Taipei Medical University Institutional Repository:Item 987654321/4376
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Tam metin
(2) 中文摘要 芝麻中含量最多的木質酚類--芝麻素，以可促進體內脂肪酸氧化 和減少脂肪酸生成而受到注目。本實驗中，採用雄性 Sprague-dawley 大鼠，經一週適應期後分為正常體重組(N)與肥胖組(F)各 30 隻，N 組 給予 AIN93G 飲食，F 組給予 45%熱量來自油脂的高脂飲食，四週後 依體重將 N 組與 F 組各分為三組並添加不同劑量的芝麻素當作實驗 飲食：N0 與 F0 組不添加芝麻素、N1 與 F1 添加 0.1%芝麻素、N5 與 F5 組添加 0.5%芝麻素於飲食中。每週測量其體重變化及攝食狀況， 給予四週實驗飲食後予以犧牲。結果指出 N5 組中，其血漿中三酸甘 油酯(TG)、總膽固醇(TC)與低密度膽固醇(LDL-C)濃度都顯著下降， 其 肝 臟 中 fatty acid synthase(FAS) 活 性 顯 著 下 降 、 carnitine palmitoyltransferase(CPT)與 acetyl CoA oxidase(ACO)活性具有增加的 趨勢，並可減少相對副腎脂肪和相對總脂肪的重量，但對體重增加情 況沒有改變。在 F5 組結果指出，血漿中 TG、LDL-C、游離脂肪酸濃 度顯著下降、高密度膽固醇濃度顯著增加，其肝臟中 FAS、Acyl CoA carboxylase 活性顯著減少、CPT、ACO 活性顯著增加，並可增加胰 島素敏感性並可減少副睪和相對副睪脂肪、副腎和相對副腎脂肪及總 脂肪和相對總脂肪的堆積情況，並可達到減輕體重的目的。. I.
(3) 關鍵詞：肥胖、芝麻素、體脂蓄積、脂質代謝、胰島素敏感性、大白 鼠. II.
(4) 英文摘要. Sesamin, a major lignan in sesame seeds and oil, has been known to increase β-oxidation and reduce lipogenesis. In this study, 30 sprague-dawley rats were fed with pure AIN-93G diet (standard diet) and 30 rats were fed with high fat diet (modified from AIN-93G containing 45% calories from soybean oil). After 4 weeks to induce obesity, rats were assigned to 6 groups: N0 (standard diet without sesamin), N1 (standard diet with 0.1% sesamin), N5 (standard diet with 0.5% sesamin), F0 (high fat diet without sesamin), F1 (high fat diet with 0.1% sesamin), F5 (high fat diet with 0.5% sesamin). The rats were weighted weekly and sacrificed after 4 weeks of experiment. Results found that there were significantly reducing in body weight, epididymal adipose tissue and adipocyte size in group F5. Supplement with sesamin led to significantly increase serum HDL-C and decrease plasma triglyceride, LDL-C, non-esterified fatty acid. Insulin sensitivity had also been improving in F5 group. Besides, there were significantly reducing in liver triglyceride and total cholesterol concentration. The enzyme activities of fatty acid synthase and acetyl CoA carboxylase were significantly decreasing in. III.
(5) group F5 and acyl CoA oxidase, carnitine palmitoyltransferase were significantly increasing in group F1 and F5. Therefore, we concluded that sesamin can improve lipid metabolism and prevent the accumulation of white adipose tissue.. Key words: obesity, sesamin, fat accumulation, lipid metabolism. IV.
(6) 致謝. 從考進北醫到現在，轉眼間就過了兩年。在這兩年裡，我經歷了 很多也學到了很多，真的要感謝我身邊的每個人，我才能順利完成這 本論文。首先要感謝我的指導老師---簡怡雯老師，謝謝老師在我的碩 士生活中無論是實驗上或是生活上給我的鼓勵，且老師也很像朋友可 以跟大家一起出遊聊天，感覺真的很棒。也要特別感謝這次擔任我口 委的楊素卿與黃惠宇老師，謝謝兩位老師在論文大綱審查時給我很多 的建議，讓我的論文方向更明確，也謝謝兩位老師在百忙之中參與我 的口試並給我諸多指導，讓我的論文更完整。另外，也要感謝林士祥 老師總是很有耐心的教我統計和軟體上的應用，真的很謝謝老師。 除了有老師們的協助外，也要感謝實驗室的芳瑄學姐，在論文撰 寫上我真的有一些障礙，真的很謝謝學姐很有耐心的幫我做仔細的修 改。以及明樺和 Keini 學姐，即使學姐們都畢業了，我ㄧ有問題她們 都很願意幫我解答，且雖然我和 Keini 相處只有短短的ㄧ個月，但是 每次在實驗很辛苦或是難過的時候，總是會想起 Keini 給我的鼓勵， 就能夠繼續勇敢拼下去。在學校的期間，很開心也很慶幸有聰明又賢 慧的又禎學姐、很貼心的梅梅、在我實驗上幫我很多的譯庭和嘉文學 長，以及我實驗室的威徹學長、力威、若君和小朋友們宜萍、蓓芳、. V.
(7) 佰玲、沛彤、加美、馨儀、小潘潘、Nash，真的很謝謝你們，因為有 你們我的實驗才能順利進行。也要謝謝我的男友亮辰，謝謝你對我無 止盡的包容和支持，都是因為有你的鼓勵我才能踏入我最愛的營養以 及能順利考上研究所。最後要謝謝我的家人，爸爸和哥哥總是給我最 大的支持，且包容我兩年內回家不到十次，也要感謝我在天上的媽 咪，雖然總是只能在夢中與您相見但相信您一定會為了現在的我而感 到驕傲。 感謝我研究生活中的每一個人，因為有你們我才能完成這本論 文，願將一切的成果歸功於你們。. VI.
(8) 目錄. 中文摘要..................................................................................................... I 英文摘要...................................................................................................III 致謝............................................................................................................V 目錄......................................................................................................... VII 表目次...................................................................................................... IX 圖目次........................................................................................................X 第一章、緒論.............................................................................................1 第二章、文獻回顧 ....................................................................................3 第一節、肥胖......................................................................................3 第二節、木質酚類(Lignan) ...............................................................9 第三節、芝麻素................................................................................13 第四節、芝麻素與肥胖....................................................................21 第五節、研究動機............................................................................23 第三章、實驗設計與方法 ......................................................................24 第一節、實驗流程............................................................................24 第二節、實驗材料與分組................................................................27 第三節、分析方法............................................................................31. VII.
(9) 第四節、統計分析............................................................................54 第四章、結果...........................................................................................55 第一節、芝麻素成分組成分析 .......................................................55 第二節、動物體重、飲食和臟器重量分析 ...................................57 第三節、體脂肪堆積分析................................................................62 第四節、血脂質濃度分析................................................................64 第五節、肝臟脂質分析....................................................................79 第六節、肝臟中酵素活性測定 .......................................................84 第七節、組織切片............................................................................92 第五章、討論...........................................................................................95 第一節、添加芝麻素飲食對於脂質代謝方面的影響 ...................95 第二節、添加芝麻素飲食對於體重和脂肪囤積的影響 .............100 第三節、添加芝麻素飲食對於胰島素敏感性的影響 .................104 第四節、添加芝麻素飲食對於血漿中 Leptin 濃度的影響.........106 第六章、結論.........................................................................................108 第七章、參考文獻 ................................................................................109. VIII.
(10) 表目次. 表 3- 1：AIN-93G 實驗飲食組成.............................................29 表 4- 1 正常體重組中 N0、N1、N5 組以及肥胖組中 F0、F1、 F5 組其實驗飲食所提供每日蛋白質、脂質、醣類、熱量 及芝麻素含量.....................................................................60 表 4- 2 芝麻素對於增加體重量及肝臟、腎臟、副睪白色脂肪、 副腎白色脂肪和總脂肪重量的影響 ................................60 表 4- 3 芝麻素對血漿中 TG、TC、NEFA、HDL-C、LDL-C、 insulin 和 leptin 濃度的影響..............................................69 表 4- 4 犧牲時大鼠肝脂質濃度和肝臟酵素活性 ...................86. IX.
