt belirlenmesi özel şartlarda ve yayınlanmış makalelere göre de tam bir şüphecilikle gerçekleştirilmesi gereklidir. Bu elementlerin sonuçları için yeteri kadar hızlı bir ölçüm birtakım laboratuarlarda yapılmıştır (179).
Direkt olmayan prosedürler de şöyle tanımlanabilir, örneğin; ilave edilen bakırla sebze materyallerinde şekerin belirlenmesi gibi yöntemler FAAS ile gerçekleştirilebilir (180). Benzer şekilde klor da ilave edilen gümüş sayesinde bitkilerde ve öz sularında belirlenebilmektedir (181,182). FAAS ile yapılacak tayinler için klasik ön çözünürleştirme yerine tamamen farklı yöntemler olan kapalı sistemlerde otomatik FI ve on-line çözünürleştirme geliştirilmiştir.
Kan ve İdrar’daki Kurşun, Alev Metodu (183)
Kan analizlerinde numune hazırlığında proteinlerin uzaklaştırılması gerekmektedir, bu da TCA (Triklor asetik asit) kullanılarak yapılır. APDC/MIBK (Amonyum pirrolidin ditio-karbamat / Metil izo-butil keton) karışımı kullanılarak sıvı süpernatant’dan kurşunun ekstraksiyonu ile işleme devam edilir. APDC/MIBK ekstraksiyonundan önce idrarın basitçe asitlendirilmesi sadece bir kereye mahsus bu örnek tipi için gereklidir.
KAPİTO ve arkadaşları (184) kandaki kurşun tayininde hata kaynakları üzerine bir çalışma da yapmışlardır. Bu çalışma ilk ekstraksiyon ile kurşunun %96’dan fazlasının kazanıldığını göstermiştir. Bu yöntem diğer metotlardan daha avantajlıdır. KAPİTO’nun çalışması elektrotermal metotları içermemektedir. Yöntemde %5’lik TCA ve %1’lik APDC kullanılmıştır. Çalışma Perkin-Elmer model 214 ünitesi ile Hava-Asetilen aleviyle yapılmış ve ölçümler 2170 A°’da gerçekleştirilmiştir.
Kan için; 10mL %5’lik TCA, 5mL tam kana ilave edilir. Sonra numuneler bir saat bekletilir ve cam kaplarda saklanır. Santrifüj edilir ve süpernatant dekante edilir. 10mL destile su kalıntıya ilave edilir ve yeniden santrifüjlenir. Sıvı kısım ilk süzüntüyle birleştirilir ve karıştırılır. 0.6mL 0.5N NaOH ilave edilerek pH 2.2- 2.8 aralığına getirilir. Bu karışıma 5mL MIBK ve 1mL %1’lik APDC çözeltisi ilave edilir. 10dk Mekanik olarak karıştırılır ve sıvı organik fazda kurşun tayin edilir. Standartlar 0, 0.2, 0.5, 1 ve 2 ppm kurşun çözeltileridir, %5’lik TCA’da benzer şekilde hazırlanmıştır. Keton ilave edildiğinde bir emülsiyon yapı oluşuyorsa örnek santrifüj edilip dekantasyon yapılır.
İdrar için; %5’lik TCA ile 30 mL idrarın pH’ı 2.2- 2.8 aralığına getirilir. 5mL MIBK ve 1mL %1’lik APDC ilave edilir. 10dk mekanik olarak karıştırılır ve organik fazda kurşun tayin edilir. Standartlar 0, 0.2, 0.5, 1 ve 2 ppm kurşundur. Eğer emülsiyon yapı varsa 10dk santrifüj edilip dekantasyon yapılır.
İnsan Karaciğer Dokularında Bakır, Kadmiyum Ve Çinkonun Belirlenmesi (185) Bu metot yaklaşık 5- 15mg taze canlı dokular ve biyopsi örneklerine uygulanabilmektedir. Girişimlerle ilgili çalışma, yazarın belirttiğine göre, önemli ölçüde asidik çözeltilerdeki tuzlardan ileri gelmektedir. Buna rağmen (NBS) büyükbaş hayvan karaciğer serumu standardının analizinde bu matriks etkisinin önemli derecede olmadığı görülmüştür. Bu yüzden matriks standartlar doku analizi için çok fazla öneme sahip değildir fakat dikkatli çalışma gerektirir.