(11) 圖目次 圖 2- 1、木質酚類的化學結構式 .............................................11 圖 2- 2 木質酚類的代謝 ...........................................................12 圖 2- 3、芝麻樹 .........................................................................14 圖 2- 4、芝麻 .............................................................................14 圖 2- 5、芝麻中木質酚類的化學結構(Kamal-Eldin et al., 1995) .............................................................................................16. X.
(12) 第一章、緒論. 肥胖是一個全球性的問題，且年齡有逐漸降低的趨勢。肥胖可 以視為是一種準疾病狀態，因肥胖和許多慢性病的罹患以及死亡率的 增加有很大的關係，如糖尿病、高血壓、冠狀心臟疾病、血脂異常及 癌症等。 芝麻一直是亞洲民族常用的一種食材，如糕點的餡料等，而由 芝麻中提鍊出的麻油更特別常用於台灣婦女坐月子的期間及冬令進 補的時期。在中國明代本草綱目裡也記載， 「久服芝麻可以明眼、 身輕、不老」。芝麻長久以來對於東方民族一直被視為是一種保健食 品，並有增加營養及防止老化的功效。 在先前的文獻指出，芝麻中的木質酚類---芝麻素(sesamin)，具有 調節血脂、抗氧化、保護肝臟等的功能。在先前研究指出，在正常大 鼠飲食中添加 0.1%芝麻素可顯著降低血漿中三酸甘油酯、總膽固醇 的濃度(Sugano et al., 1990; Hirose et al., 1991)，添加 0.2%芝麻素可顯 著降低 SREBP-1(Sterol regulatory element binding protein-1)的蛋白表 現情況而減少肝臟內脂肪酸合成酵素的活性(Ide et al., 2001)，添加 0.5% 芝 麻 素 可 顯 著 增 加 PPAR-α(peroxisome proliferators-activated receptors-α)的蛋白表現而增加脂肪酸氧化酵素的活性(Ashakumary et 1.
(13) al., 1999)。在本實驗中，分別選用正常體重與高脂飲食誘發肥胖之 SD 大鼠，給予三種不同劑量的芝麻素(0%、0.1%、0.5%芝麻素)，探討 芝麻素添加對於肥胖與正常體重大鼠脂質代謝及脂肪囤積的影響。. 2.
(14) 第二章、文獻回顧. 第一節、肥胖 一、 肥胖的定義和種類 在現今社會中，肥胖已經成為一個越來越普遍且嚴重的問題。台 灣地區，超過 45 歲以上的人口中，有一半以上有體重過重或肥胖的 問題。且現在肥胖者的年齡有逐漸下降的趨勢，國小學童男性三人中 就有一人有過重或肥胖的問題；女性學童每四人中有一人有過重或肥 胖的問題(行政院衛生署 2005 年)。由於肥胖使許多疾病的發生率都 增加，如高血壓、糖尿病、冠心病…等。肥胖衍生出的併發症越來越 多，但肥胖的人口卻與日俱增。因此，可以避免或治療肥胖的方法儼 然成為現今一個很重要的研究方向。 簡單的說，肥胖就是在人體中有過多的體脂肪堆積，目前普遍採 用身體質量指數(Body mass index；BMI)來評估是否肥胖。依據行政 院衛生署在 2002 年所公佈國人肥胖定義及處理原則中指出，當 BMI(即身高/體重平方)大於或等於 24 公斤/公尺 2 即為體重過重；當 BMI 大於或等於 27 公斤/公尺 2 即為肥胖(行政院衛生署 2002)。 肥胖可依據脂肪分佈的不同和容易罹患疾病的不同而分為兩 類：中間型肥胖(Central obesity)和周邊型肥胖(Peripheral obesity)。中 3.
(15) 間型肥胖又稱為內臟型肥胖(Visceral obesity)，是指脂肪囤積的位置主 要在軀幹和內臟周圍，一般來說主要發生在男性，且此種肥胖者具有 較高風險罹患心血管疾病和代謝症候群，包括血脂異常、葡萄糖耐受 不良(Shirai., 2004)、第 2 型糖尿病、高血壓和冠狀血管疾病、非酒精 性肝臟疾病、膽囊疾病、骨關節炎和一些癌症(Bray., 2004；Caterson et al., 2004 ； Kopelman, 2000) 。 週 邊 型 肥 胖 又 稱 為 臀 股 型 肥 胖 (Gluteofemoral obesity)，是指脂肪的囤積主要在臀部，這類型的肥胖 主發生在女性，而與心血管疾病罹患的相關性沒有中間型肥胖來的高 (Shirai., 2004)。. 二、 肥胖的成因 形成肥胖的原因有很多，例如遺傳、疾病的因素、熱量攝取不平 衡、環境因素、心理因素、及生活習慣等...，其中飲食是最大的因素。 雖然遺傳和生活環境會先天性的影響到個人是否具有肥胖或體重過 重的傾向，但飲食(包括攝取多少食物和能量、攝取食物的心態、運 動習慣)相較於遺傳因子，對於個人是否成形成肥胖具有更大的影響 力(Moreno and Rodriquez, 2007)。先前也有文獻指出，曾對於家族、 雙胞胎和養子(作為同樣生活習慣但沒有遺傳基因的比較)做對於. 4.
(16) BMI 的相關研究，其結果指出遺傳對於 BMI 的影響力約只有低於 30%，單只有遺傳這個因素所造成現今逐日遽增的肥胖和過重問題是 不可能的，其主要仍是由於生活型態的改變所造成的(Miller et al., 2004)。另外，其他與生活型態改變相關的因子，如飲食組成的改變， 也會影響人體內能量的平衡並會促進肥胖的形成(Swinburn et al., 2004；Caterson et al., 2002)。 肥胖的形成主要是由於能量攝入和消耗的不平衡所導致的，當攝 入的能量大於身體所需及消耗的能量，這些過多的能量便會以脂肪組 織的形式儲存在人體中(Prentice and Jebb, 1995)。由於脂肪是人體高 能量密度的儲存型態，15 公斤的體脂肪就可提供人體兩個月內生存 所需的熱量，且脂肪組織又具有非常好的膨脹能力，可藉由增加細胞 的 數 目 以 及 增 大 1000 倍 細 胞 自 身 的 容 積 來 儲 存 三 酸 甘 油 酯 (Triglyceride)(Prentice and Jebb, 1995)。在飽食狀態下，胰島素會提高 葡萄糖進入脂肪組織的能力(增加 glycerol 3-phosphate 用以提供脂肪 酸酯化成三酸甘油酯所需的能量)，並直接提高脂肪酸合成酵素的活 性，促使脂肪組織中三酸甘油酯的儲存(Tordjman et al., 2003)。故當 人體攝取過多能量時，身體便會以脂肪組織的形式來囤積過多的能量 (Fruhbeck et al., 2001)。. 5.
(17) 三、 肥胖者體內代謝異常的情況 依據先前的文獻指出，不論種族、年齡和性別，肥胖與胰島素抗 性具有很大的相關性(Fujioka et al., 1987；Brambilla et al., 1994； Berman et al., 2001)。肥胖者體內有胰島素抗性的問題主要是由於胰 島素接受器(insulin receptor)的向下調控(down-regulation)所導致的， (Gavin et al., 1974；Bar et al., 1979)。 胰島素抗性的情況也會導致肥胖者容易罹患疾病，如慢性腎臟疾 病(Wahba et al., 2007)、第 2 型糖尿病(Moller and Flier, 1992)、動脈硬 化(Howard et al., 1996)等。另外，高血壓、左心室肥大和都和胰島素 抗性有極大的關連，這些原因也會造成後續的心臟衰竭的發生(Ho et al., 1993；He et al., 2001；Ingelsson et al., 2005)。 肥胖者和過重者體內常有高血壓的情況發生(Must et al., 1999)。 依據先前研究指出，70%的肥胖男性和 60%的肥胖女性其體內血脂異 常的情況是與其肥胖具有直接的關係(Zakharieva, 1999)。在 1975 年 Miller 等人的研究中也指出，肥胖者體內會有 HDL-C(high density lipoprotein)降低及 LDL-C(low density lipoprotein)增加的情況(Miller and Miller, 1975)。且肥胖者體內胰島素抗性的情況會增加體內脂肪細 胞內三酸甘油酯的水解及促使游離脂肪酸進入血液循環中，並且減少 游離脂肪酸被攝入脂肪細胞中，更增多循環中游離脂肪的量(Kahn. 6.
(18) and Flier, 2000)。因此，肥胖者體內由於胰島素抗性而導致的高三酸 甘油酯症會使肝臟和脂肪組織間的游離脂肪酸及由 VLDL(very low density lipoprotein)所攜帶的三酸甘油酯大幅增加(Gavrilova et al., 2000)。. 四、 肥胖者易罹患的疾病與其死亡率 肥胖的逐漸增加是現今公共衛生的重擔，因肥胖會引起謝症候 群，指當罹患以下五項危險因子中三項以上，即判定為代謝症候群： (1)腹部肥胖：男性腰圍≧90 公分，女性腰圍≧80 公分(2)血壓上升： 收 縮 壓 ≧130mmHg ， 舒 張 壓 ≧85mHg(3)HDL-C 過 低 ： 男 性 <40 mg/dl，女性<50 mg/dL(4)空腹血糖值上升：空腹血糖≧100 mg/dL(5) 三酸甘油酯上升：TG ≧150 mg/dL(行政院衛生署 2007 年)，且肥胖 也會造成許多慢性疾病的發生，例如：高血壓、胰島素抗性、第 2 型 糖尿病、動脈硬化及冠狀心臟疾病(Yusuf et al., 2004)。 流行病學調查的結果指出，肥胖人口的死亡率與一般正常體重者 相較，肥胖者有較高的趨勢(Robert and Kushner, 1993)。在先前很多 大型公共衛生調查研究結果都指出，當體重超過標準體重，其死亡都 顯著上升(Dorothy, 1959; Scott, 1979)，此結論也經由許多科學家的統 整 及 許 多 大 型 和 長 期 的 前 瞻 性 研 究 所 證 實 (Simopolous and Van,. 7.
(19) 1984)。引用 Sjostrom 在 1992 年綜合 40 篇研究所做出 BMI 與死亡率 相關曲線指出，當 BMI 大於 35kg/m2 者，其死亡率大約是平均死亡 率的 2 倍，罹患腦血管、心血管疾病及糖尿病的機率是遠高於一般人 (Sjostrom, 1992)。並且在一個研究肥胖和心血管疾病的大型研究中， 針對 Nurse’s Health Study 中 115,886 位女性受試者，其年齡介於 30-55 歲，其中 98%為白人，進行為期 8 年的追蹤研究，在排除了年齡和抽 菸的因素後，發現體重與是否會罹患心血管疾病有顯著的的正相關； 高 BMI 的女性族群(BMI＞29 kg/m2)與一般女性(BMI＜21 kg/m2)相 較，其罹患心血管疾病的機率約為 3.5 倍(Manson et al., 1990)。 肥胖者所罹患的疾病大多為慢性疾病，這也是肥胖造成死亡率增 加的主因，尤其是心血管疾病。在臨床上，肥胖者常會因為其血管彈 性不佳及血管阻塞的因素，而罹患心血管疾病。在孩童或是青春期就 形成肥胖者，其體內較多的脂肪組成與其成年後罹患心血管疾病而致 死的情況有顯著的相關性(Hanson et al., 1992; Vinik et al., 1992)。很多 研究也指出，肥胖會損害血管的功能(Singhal, 2005)。肥胖者體內其 內皮調節的血管擴張反應有受損的情形(Arcaro et al., 1999)，且肥胖者 體內會有較嚴重的動脈硬化情況(Tounian et al., 2001)及脂肪的堆積情 形，動脈硬化及脂肪堆積使中風及心肌梗塞的發生機率大幅度增加 (Resnick et al., 1997)。. 8.
(20) 第二節、木質酚類(Lignan) 一、 木質酚類的簡介 植物雌激素(Phytoestrogen)是自植物衍生出的物質，其具有類似 雌激素(estradiol)的功能和結構，可與細胞中的女性荷爾蒙接受器結 合，而產生類似類似女性荷爾蒙的作用(Limer and Speirs, 2004)。依據 先前的研究指出，植物雌激素主要具有降低乳癌和子宮頸癌的發生 (Murkies et al., 1998)，改善停經後婦女的不適症狀(Ganz et al., 1998)， 並可改善更年期女性的血脂代謝異常和高血壓的情況而達到預防動 脈硬化的發生(Tempfer et al., 2007)。 植物雌激素主要可分為兩類：木質酚(lignan)和大豆異黃酮素 (isoflavine)。木質酚類主要是以配醣體的形式存在食物中，存在的食 物包括全穀類、豆類、亞麻籽、芝麻、蔬菜、乾果仁、以及水果中(Mazur and Adlercreutz, 1998)。依文獻指出，木質酚可預防乳癌、前列腺癌、 直腸癌，以及心血管疾病等的發生(Adlercreutz., 2007)。. 9.
(21) 二、 木質酚類的代謝 食物中的多酚類食用後被小腸吸收，無法被消化吸收的多酚類經 過大腸中微生物的作用後由糞便中排出。可被人體代謝的多酚類則進 入肝臟中進行代謝，多酚類的產物再經由肝臟進入其他組織中，最後 進入腎臟由尿液排出體外(Scalbert and Williamson, 2000)。 多酚類分為 phenolic acid、flavonoids、stilbenes 和 lignans，其中 後三者又由於其結構類似於 estrogen 又稱為 phytoestrogen(Lampe et al., 2006)。木質酚類在植物中主要是以配醣體的形式存在，經由人體 腸道內細菌消化後，其中一部分的醣基會水解並釋放出 aglycones， 而此水解是經由人體腸道黏膜絨毛刷緣上的 β-glucosidase 所進行 (Rowland et al., 2003)。而 aglycones 可直接被吸收或可經由腸道細菌 再 代 謝 成 enterolignan ， 如 圖 2-2 所 示 ， MAT(matairesinol) 和 SECO(secoisolariciresinol) 會 經 由 去 氫 氧 基 和 去 甲 基 化 而 形 成 ENL(enterolactone)和 END(enterodiol)(Lampe et al., 2006)。. 10.
(22) 圖 2- 1、木質酚類的化學結構式. 11.
(23) 圖 2- 2 木質酚類的代謝. 12.
(24) 第三節、芝麻素 一、芝麻 芝麻(Sesamum indicum, Pedaliaceae)，又名巨勝、胡麻。芝麻中 脂肪含量約 50%，蛋白質約 20%，醣類約 20%，以及多種木質酚類 (lignans)和其他物質，如維生素 E 及 B 群，鈣、鐵等礦物質(Weiss, 1983)。由於芝麻富含油脂，又稱為油麻、脂麻，且其外型小稱為「狗 蝨」 ，而在台灣也有麻仔及烏麻的稱呼。 芝麻對於東方人來說，一直是一種天然的保健食品，像是在《神 農本草經》裡也記載，「芝麻補五內、益氣力、長肌肉、填髓腦。久 服，輕身不老」。另外，自芝麻萃取出的油脂與植物油相比，其穩定 性非常高，也具有不易酸敗的特性(Budowski, 1964)。. 13.
(25) 圖 2- 3、芝麻樹. 圖 2- 4、芝麻 14.