Cu ve Cd analizinde grafit fırın kullanılmıştır. Zn tayininde Hava-Asetilen alevi kullanılmıştır. Çünkü her ne kadar grafit tüp metodu alevden 100 kat daha hassas ve Zn için ideal görülse de ultra hassas grafit tüp kullanıldığında kontaminasyon hatalarının önemli ölçüde olduğu tespit edilmiştir. Araştırmacının orijinal laboratuar şartlarında çinko kontaminasyonunun elimine edilmesi mümkün değildir ve grafit fırında rutin analizlere bu element için uygun değildir. Buna karşın yüksek konsantrasyondan ötürü alev atomlaştırıcı kullanıldığı zaman Zn’li kontaminasyon hatalarının önemsiz olduğu bulunmuştur.
2.2 CİHAZIN TANITIMI (186)
Atomik absorpsiyon spektrometri (AAS) için cihazlar, aşağıdaki şekilde gösterilen genel tasarıma uyar ve ışın kaynağı, numune tutucu, dalga boyu seçicisi, dedektör, sinyal işleyici ve göstergeden oluşur. Atomik absorpsiyon cihazlarında numune tutucu, gaz halinde atomlaşmış numune içeren atomlaştırma hücresidir.
Şekil.2 AAS Spektrometrisi diyagramı Kaynak lamba > Numune kabı > Dalga boyu seçici > Dedektör > Sinyal işleyici 2.2.1 Işın Kaynakları
Atomik absorpsiyonu esas alan analitik yöntemler elektronik geçiş enerjilerinin her elemente özgü ve atomik absorpsiyon çizgilerinin önemli derecede dar olması sebebiyle (0.002- 0.005 nm) oldukça spesifiktir. Diğer yandan, sınırlı çizgi genişliği moleküler spektroskopide karşılaşmadığımız bir problem getirir. Analitik sinyal (absorbans) ve derişim arasında doğrusal bir ilişki olması için (BEER yasası) ışık kaynağının bant genişliğinin bir absorpsiyon pikinden daha dar olmasını gerektirir. İyi kalite de monokromatörler dahi, atomik absorpsiyon çizgilerinin genişliğinden önemli derecede geniş etkin bant genişliğine sahiptir. Sonuç olarak, atomik absorpsiyon ölçümleri, sürekli ışık kaynaklı spektrofotometreler kullanıldığı zaman, doğrusal olmayan kalibrasyon eğrileri kaçınılmazdır. Üstelik bu cihazlarla elde edilen kalibrasyon eğrilerinin eğimleri küçüktür, çünkü monokromatör slitinden geçen ışının yalnızca küçük bir kesri numune tarafından absorplanır; sonuç zayıf duyarlılıktır.
Atomik absorpsiyon piklerinin sınırlı genişliğinden oluşan problem, absorpsiyon piklerinden daha dar bant veren çizgi kaynaklarının kullanımıyla çözülmüştür. Örneğin, 589,6 nm’deki sodyum pikinin absorbansı, sodyum tayini için kullanılacaksa, aynı dalga boyunda sodyum emisyon piki izole edilip bu amaçla kullanılır. Bu durumda, çizgi elektriksel boşalım ile sodyum atomlarının uyarıldığı bir sodyum buharı lambası vasıtasıyla oluşturulur. Kaynaktan yayılan diğer sodyum çizgileri filtreler ile veya nispeten ucuz monokromatörler ile süzülür. Kaynağın çalışma şartları, yayılan çizgilerin Doppler genişliğinin alev yada diğer atomlaştırıcılarda absorpsiyon pik genişliğinden daha az olacak şekilde seçilir. Yani kaynak sıcaklığı atomlaştırıcı sıcaklığın altında tutulur.
Bu yöntemin dezavantajı, her bir element için (veya birkaç element için) ayrı lamba gerekmesidir.
2.2.2 Oyuk Katot Lambaları
Atomik absorpsiyon ölçümleri için en yaygın kaynak şekil.3’te gösterilen oyuk katot lambalarıdır.
Şekil.3 Oyuk katot lambası.
Bu tip lambalar 1-5 torr basınçta argon veya neon ile doldurulmuş bir cam tüp içinde, bir tarafı kapalı silindirik katot ve bir tungsten anottan ibarettir. Katot, spektrumu istenen metalden veya bu metalin bir tabakasını desteklemede kullanılan başka bir metalden imal edilir.