(26) 二、芝麻素(Sesamin) 芝 麻 中 的 木 質 酚 類 有 sesamin 、 sesamolin 、 sesamol、 sesamol dimer、sesamolinol、sesaminol(圖 2-5)(Kamal-Eldin et al., 1995)。其中， 芝麻素是芝麻中含量最多的木質酚類，佔芝麻中的 0.5%。芝麻素具 有許多生理功能，例如調控血脂、抗氧化(Yamashita et al., 1992)、降 低血膽固醇(Hirose et al., 1991; Gu et al., 1995; Ashakumary et al., 1999; Hirata et al., 1996)、抗高血壓(Matsumura et al.,1995；Matsumura et al., 1998)、及抗癌(Hirose et al., 1992)等。. 15.
(27) 圖 2- 5、芝麻中木質酚類的化學結構(Kamal-Eldin et al., 1995). 16.
(28) 二、 芝麻素在抗氧化上的影響 同時給予芝麻素以及維生素 E，可協同性的增強維生素 E 的抗氧 化能力。先前文獻給予自願的受試者含有芝麻的鬆餅，其中含量相當 於每天給予 35mg sesamin 和 13mg sesamolin，三天後其血漿中的 γ-tocopherol 顯著增加 19%(Cooney et al., 2001)。在 Frank 等人的文獻 中也指出，食用芝麻鬆餅的自願受試者，其尿液中 γ-tocopherol 的排 出量顯著的比沒有吃芝麻鬆餅的控制組少，這也指出芝麻素是具有抑 制 γ-tocopherol 異化的作用(Frank et al., 2004)。在人體和動物體內， 都可觀察到攝入芝麻素者其體內 γ-tocopherol 都具有較高的生理活性 (Yamashita et al., 1992; Kamal-Eldin et al., 2000; Sontag and Parker, 2002)。 動物實驗方面，給予老鼠 50mg α-tocopherol/kg 以及芝麻，老鼠 腦中 α-tocopherol 的濃度顯著比給予 500mg α-tocophero/kg 而沒有給 予 芝 麻 的 老 鼠 高 (Abe et al., 2005) 。 此 結 果 指 出 當 要 維 持 腦 中 α-tocopherol 的濃度以及抑制脂質過氧化時，在飲食中添加芝麻比給 予大量的 α-tocopherol 具有更好的效果(Abe et al., 2005)。 芝麻素的給予，可抑制血管內過氧化物(O2-)的生成(Nakano et al.,2002)。因減少了血管內過氧化物的生成，而減少血管受過氧化物 的傷害，避免血管內皮調節的血管擴張反應受損，進而達到抗高血壓. 17.
(29) 的目的。. 三、 芝麻素在血脂代謝上的影響 人體實驗方面，在 Hirata 等人的實驗中，給予 12 個患有高血 脂症的病人每天 32mg 的芝麻素膠囊四週後，接著再給予每天 65mg 芝麻素膠囊四週後，可顯著降低其血中總膽固醇(9%)、LDL-C(16.5%) 及 apoprotein B(10.5%)(Hirata et al., 1996)。另一個實驗中，給予 21 個高血脂症的受試者，每天 40g 的芝麻 4 週後，其可顯著減少其血中 的總膽固醇(6.4%)及 LDL-C(9.5%)濃度。另外，在台灣 1993-1996 國 民營養健康狀況變遷調查結果指出，對於具有罹患高膽固醇血症風險 的停經後婦女及患有高膽固醇血症的患者，在其飲食中有食用到芝麻 者，其血中的總膽固醇及 LDL-C 濃度都顯著下降(Chang et al., 2002)。 而在動物實驗方面，給予雄性 Wistar 鼠 0.5%芝麻素四週後，與 沒有給予芝麻素的控制組相較，芝麻素的給予可以顯著減少血液與肝 臟中膽固醇和三酸甘油酯的濃度，並可減少腸道對於膽固醇的吸收， 進而促進膽固醇以膽酸的形式排出體外(Hirose et al., 1991)。且將給予 芝麻的老鼠，與沒有給予芝麻的控制組相較，其過氧化小體中脂肪酸 氧化速率增加達三倍以上(Sirato-Yasumoto et al., 2001)。在降低血中三 18.
(30) 酸甘油酯的部份，在 Sirato 等人的實驗中指出，在老鼠飲食中添加芝 麻，具有可降低血中三酸甘油酯的功效，此是經由增加肝臟中脂肪酸 氧化及減少肝臟中脂肪酸合成的作用所導致的結果(Sirato-Yasumoto et al., 2001)。 芝麻素也可顯著增加其肝臟中脂肪酸氧化酵素的活性，包括 acyl-CoA oxidase, carnitine palmitoyltransferase, 3-hydroxyacyl-CoA dehydrogenase 及 3-ketoacyl-CoA thiolase；且芝麻的給予，可減少脂 肪酸合成酵素的活性，包括 fatty acid synthase、glucose-6-phosphate dehydrogenase、ATP-citrate lyase 及 pyruvate kinase (Sirato-Yasumoto et al., 2001)。另外，給予老鼠 0.2%芝麻素 15 天後，也同樣可觀察到老 鼠肝臟中脂肪酸合成酵素活性顯著下降和脂肪酸分解酵素顯著增高 的情況(Kushiro et al., 2002)。 在先前的文獻也指出，芝麻素可以藉由對於 PPAR(peroxisome proliferators-activated receptor)機制的調控，而增加老鼠肝臟中脂肪酸 氧化作用的進行(Ashakumary et al., 1999)；並且芝麻素的給予，也可 藉由對於 SREBP-1 (sterol regulatory element binding protein-1) 蛋白表 現的向下調控，而減少了老鼠肝臟中脂肪酸的合成(Ide et al., 2001)。 另外，芝麻素的給予也可減少 HMG-CoA reductase 的活性，且 7-α-hydroxylase 的活性也有上升的趨勢。另外，在長鏈脂肪酸代謝過 19.
(31) 程中，芝麻素的給予可顯著抑制 n-6 脂肪酸代謝過程中△5 desaturase 酵素的活性，而此酵素是促使 dihomo-γ-linolenic acids 合成 arachidonic acid 的途徑(Shimizu et al., 1991; Chavali and Forse, 1999)。而在肝臟重 量方面，芝麻素的給予會使得老鼠的肝臟重量增加，但是測量老鼠的 GOT、GPT 指數，以及做老鼠肝臟的組織切片，芝麻素的給予對其 肝臟的生化指標以及老鼠肝臟的組織都沒有影響，因此推測芝麻素的 添加，對肝臟並不會造成傷害(Hirose et al., 1991)。. 20.
(32) 第四節、芝麻素與肥胖 在動物實驗中，高脂飲食會增加老鼠肝臟粒線體內與脂肪酸分解 相關酵素 carnitine acyltransferase 和 acyl-CoA dehydrogenase 的活性， 而在芝麻素的添加後，更可大幅度加強脂肪分解酵素的活性，而顯著 減少因餵食高脂飲食而增加的肝臟中 PUFA(polyunsaturated fatty acid) 的濃度；而無論飲食中脂肪含量的多寡，在飲食中添加芝麻素，動物 體內過氧化小體中 acyl-CoA oxidase 的酵素活性都會顯著增加，以利 脂肪進入粒線體及過氧化小體中行 β-oxidation，也因此促進 PUFA 的 代謝而減少其在肝臟中的濃度(Mizukuchi et al., 2003)。 另外，添加 0.5%芝麻素四週後，可顯著減少血液和肝臟中三酸 甘油酯的濃度(Hirose et al., 1991)，並給予雄性 SD 大鼠每公斤 200 克 的 芝 麻 粉 末 ， 相 當 於 給 予 1% 的 芝 麻 素 ， 可 顯 著 增 加 粒 線 體 中 β-oxidation 的進行，及減少脂肪酸合成酵素活性和增加脂肪酸分解酵 素的活性(Sirato-Yasumoto et al., 2001)，且芝麻素的添加具劑量上的效 應可顯著增加肝臟中脂肪酸氧化的速率，以及脂肪酸分解酵素的活 性，這都是藉由對 PPAR-α 的向上調控所達到的效果(Isseman and Green, 1990；Schoonjans et al., 1996；Aoyama et al., 1998)。 經由 Matsumura 等人在 1995 年，以 deoxycorticosterone acetate-salt 誘發形成高血壓的動物模式中，給予 1%的芝麻素四週後，發現可顯 21.