Elektrotlar arasına 300V civarında bir potansiyel uygulanınca, inert gaz atomları iyonlaşır. İyonlar ve elektronlar elektrotlara göçerken, 5-15 mA’lik bir akım oluşur. Potansiyel farkı yeterli ise, yüksek hızla katoda çarpan katyonlar, katot yüzeyindeki atomlardan bazılarını koparıp gaz fazına geçirir. Bu süreç sıçrama adını alır.
Katodun silindirik yapısı, metal tüpün sınırlı bir bölgesinde ışını yoğunlaştırır; bu tasarım cam duvardan çok katot yüzeyinde atomların birikme olasılığını arttırır.
Oyuk katot lambasının verimi onun geometrisine ve çalışma potansiyeline bağlıdır. Yüksek potansiyel, dolayısıyla yüksek akım, daha büyük şiddette ışımaya yol açar. Bu avantaja karşılık, lambadan oluşan çizgilerin Doppler genişlemesi problemi artar. Ayrıca daha büyük akım, atom bulutu içerisinde uyarılmamış atomların sayısında bir artış oluşturur. Uyarılmamış atomlar, uyarılmış atomlardan yayılan ışınları absorplama yeteneğindedir. Bu self-absorpsiyon, daha düşük şiddet demektir ve özellikle emisyon bandının merkezinde oluşur.
Çeşitli oyuk katot lambaları piyasada satılmaktadır. Bazılarının katodu birkaç metalin karışımını içerir; bu lambalar tek bir element yerine birkaç elementin tayininde kullanılır.
2.2.3 Spektrofotometreler
Genelde, cihaz analizin duyarlılığını azaltan veya girişim yapan diğer çizgilerden ölçüm çizgisini ayırmak için yeterli dar bant genişliği sağlayabilmelidir. Görünür bölgede birkaç geniş aralıklı rezonans çizgisine sahip olan alkali metallerin bazıları için bir cam filtre yeterlidir. Her bir element için ayrı bir filtre ve kaynak kullanılır. 22 metalin analizinde yeterli sonuç alındığı bilinmektedir. Bununla beraber pek çok cihaz, 1A° mertebesinde bant genişliğine ulaşılabilen iyi kalite ultraviyole / görünür bölge monokromatörüyle donatılmıştır.
Çoğu atomik absorpsiyon cihazında transduser olarak, fotoçoğaltıcı tüpler kullanılır. Elektronik sistem, alevden gelen sürekli sinyal ve kaynaktan gelen modüle sinyal arasındaki ayırmayı yapacak durumdadır. Piyasadaki pek çok cihaz verileri işlemek, kontrol etmek ve cihaz değişkenlerinin kontrolü için kullanılan mikro bilgisayar sistemlerine bağlıdır.
2.2.4 Alev atomlaştırıcılar
Şekil.4 tipik bir laminar akışlı bekin diyagramıdır. Yükseltgen akışı ile oluşan aerosol; yanıcı ile karışır ve çok küçük damlacıklar dışındaki sıvı damlalarını bertaraf etmek için, bir seri yüzeye çarptırılır. Çarpmalar sonucu numunenin büyük çaplı damlaları karışım odasının dibinde toplanır ve oradan bir atık kabına gider. Aerosol, yükseltgen ve yanıcı genellikle 5-10cm uzunluğunda bir alev oluşturan yarıklı bir bek içinde yakılır.
Şekil.4 Laminar akışlı bek
2.2.5 Alev Atomlaştırıcıların Performans Özellikleri
Tekrarlanabilirlik bazında, alev atomlaştırma şimdiye kadar atomik absorpsiyonda sıvı numune girişi için geliştirilen diğer tüm yöntemlere üstün görünür. Numune verme verimi ve dolayısıyla duyarlılık yününden ise, diğer atomlaştırma yöntemleri belirgin olarak daha iyidir. Alevin düşük numune verme verimi iki sebebe dayandırılır. Birincisi, numunenin büyük bir kısmı atığa geçer. İkincisi, alev içerisindeki optik yolda tek tek atomların kalma süresi kısadır (yaklaşık 10 –4 s).Bir alev atomlaştırıcıda, atomlaşmanın oluştuğu bir alev içine numune çözeltisi yanıcı gaz ile karışan yükseltgen gaz akışıyla taşınır ve püskürtülür. Şekil 4te gösterildiği gibi alevde, birbirleriyle bağlantılı olarak oluşan karmaşık bir grup süreç söz konusudur. İlk olarak çözücü buharlaşır ve çok ince dağılmış bir moleküler aerosol oluşur. Bu olaya çözücünün uzaklaşması denir. Sonra bu moleküllerin çoğunun ayrışması sonucu bir atomik gaz oluşur. Bu şekilde oluşan
atomların çoğu, katyonlar ve elektronlar vermek üzere iyonlaşır. Şüphesiz, yanıcı gazın numunedeki çeşitli türlerle ve yükseltgenle etkileşimi sonucu alevde, başka molekül ve atomlar da oluşur.
Şekil.5 Alev atomizasyonda atomlaşma prosedürü
↓
↓
↓
→
→
hγ atomik↕
→
→
hγ atomik↕
→
→
hγ atomikŞekil.5’te belirtildiği gibi, alevin ısısıyla moleküller, atomlar ve iyonların bir kısmı da uyarılır. Bu yüzden atomik, iyonik ve moleküler emisyon spektrumları oluşur. Oluşan çok karmaşık işlemler göz önüne alınırsa, alev spektroskopide atomlaştırmanın en kritik basamak olması ve yöntemin kesinliğini de sınırlaması sürpriz değildir. Atomlaşma basamağının kritik özelliği gereği, alevin özelliğini ve bu özellikleri etkileyen değişkenleri anlamak önemlidir.
Analit çözeltisi Spr ey Katı/gaz aerosol Gaz halindeki moleküller Ato mlar Atomik iyonlar Uyarılmış iyonlar Uyarılmış atomlar Uyarılmış moleküller
2.2.6 Alev Tipleri
Tablo.10’da alev spekroskopide kullanılan yanıcı gazlar ve yükseltgenler ile bu karışımların her biriyle ulaşılan yaklaşık sıcaklıkları belirtilmiştir. Yükselten olarak hava kullanıldığında, çeşitli yanıcılarla 1700° - 2400°C sıcaklıklar elde edildiğine dikkat edilmelidir. Bu sıcaklıklarda sadece kolaylıkla bozunan numuneler atomlaştırılır. Daha refraktif numuneler için, oksijen yada nitröz oksit yükseltgen olarak kullanılmalıdır. Yaygın olarak kullanılan yanıcılar bu yükseltgenle 2500° – 3100°C sıcaklık oluşturur.
Tablo.10 Alev özellikleri
Yanıcı Yükseltgen Sıcaklık Maksimum yanma
hızı (cm s-1)
Doğal gaz Hava 1700-1900 39-43
Doğal gaz Oksijen 2700-2800 370-390
Hidrojen Hava 2000-2100 300-440
Hidrojen Oksijen 2550-2700 900-1400
Asetilen Hava 2100-2400 158-266
Asetilen Oksijen 3050-3150 1100-2480
Asetilen Nitröz oksit 2600-2800 285
Tablo.10’da belirtilen yanma hızları, alevlerin yalnızca belirli aralıklardaki gaz akış hızlarında kararlı olması nedeniyle önemlidir. Gaz akış hızı yanma hızını aşmazsa, alev bek içinde kendi kendine geriye ilerler. Akış hızı arttıkça akış ve yanma hızlarının eşit olduğu bir noktaya ulaşıncaya kadar alev yükselir. Bu bölge alevin kararlı olduğu yerdir. Yüksek akış hızlarında alev yükselir ve sonunda bekin söndüğü noktaya ulaşılır. Bu faktörler, yanıcı/ yükseltgen karışımının akış hızını kontrol etmenin önemini gösterir. Bu akış hızı yanıcı cinsine ve kullanılan yükseltgene oldukça bağlıdır (186).
2.3 AAS’DE GİRİŞİMLER
Atomik absorpsiyon yöntemlerinde iki tip girişimle karşılaşılabilir. Girişim yapan türlerin absorpsiyon yada emisyon çizgileri, analitin esas çizgisiyle örtüşürse veya monokromatörün ayıramayacağı kadar ona yakın olduğu zaman spektral girişim ortaya çıkar. Kimyasal girişimler, analitin absorpsiyon karakteristiklerini değiştiren ve atomlaşma sırasında oluşan çeşitli kimyasal işlemlerden ileri gelir (187,188).