(33) 著減緩血壓增高的情況，並對血管肥大、心室肥大等有改善的功效 (Matsumura et al., 1995)，並以中風模式的自發性高血壓也得到同樣的 效果(Matsumura et al., 1998)。對於芝麻素降血壓的機制並不明確，推 測與對於 ACE(angiotensin converting enzyme)活性的抑制所造成的結 果。. 22.
(34) 第五節、研究動機 由於芝麻素有以上的生理功能，故推測芝麻素的給予，應可藉由 減少肝臟及血液中三酸甘油酯和脂肪酸合成酵素的活性，並促進脂肪 酸 β-oxidation 的進行，增加脂肪酸的分解，達到降低體脂肪囤積的目 的。 由於先前研究的實驗動物，都是給予大鼠正常飲食，在其飲食中 添加芝麻素，觀察對脂質代謝、脂肪合成和分解酵素活性的影響。而 在本實驗中，藉由先前研究中在飲食中芝麻素的添加具有調節血脂代 謝方面的功效，因而推測在飲食中芝麻素的添加對體脂蓄積應有正面 的效果。又對於給予高脂飲食誘發成的肥胖大鼠，在其飲食中添加芝 麻素觀察脂質代謝、脂肪酸合成和分解酵素活性、及脂肪囤積的情況 則沒有相關文獻。因此在本實驗中，同時給予正常體重和肥胖大鼠， 以正常體重大鼠當作預防的模式，以肥胖大鼠當作治療的模式，觀察 同劑量芝麻素的給予，對於脂質代謝、脂肪合成和分解酵素活性、及 脂肪囤積、方面的影響，進而探究芝麻素的添加對體重調控上的機制。. 23.
(35) 第三章、實驗設計與方法. 第一節、實驗流程 實驗動物購入後，給予一週的適應期，紀錄初始體重當做第 0 週，並隨機分為正常體重與肥胖組，使兩組間體重沒有統計差異，一 組給予正常飲食，另一組給予高脂飲食，在 4 週誘發飲食後，確定正 常體重組與肥胖組體重具有統計上差異，且肥胖組的平均體重超過為 正常飲食組的 120%後，依體重各分為三組並使三組間體重沒有差 異，將正常體重組分為 N0、N1、N5 來表示在飲食中添加 0、0.1%及 0.5%的芝麻素，肥胖組也分為 F0、F1 及 F5 來表示在飲食中添加 0、 0.1%及 0.5%的芝麻素，其中 N0、N1、N5 組間體重沒有統計上的差 異，在 F0、F1、F5 組間體重也無統計上差異。在整個實驗期每週測 量體重以及攝食量，並在芝麻素介入前予以尾靜脈採血測量其空腹血 糖、血中三酸甘油酯(TG)、血中總膽固醇(TC)、LDL-C、NEFA 及 HDL-C 濃度。經過 4 週添加芝麻素的飲食後用乙醚予以犧牲，取其 腹腔動脈血測量血糖、TG、TC、LDL-C、HDL-C、NEFA、胰島素、 leptin 濃度，並取其肝臟、腎臟、副睪白色脂肪、附腎白色脂肪予以 秤重，並測量肝臟中 TC、TG、NEFA 含量，以及肝臟中與脂肪酸代 謝 相 關 的 酵 素 FAS(fatty acid synthase) 、 ACC(acetyl CoA 24.
(36) carboxylase) 、 CPT(carnitine palmitoyltransferase) 、 ACO(acyl CoA oxidase)的活性。並利用 H&E 染色觀察副睪白色脂肪的細胞大小。. 25.
(37) 圖 3- 1、實驗流程圖 60 隻 SD 鼠. 1 wk chow diwt. 正常體重組. 肥胖組. 4 wk. 0.1%. 0.5%. 芝麻素. 芝麻素. (N1). (N5). 無添加 芝麻素 (N0). 4 wk. 實驗分析： (1) 生長情況、臟器重量 (2) 禁食血糖、血脂質、胰島素、瘦體素 (3) 肝臟脂肪酸合成、分解酵素活性 (4) 脂肪細胞大小. 26. 無添加 芝麻素 (F0). 0.1%. 0.5%. 芝麻素. 芝麻素. (F1). (F5).
(38) 第二節、實驗材料與分組 一、實驗動物和飼養方法 自樂斯科(Lasco)公司購得 60 隻雄性 Sprague-Dawley 大白鼠，重 量介於 105-125g，飼養於透明盒籠中，每籠一隻，室溫維持在 24±2℃ 的環境中，12 小時的光暗循環。 芝麻素是由喬治亞生技股份有限公司所提供，利用台灣的芝麻， 將芝麻種子先粉碎，利用超臨界 CO2 萃取技術得到含高濃度芝麻素的 芝麻油，再以二氧化碳抗溶結晶及分餾純化技術，進而獲得純度約 91.2%的芝麻素。並經由臺北醫學大學藥學系生藥學研究所的李慶國 教授以 HPLC(High pressure liquid chromatography)來檢驗，再次確定 其純度達到 91.2%以上。 經過一個星期自由攝食 chow diet 和飲水的適應期後，隨機分為 六組，每組 10 隻。其中三組給予正常飲食，另外三組給予高脂飲食。 一個月後將高脂飲食組與正常飲食組體重相較，確定高脂飲食組體重 顯著比正常飲食組高並具有統計上的差異，且肥胖組體重高於正常體 重組的 120%以上，即定義為肥胖組，之後開始於給予芝麻素的介入。 正常體重組分為三組，分別在其飲食中添加 0%芝麻素、0.1% 芝麻 素、0.5%芝麻素，肥胖組同樣分為三組，各別給予 0%芝麻素、0.1%. 27.
(39) 芝麻素、0.5%芝麻素，芝麻素的介入為期一個月。飼料於每次餵食前 新鮮準備，每兩天測量其攝食量及飲食狀況，並每週紀錄體重變化情 形。芝麻素介入後每兩週以尾靜脈採血的方式取得血液樣本，用以分 析血脂濃度。於芝麻素介入後四週予以犧牲，並取出肝臟、腎臟、副 睪白色脂肪及副腎白色脂肪予以秤重並待日後分析之用。. 二、飼料配方： 依據 2002 年 Ghibaudi 等人的研究指出，以 AIN-93(Reeves et al., 1993)飲食為基礎來調整其熱量百分比，將油脂所提供佔總熱量中的 比例自 15.96%提高為 45%，並以減少玉米澱粉來調整總熱量的相等 (Ghibaudi et al., 2002)。在芝麻素部分，在飼料中以重量百分比的比例 添加芝麻素。內容如表一所示。. 28.
(40) 表 3- 1：AIN-93G 實驗飲食組成 Table 3-1. Composition of experimental diet 成份. 正常飲食組. 高脂飲食組. Corn starch(g/kg). 529.49. 289.23. Casein(g/kg). 200. 238.12. Sucrose(g/kg). 100. 119.08. Cellulose(g/kg). 50. 59.54. Soybean oil(g/kg). 70. 235.07. Mineral mix(g/kg) 1. 35. 41.68. Vitamin mix(g/kg)1. 10. 11.91. L-cystine(g/kg). 3. 2.38. 2.5. 2.98. 0.014. 0.017. 4147.94. 4701.31. Choline bitartrate Tertbutylhydroquinone Calories(kcal/kg) 1. The composition of AIN-93 Vitamin Mixture and AIN-93 Mineral. Mixture is as described in AIN (1993). 29.