2.3.1 Spektral Girişimler
Oyuk katot kaynaklarının emisyon çizgilerinin çok dar olması sebebiyle, çizgilerin örtüşmesinden ileri gelen girişim az görülür. Böyle bir girişimin oluşması için iki çizgi arasında 0.1°A’dan daha az fark olması gerekir. Örneğin, alüminyumun 3082.15°A’daki absorpsiyon çizgisine dayanan bir analizde, 3082.11° A’daki bir vanadyum çizgisi girişim yapar. Girişim alüminyum için bu çizgisi yerine 3092.7 °A’daki çizgisi kullanılarak önlenebilir (189,190).
Spektral girişimler, ışınların saçılmasına sebep olan katı tanecikli ürünlerden veya geniş bant absorpsiyonu oluşturan yanma ürünlerinden de ileri gelir. Her ikisi de gelen ışın gücünü zayıflatır ve pozitif analitik hataya sebep olur. Bu ürünlerin kaynağı yalnızca yanıcı ve yükseltgen kaynağı olduğunda, düzeltmeler bir tanık çözelti aleve püskürtülerek absorbans ölçümünün yapılmasıyla kolayca sağlanabilir (186).
Çok daha sıkıntılı problemler, absorpsiyon ve saçılmanın kaynağı numune matriksi ise ortaya çıkar. Bu durumda geçen ışın gücü matriks bileşenleri tarafından azaltılır, fakat gelen ışın gücü azaltılmaz; sonuçta absorbansta , dolayısıyla derişimde pozitif hata olur. Absorpsiyondan ileri gelen potansiyel matriks girişiminin bir örneği, toprak alkalilerin bir karışımında Ba tayininde görülür. Analizde kullanılan Ba çizgilerinin dalga boyu, CaOH’den kaynaklanan geniş absorpsiyon bandının merkezinde yer alır. Ba analizinde Ca’un girişim yapacağı açıktır. Bu özel problem, CaOH’nin bozunması ve ona ait absorpsiyon bandının giderilmesi için daha yüksek bir sıcaklık ve bunun için yükseltgen olarak hava yerine nitröz oksidin seçilmesiyle kolaylıkla yok edilebilir (186).
Saçılmadan ileri gelen girişimler, numunenin organik türler içerdiği veya numuneyi çözmede organik çözücüler kullanıldığında da bir problem olabilir. Burada organik matriksin tam olmayan yanma ürünleri, ışın saçılmasına sebep olan karbonlu tanecikler bırakır.
Alev atomlaştırmada, matriks ürünlerinin spektral girişimleriyle geniş ölçüde karşılaşılmaz ve çoğu zaman sıcaklık ve yanıcı/yükseltgen oranı gibi analitiksel değişkenler ile önlenebilir. Alternatif olarak girişim kaynağı bilinirse, girişim yapan maddenin aşırısı numune ve standartlara ilave edilebilir. Standart numuneye ilave edilen matriks derişiminin, numune matriksine göre büyük olması halinde, numune matriksinin katkısı önemsiz olacaktır. İlave edilen maddeye bazen ışın tamponu denir.
Döteryum lamba ultraviyole bölgedeki sürekli ışın kaynağını oluşturur. Sürekli ışın kaynağı ve oyuk katot lambasından gelen ışınlar yol üzerindeki kesicinin tasarımı sayesinde, atomlaştırıcıdan sırayla geçer. Döteryum ışınının absorbansı, analit ışının absorbansından çıkarılır. Numune atomları tarafından absorplanan sürekli ışın kesri ihmal edilsin diye slit genişliği olabildiğince geniş tutulur. Böylece atomlaşmış numune içinden geçişi sırasında, sürekli ışının gücündeki azalma, yalnızca numune matriksi bileşenleri tarafından saçılma veya geniş bant absorpsiyonunu yansıtır. Böylece bir zemin düzeltme yapılır. Görünür bölgede döteryum lambanın ışın çıkışı, 350 nm’den daha büyük dalga boylarında bu düzeltme işleminin kullanımını imkansız kılacak kadar düşüktür (186,191,192,193).
2.3.2 Kimyasal Girişimler
Kimyasal girişim etkileri çoğunlukla uygun çalışma koşulları seçimiyle minimuma indirilebilir.
Belki de en yaygın girişim, analit ile uçuculuğu az bileşikler oluşturan ve böylece atomlaşmayı geciktiren anyonların girişimleridir. Örneğin, belirli bir Ca derişiminde anyon/katyon oranı yaklaşık 0.5 oluncaya kadar artan sülfat veya fosfat derişimiyle, absorbans orijinal değerin %30-50’sinde dengelenir ve anyon derişiminden bağımsız olur. Katyon derişimi değişmesi de benzer şekildedir.
Düşük uçuculuktaki türlerin oluşumundan dolayı girişimler çoğu zaman daha yüksek sıcaklık kullanımıyla giderilebilir veya azaltılabilir.
Alternatif olarak girişim yapan türlerle tercihen reaksiyon veren veya analitle onun etkileşmesini önleyen bir katyon olan serbestleştirici reaktifler kullanılabilir. Örnek olarak stronsiyum ve lantan verilebilir (186,194,195,196,197).
2.3.3 Spektral Girişimlerin Giderilmesi
Spektral girişimler direkt çizgilerin çakışmasından dolayı oluşmaktadır ve bir alternatif analitik çizginin değiştirilmesiyle en iyi şekilde bertaraf edilebilir (198,199,200).
Backgroundun azalmasında uçucu olmayan yada çözünmeyen örnek içeriği rol oynar. Bu girişim atomizerde etkin sıcaklığın artırılmasıyla tamamen yada oldukça fazla oranda yok edilebilmektedir (201).
Günümüzde enstrümental teknikler background azalmasına sebep olan girişimlerin yok edilmesinde geliştirilmektedir. Bu iki çok önemli teknikte sürekli kaynak BC ve Zeeman-etkisi BC’dir. Hem FAAS hem de GFAAS’DE sürekli kaynak BC sıkça kullanılır. GFAAS’de ise bunun yanında Zeeman-etkisi BC artan şekilde kullanılmaktadır (202,203,204).
2.3.4 Spektral Olmayan Girişimlerin Giderilmesi
İdeal olarak standart ilave tekniği FAAS’de tıpkı taşıyıcı girişimler gibi tüm spesifik olmayan girişimlerin yok edilmesinde kullanılabilir.
Girişimlerin azaltılmasında ve yok edilmesinde çokça kullanılan bir teknik de test örneği ve kalibrasyon çözeltilerine spektrokimyasal tampon ilavesidir. Girişimlerin tipine göre çeşitli türden farklı tamponlardan faydalanılabilir. Viskozite gibi fiziksel şartların neden olduğu taşımadan kaynaklanan girişimler nebulizatörler kullanılarak uzaklaştırılabilir (198,199,201).
2.3.5 Kaynak Modülasyonu (186)
Tipik atomik absorpsiyon cihazında, alev tarafından yayılan ışının sebep olduğu girişimleri gidermek gereklidir. Elbette bu yayılan ışının çoğu monokromatör tarafından süzülür. Fakat alevdeki uyarılmış atomların emisyonu ile oluşan ve monokromatörün ayarlandığı dalga boyuna denk gelen ışın şiddetini arttırır. Alevden gelen ışınların etkisini gidermek için, kaynaktan gelen ışını modüle etmek yani şiddetini sabit frekansta periyodik olarak değiştirmek gerekir. Bu taktirde dedektöre iki tip sinyal ulaşır; kaynaktan gelen modüle edilmiş ışınlar ve alevden gelen sürekli ışınlar. Bu sinyaller karşılık gelecek elektriksel sinyale dönüştürülür.
Bu yöntem için basit ve tam yeterli bir yol, ışın yolunda kaynak ve dedektör arasına bir dairesel metal disk veya kesici koymaktır. Bu diskin çaprazındaki dörtte birlik parçalar ışının geçmesi için uzaklaştırılır. Sabit, bilinen bir hızda dönen disk
istenen aralıklarla kesilen bir demet oluşturur. Alternatif olarak kaynağı besleyen güç, sabit bir frekansta açılıp kapanarak, ışın kaynağı modüle edilebilir.