(41) 三、犧牲及樣本收集 將老鼠以乙醚予以犧牲，犧牲後取其肝臟組織秤重，並剪下 1.5g 肝臟放入封口袋中，置於-30℃下，以供日後肝臟脂肪分析之用，其 餘肝臟保存於-70℃環境中，以做為測定肝臟中脂肪代謝相關酵素或 性。另外取出脂肪組織(副睪脂肪組織)、肌肉組織(腓腸肌)保存於 -70℃環境中，亦作為測量血糖及脂肪代謝相關酵素蛋白質表現量之 用。並取禁食六小時的腹腔動脈血，裝入含有肝素的(heparin)的 10c.c. 綠頭採血管，避免凝血。之後進行離心，3500×g，4℃，10 分鐘。離 心完畢取出上清液(血漿)用作分析血漿中葡萄糖、胰島素、游離脂肪 酸 、 三 酸 甘 油 酯 、 總 膽 固 醇 、 低 密 度 脂 蛋 白 膽 固 醇 (low density lipoprotein-cholesterol, LDL-C)、高密度脂蛋白膽固醇(high density lipoprotein-cholesterol, HDL-C)用。. 30.
(42) 第三節、分析方法 一、芝麻素成份分析 利用 HPLC(High Performance Liquid Chromatography)，分析芝麻 素中的組成。. 二、血液分析 A. 分析血漿中葡萄糖濃度： 在芝麻素介入後每週採集尾靜脈血液，測量實驗動物空腹血糖 值。採用商業試劑組，取 10µL 的血清加入 1000µL 試劑(其中含有 phosphate buffer、MOPS buffer、phenol、4-aminophenazone、glucose oxidase 及 peroxidase)混合均勻後於 37℃下作用 10 分鐘，測量 500nm(UNICAM UV-Visible spectrometers,Tokayo,Japan)下吸光值的 變化。. B. 分析血漿中胰島素濃度： 利用 Mercodia Rat Insulin ELISA kid 進行胰島素分析。首先將商 業試劑所賦予的胰島素進行標準曲線的製作(包含的濃度有 0、 0.15µg/L、0.4µg/L、1.0µg/L、3.0µg/L 及 5.5µg/L)。之後取的標準試 31.
(43) 劑及血清樣本各 25µg 放置於 96well ELISA microplate 中，接著各加 入 50µ 的 conjugate enzyme 在室溫下 incubath 兩個小時，以 automatic washer 清洗 6 次後輕拍乾後加入 200µL 的 TMB 作為受質，15 分鐘後， 加入 stop solution 終止反應，利用 ELISA reader 在 450nm 下進行分 析。血清樣本分析出來數據代入標準曲線中與標準值進行比較，求出 實驗老鼠體內胰島素濃度(mg/dL)。 並將空腹血糖及胰島素數據代入 HOMA-IR (Homeostasis Model Assessment)=fasting insulin (mU/mL) × fasting glucose (mmol/l)/22.5 後，計算體內胰島素抗性情形。當數值越低，表胰島素敏感性越高， 胰島素阻抗性越低。. C. 測量血漿中三酸甘油酯濃度： 以 fully-enzymatic GPO-PAO 法來測定。原理是利用四種酵素： lipase、glycerol kinase (GK) 、glycerol-3-phosohate oxidase (GPO)、 peroxidase 依序與樣品中的三酸甘油酯作用，造成 3,5-dichloro-2hydroxyl benzene-sulfonic acid (DHBS)與 4-aminoantipyrine(4-AAP)氧 化結合形一紅色物質(quinoneimine)。利用分光光度計在 500 nm 波長 下測其吸光值，再與標準溶液之吸光值對照比色而得樣品中三酸甘油 酯濃度。分析步驟如下：取血漿與標準液 5µL 與反應劑 500 µL 混合 32.
(44) 均勻，在 20 ~ 25℃下水浴 10 分鐘，以分光光度計在 500 nm 波長下 測其吸光值，與標準溶液之吸光值對照比色而求得樣品中三酸甘油酯 濃度。. D.血漿中游離脂肪酸(non-esterified fatty acids, NEFA)： 採用 RANDOX NEFA Kit 來測定，原理是利用三種酵素：acyl CoA synthetase、acyl CoA oxidase、peroxidase 依序與樣品中的游離脂肪酸 作用，生成紫色產物，利用分光光度計在波長 550 nm 下，與標準溶 液之吸光值對照比色而得樣品中游離脂肪酸濃度。分析步驟如下：取 血漿與標準液 10µL 與 250 µL 的反應劑 A 混合均勻，在 37℃下水浴 10 分鐘，之後再加入反應劑 B，在 37℃下水浴 10 分鐘，以分光光度 計在波長 550 nm 波長下測其吸光值，與標準溶液之吸光值對照比色 而得樣品中游離脂肪酸濃度。. E.血漿中總膽固醇 (Total cholesterol)： 採用 enzymatic CHOP-PAP method (Richmond., 1973)，測定原理 為利用三種酵素：cholesterol esterase、cholesterol oxidase、peroxidase 與樣品中的 cholesterol 及 cholesteryl ester 作用，生成淡紅色的. 33.
(45) quinonoimine，利用分光光度計在 500 nm 波長下測其吸光值，再與標 準溶液之吸光值對照比色而得樣品中總膽固醇濃度。分析步驟如下： 取血漿與標準液 5µL 與反應劑 500 µL 混合均勻，在 20~25℃下水浴 10 分鐘，以分光光度計在波長 500 nm 波長下測其吸光值，與標準溶 液之吸光值對照比色而求得樣品中總膽固醇濃度。. F.高密度脂蛋白膽固醇(high density lipoprotein cholesterol, HDL-C)： 取大白鼠血漿 200µL 置於超高速離心管中，以密度 1.006 g/mL 之 sodium bromide (NaBr) 溶液 300µL 來調整溶液密度，混合後以超 高速離心機 80000 rpm，4℃，離心 4 小時，可得密度小於 1.006 g/mL 浮於上層部分 200µL，即為極低密度脂蛋白 (VLDL)。再以密度 1.1485 g/mL 之 NaBr 溶液 200µL 來調整溶液密度，混合後以超高速離心機 80000 rpm，4℃，離心 4 小時，可得密度介於 1.006-1.063 g/mL 浮於 上層部分 200µL，即為低密度脂蛋白 (LDL)。最後以密度 1.4305 g/mL 之 NaBr 溶液 200µL 來調整溶液密度，混合後以超高速離心機 80000 rpm，4℃，離心 4 小時，可得密度介於 1.063-1.21 g/mL 浮於上層部 分 200µL，即為高密度脂蛋白 (HDL)。分別利用 Enzymatic CHOP-PAP 法分析低、高密度脂蛋白膽固醇濃度。. 34.
(46) G.血漿中瘦體素(Leptin) 利用 TiterZyme EIA rat leptin kit 進行血漿中 Leptin 濃度分 析。首先將商業試劑所賦予的瘦體素進行標準曲線的製作(包含的濃 度有 0、56 pg/mL、113 pg/mL、225 pg/mL、450 pg/mL、900 pg/mL、 1800 pg/mL 及 3600 pg/mL)。之後取的標準試劑及血漿樣本各 100µg 放置於 96well ELISA microplate 中，輕拍 plate 使其混合後，將 plate 密封置於 37℃下一小時，之後在每個 well 中加入 400µg 的 Wash beffer 反覆沖洗 7 次，且最後一次要確定 well 中 Wash buffer 的清除後，除 了 Blank 外在每個 well 中加入 100µg Labled antibody solution，再將 plate 密封置於 37℃下 30 分鐘，之後同樣在每個 well 中加入 400µg Wash beffer 進行 9 次反覆沖洗，之後加入 100µg TMB substrate，置於 黑暗室溫中 30 分鐘，加入 100µg Stop solution 後，利用 ELISA reader 進行 450nm 的測量，並同時利用 570nm 測量以進行校正。血漿樣本 分析出來數據代入標準曲線中與標準值進行比較，求出實驗老鼠體內 瘦體素濃度(pg/mL)。. 35.
(47) 三、肝臟脂質分析 A.肝臟脂質萃取： 將冷凍的肝臟取出解凍，依 Folch 氏法(1957)，取 0.5 克的肝臟， 加入 6 mL 萃取液[chloroform/methanol = 2/1 (v/v)]，使用組織均質機 (polytron)將肝臟均質化，使用濾紙過濾肝臟均質液到 15 mL 塑膠離 心管中；將萃取液定量至 10 mL，加入 2 mL 0.05% CaCl2 並震盪均勻， 於 4℃、3500 rpm 條件下離心 3 分鐘。離心後，去除上層液，再以萃 取液[chloroform- /methanol/water = 3/48/47 (v/v/v)]定量至 12 mL 並震 盪均勻，同樣於 4℃、3500 rpm 條件下離心 3 分鐘。離心後，去除上 層液，並先以 methanol 定量至 9 mL，最後再以萃取液[chloroform/methanol = 2/1 (v/v)]定量至 10 mL，並儲存於-20℃下保存。. B. 肝臟三酸甘油酯 (Liver triglycerides)： 測量肝臟三酸甘油酯之前處理及萃取方法如上肝臟脂質萃取所 述。 分析步驟如下：分析當日，取肝臟萃取液 200µL 至玻璃試管中， 並至於真空乾燥箱中抽乾去除有機溶劑。加入反應劑 500 µL 混合均 勻，在 20 ~ 25℃下水浴 10 分鐘，以分光光度計在 500 nm 波長下測. 36.
(48) 其吸光值，與標準溶液之吸光值對照比色而求得樣品中三酸甘油酯濃 度。. C. 肝臟膽固醇濃度 (Liver cholesterol)： 肝臟膽固醇之前處理及萃取方法如肝臟脂質萃取所述。 分析步驟如下：分析當日，取肝臟萃取液 200µL 至玻璃試管中， 並至於真空乾燥箱中抽乾去除有機溶劑。加入反應劑 500µL 混合均 勻，在 20 ~ 25℃下水浴 10 分鐘，以分光光度計在波長 500 nm 波長 下測其吸光值，與標準溶液之吸光值對照比色而求得樣品中總膽固醇 濃度。. D. 肝臟中游離脂肪酸濃度： 將肝臟脂質萃取液稀釋五倍，取 20µL 稀釋後的肝臟脂質萃取液 置於通風廚中使溶劑揮發，之後分析方法同血漿游離脂肪酸。. 37.
(49) 四、肝臟細胞質中脂質代謝相關酵素活性 A.肝臟細胞質液製備 依 Erickson 等人的方法製備細胞質液(Erickson et al., 1978)。將肝 臟加入 5 倍體積且冰冷之 0.1M potassium phosphate(PH=7.4)緩衝液中 (緩衝液中含有 1mM dithio-threitol 以及 10mM nicotinamide)，並在水 浴中以均質機(CAT. No. 099C K64)進行磨碎，於 4℃，12000×g 下離 心 15 分鐘，取上清液，在於 4℃，105000×g 下離心 60 分鐘之後，取 得之上清液即為細胞質液，儲存於-80℃待日後分析。. B.肝臟細胞質液蛋白質測定 將細胞質液取出解凍後，以去離子水分別稀釋 6、8、10 倍後將 BSA 標準容易(Prod#23209)依序稀釋濃度成 2、1.5、1、0.75、0.5、 0.25、0.125、0.025 與 0mg/mL，取稀釋樣品及序列稀釋 BSA 標準溶 液 25µL 分別注入 96 well ELISA microplate 中，再加入 200µL Working reagent【BSA Protein Assay Reagent A(Prod# 23228)：BSA Protein Assay Reagent B(Prod# 23224)=50：1】 ，於 37℃下反應 30 分鐘後再於室溫 下冷卻 15 分鐘。以 ELISA reader 讀取 562nm 之吸光值。再根據標準 取線來計算肝臟細胞質液樣品的蛋白質濃度。. 38.
(50) C.肝臟 Fatty acid synthase(FAS)活性測定 1. 原理 採用 Nepokroeff 等學者之方法(Nepokroeff et al., 1975)，在 37℃ 環 境 下 ， 提 供 脂 肪 酸 合 成 酶 作 用 時 所 需 之 基 質 malonyl-CoA 、 acetyl-CoA 及 NADPH 等。利用脂肪酸合成酶反應時需消耗 NADPH 而造成 340nm 吸光值的變化差異，即可求得肝臟細胞質液中脂肪酸 合成酶的酵素活性。 2. 藥品配製 (1)0.2M potassium phosphate buffer(pH=7.1) 取 2.7218g 的 KH2PO4(Sigma-JT-3256)，溶於 100mL 的二次水中， 儲存於 4℃備用。 (2)20mM Dithiothreitol 取 0.03085g 的 DTT(Sigma-D5545)，溶於 10mL 的二次水忠，儲 存於 4℃備用。 (3)0.25mM acetcyl CoA 取 3.036mg 的 acetyl CoA(Sigma A-2056)，溶於 15mL 的二次水 中，儲存於-20℃備用。 (4)60 mM EDTA-2Na 取 0.2233g EDTA-2Na(Sigma JT-8993-01)，溶於 10Ml 二次水忠，. 39.
(51) 儲存於 4℃備用。 (5)6mM NADPH 取 68.8mg 的 NADPH(Sigma N-7505)，溶於 15Ml 二次水中，儲 存於 4℃備用。 (6)0.39 mM Malonyl-CoA 0.0067g 的 Malonyl-CoA(Sigma-M4263)，溶於 20Ml 二次水中， 儲存於-20℃。. 3.活性分析 sample(µL). 藥品 0.2M potassium phosphate buffer(pH=7.1). 163.3. 20 mM dithiothreitol. 16.7. 0.25 mM acetyl-CoA. 20. 60 mM EDTA-2Na. 16.7. 0.39 mM malonyl-CoA. 33.3. Cytosol. 33.3. Total. 300. 根據上表依序加入酵素反應物質於 96well ELISA microplate 中混合均 勻後再加入 16.7µL 6 mM NADPH，震盪混合均勻後，反應溫度為 40.
(52) 37℃。掃描 340mm 時的吸光值，每 30 秒讀取一次吸光值，共歷時 5 分鐘。 4.酵素比活性計算 酵素比活性(n mole.min mg protein) =【V/(E×d×p×v】×△A340nm/△t V=酵素反應液總容積(mL) v=肝臟酵素測定液容積(mL) p=肝臟酵素測定液蛋白質濃度(mg protein/mL) d=光路徑(光路徑=1cm) E=光子吸光係數(E=6.2mL/µ mole.cm) △A340nm/△t=單位時間內，酵素反應液於 340nm 時的吸光值變化. D.肝臟過氧化體 ACC(acetyl-CoA carboxylase)活性測定 1.原理 依 據 Numa 之 方 法 (Numa et al., 1965) ， 提 供 acetyl-CoA carboxylase 反應所需物質，包括 Acetyl-CoA、NADPH、ATP 及 KHCO3 等 ， 肝 臟 細 胞 質 液 中 acetyl-CoA carboxylase 活 性 以 每 分 鐘 消 耗 NADPH 量表示。. 41.
(53) 3. 藥品配製 (1)50 mM Tris-HCl Buffer (pH=7.4) 取 0.788g Tris-HCl(Sigma-4103)，溶於 100mL 二次水中，以 NaOH 調整 pH 值為 7.4，定容到 50mL 於 4℃冰箱中保存。 (2)10 mM MgCl2 取 0.0305g MgCl2(Sigma JT-2444)，溶於 15Ml 二次水中，於 4℃ 冰箱中保存。 (3)10 mM potassium citrate 取 0.0324g potassium citrate(Sigma JT-3066)，溶於 10mL 二次水 中，於 4℃冰箱中保存。 (4)3.75 mM Glutathione 取 0.0058g Glutathione(Sigma G-4251)，溶於 5Ml 二次水中，於 4℃ 冰箱中保存。 (5)12.5 mM KHCO3 取 0.0188g KHCO3，溶於 15mL 二次水中，於 4℃冰箱中保存。 (6)0.675 mM bovine serum albumin(BSA) 取 0.22mL BSA(Sigma F-6178)，溶入 5mL 二次水中，於 4℃冰箱. 42.
(54) 中保存。 (7)0.125 mM acetyl CoA 取 1.1mg acetyl CoA(Sigma A-2056)，加入 10mL 二次水中，於 4℃ 冰箱中保存。 (8)10 mM NADPH 0.1115g NADPH(Sigma N-7505)，溶於 15mL 二次水中，於 4℃冰 箱中保存。 (9)3.75 mM ATP 取 0.0517g adenosine 5’-triphosphate(Sigma a-3377)，溶於 25mL 的二次水中，於 4℃冰箱中保存。 3.活性分析 sample(µL). 藥品 20mM tris-HCl buffer(pH=7.4). 156.4. 10 mM MgCl2. 25.1. 10 mM potassium citrate. 12.4. 3.75 mM glutathione. 6.3. 12.5 mM KHCO3. 18.8. 0.675mM bovine-serum albumin. 6.3 43.
(55) 0.125mM acetyl-CoA. 12.4. 3.75mM ATP. 37.5. Cytosol. 37.5. Total. 331.3. 根據上表依序加入酵素反應物質於 96well ELISA microplate 中混合均 勻後再加入 18.75µL 10mM NADPH，震盪混合均勻後，反應溫度為 37℃。掃描 340nm 時的吸光值，每 30 秒讀取一次吸光值，共歷時 5 分鐘。 4. 酵素比活性計算 酵素比活性(n mole/min/mg protein) =【V/(E×d×p×v】×△A340nm/△t V=酵素反應液總容積(mL) v=肝臟酵素測定液容積(mL) p=肝臟酵素測定液蛋白質濃度(mg protein/mL) d=光路徑(光路徑=1cm) E=光子吸光係數(E=6.2mL/µ mole.cm) △A340nm/△t=單位時間內，酵素反應液於 340nm 時的吸光值變化. 44.
(56) 五、肝臟粒線體中脂質代謝相關酵素活性 A.肝臟粒線體萃取液製備 依據 Bieber 等學者的方法(Bremer et al., 1972)，將肝臟加入 10 倍體積 且冰冷之 buffer 1(pH=7.5)中(buffer 1 中含有 0.25M sucrose 以及 0.2mM EDTA)，並在冰浴中以均質機(CAT. No. 099C K64)磨碎，於 4℃，750×g 下離心 12 分鐘，上述動作重複兩次後去除上清液，並將 沉澱物溶於 5-10 倍體積且冰冷的 buffer2(buffer2 中含有 70mM sucrose、220mM mannitol、2mM HEPES，pH 以及 1mM EDTA)中即 為肝臟粒線體萃取液。. B.肝臟粒線體萃取液蛋白質測定 細胞質液取出解凍後，以去離子水分別稀釋 6、8、10 倍後將 BSA 標準容易(Prod#23209)依序稀釋濃度成 2、1.5、1、0.75、0.5、0.25、 0.125、0.025 與 0mg/mL，取稀釋樣品及序列稀釋 BSA 標準溶液 25µL 分別注入 96 well ELISA microplate 中，再加入 200µL Working reagent 【BSA Protein Assay Reagent A(Prod# 23228)：BSA Protein Assay Reagent B(Prod# 23224)=50：1】 ，於 37℃下反應 30 分鐘後再於室溫. 45.
(57) 下冷卻 15 分鐘。以 ELISA reader 讀取 562nm 之吸光值。再根據標準 取線來計算肝臟細胞質液樣品的蛋白質濃度，儲存於-80℃待日後分 析。. C.肝臟過氧化體 Acyl-CoA Oxidase(ACO)活性測定 1. 原理 採用 Small 等學者(1985)方法，提供脂肪酸 β-oxidation 所需要之 基質 palmitoyl-CoA，使肝細胞過氧化體進行 β-oxidation 反應時，利 用 acyl-CoA oxidase 產生之 H2O2，(反應中添加 aminotriazole，以抑制 內生性 catalase 產生 H2O2)，並在 horseradish peroxidase(HRP)催化下， 將 受 質. 2’,7’-dichlorofluorescin. diacetate(DCFH-DA) 氧 化 為. 2’,7’-Dichlorofluorescin 時，造成 502nm 的吸光值變化差異，即可求 得肝臟粒線體中 ACO 的活性。 2. 藥品配製 (1)11mM potassium phosphate buffer(pH=7.4) 取 0.2994g KH2PO4(Sigma-JT-3256)，溶於 200mL 二次水中，再 以 KOH 調 pH 值至 7.4 後，定容至 500mL，儲存於 4℃冰箱中備用。 (2)4µg/µL HRP. 46.
(58) 取 0.04g Horseradish peroxidase type Ⅱ(Sigma P-8250)，溶於 10mL PBS 中，儲存於 4℃備用。 (3)2.5 mM DCFH-DA 取 0.0122g 2’,7’-dichlorogluorescin diacetate(Sigma D-6883)，溶入 10mL 的 N,N-dimethylformamide/0.01M Naoh=1/9(v/v)溶液中，需當日 配製並於氮氣下避光保存。 (4)4M Aminotriazole 取 3.3632g 3-Amino-1.2.4-trazole，溶於 10mL potassium phosphate buffer(11mM, pH=7.4)中，儲存於 4℃備用。 (5)2g/100mL Triton X-100 取 Triton X-100 (Sigma X-100) 0.2mL，溶於 10mL 去離子水，儲 存於 4℃備用。 (6)0.75 mM Palmitoyl Coenzyme A 取 0.0075g Palmitoyl Coenzyme A(Sigma P9716) 溶 於 10Ml potassium phosphate buffer(11mM,pH=7.4)中，儲存於 4℃備用。. 47.
(59) (7)LAT Mixture 藥品. 需要量(µL). 2.5 mM DCFH-DA. 5. 4M aminitriazole. 5. Triton X-100. 2.5. 分析酵素活性前，依據樣本數量，將上表物質依序混合，置於冰浴備 用。. (8)酵素反應混合試劑 sample(µL). 藥品 11mM potassium phosphate buffer(pH=7.4) 4µg/µL HRP. 2.5. LAT Mixture. 12.5. Mitochondrion. 2.5. Total. 250. 48.
(60) 3. 活性分析 根據上表依序加入酵素反應物質於 96well ELISA microplate 中混 合 均 勻 後 於 30℃ 下 反 應 6 分 鐘 ， 再 加 入 10µL 0.75 mM Palmitoyl-CoA，震盪混合均勻後，測定 502nm 的吸光值變化，每分 鐘讀取一次吸光值，共歷時 10 分鐘，得△A520nm/min。 4. 酵素比活性計算 △L-DCF nmole/min/mg protein =△A520nm/min÷1.42×2.5µL 肝臟粒線體萃取液中蛋白質含量(µg)÷1000 △H2O2 nmole/min/g liver =[△L-DCF nmole/min/mg protein÷3.2×肝臟粒線體萃取液中蛋白質濃 度(mg/mL)×0.25mL]÷0.1g liver sample △H2O2 nmole/min/liver =△H2O2 nmole/min/g liver × total liver weight(g). D.肝臟粒線體 Carnitine palmitoyltransferase(CPT)活性測定 1. 原理 採用 Bieber 等學者之方法(Bieber et al., 1972)，提供 Carnitine. 49.
(61) palmitoyltransferase 作用時所需要的基質 Palmitoyl-CoA、DTNB 及 (-)Carnitine 等 。 利 用 Carnitine palmitoyltransferase 反 應 時 將 Palmitoyl-CoA 上的 CoA 釋出所造成 412nm 吸光值的變化差異，即可 求得肝臟