2.3.6 Standart İlave Yöntemleri
Matriks etkisinin büyük ölçüde var olduğu karmaşık numunelerin analizinde standart ilave yöntemleri özellikle yararlıdır. Değişik standart ilave yöntemleri vardır. En yaygın kullanılan yöntemde, aynı miktarda alınan numune kısımlarına artan oranlarda standart ilavesi yapılır. Ölçüm yapılmadan önce çözeltiler belirli hacimlere seyreltilir. Numune miktarının sınırlı olduğu durumlarda, belirli bir miktar numune üzerine artan oranlarda standart ilavesi yapılabilir. Ölçümler orijinal çözeltide ve her bir ilaveden sonra numune ile standardı içeren çözelti üzerinde ayrı ayrı yapılır. Standart ilave yöntemlerinin çeşitli şekillerde numune matriksi her bir ilaveden sonra hemen hemen aynıdır. Tek fark analit derişiminin veya analit aşırısının ilave edildiği durumlarda reaktif derişimidir. Reaksiyon karışımlarının diğer bütün bileşenleri aynıdır çünkü standartlar aynı miktar numune içermektedir.
Bu yöntem numune matriksi tarafından oluşturulan spektral ve kimyasal girişimleri tamamen veya kısmen gidermek için atomik absorbsiyon spektoroskopisinde yaygın olarak kullanılır (186).
Diğer bir standart ilave yöntemi iç standart yöntemidir. İç standart bir analizde belirli miktar numuneye, tanığa ve kalibrasyon standartlarına ilave edilen maddedir. Alternatif olarak iç standart numune ve standartlarda, derişimleri yeterince büyük ve bütün durumlarda aynı olduğu kabul edilen ana bileşen olabilir. Bu durumda kalibrasyon grafiği, analit sinyalinin iç standart sinyaline oranı kullanılarak çizilir. Yatay eksen standart çözeltideki analit derişimleridir. Numuneler için bu oran kalibrasyon eğrisinden numunedeki analit derişimlerinin elde edilmesinde kullanılır.
İç standart uygun olarak seçilmişse hem sistematik hem de rasgele hataların bazıları giderilebilir. Eğer analit ve iç standart sinyalleri rasgele, alet ve yöntemden kaynaklanan hatalara orantılı cevap verilirse, bu sinyallerin oranı bu hatalardan bağımsız olur. Bu iki sinyal matriks etkilerinden aynı oranda etkileniyorsa bu etkiler giderilebilir. İç standart, numune ve standartlar ana bileşen ise, numune hazırlama, çözeltiye alma, temizleme işlemleri esnasındaki hatalar da giderilebilir.
İç standart yönteminin kullanılmasındaki en büyük güçlük, iç standart olarak kullanılacak maddenin belirlenmesi ve hem numunelere hem de standartlara tekrar edilebilir şekilde bu maddenin ilave edilmesidir. İç standart sinyali, analit sinyaline benzer olmakla birlikte, cihaz tarafından algılanabilecek kadar ondan farklı olmalıdır. İç standardın numune matriksinde kesinlikle bulunmadığı bilinmelidir. Örneğin kanda Na ve K tayinlerinde lityum iyi bir iç standarttır, çünkü lityumun kimyasal davranışı bu iki analitede benzer, benzer fakat kanda doğal olarak bulunmaz. İç standat yöntemi emisyon spektroskopisi ile eser element tayininde sık sık kullanılır (186).Ayrıca analit ilave tekniği FAAS’de taşıma girişimlerin yok edilmesinde genellikle kullanılır. Bu girişimlere örnek olarak analiz çözeltilerinin farklı viskozitelerinin neden olduğu girişim verilebilir. Bu teknikte; her test örneği ayrı ayrı ayarlanır ki böylece kirlenme etkisi yok edilebilir. Bu teknikte ideal bir uygulamayla FAAS’deki taşıma girişimleri ve spesifik olmayan girişimleri karşılar. Öte yandan ilave girişimleri yok edemez. Bu bağlamda ilavenin tüm problemleri ile başlıca tüm spektral girişimlerde, analit kaybı ve kontaminasyon arasında bir ilişki kurulabilir. Dahası FAAS’de tıpkı iyonizasyona bağlı girişimler gibi tüm konsantrasyona bağlı girişimler analit ilave tekniği tarafından yok edilemeyebilir. Girişimlerin türleri alevdeki bileşiğin yapısından kaynaklanmaktadır; tıpkı Ca tayininde Al yada fosfat girişimi gibi konsantrasyona bağlıdır (1). Ve de analit ilave tekniği tarafından tamamen yok edilemeyebilir (204,205). Şekil.6’daki grafikler analit ilave tekniği için a) test edilen numune örneği b) şahit çözelti içindir
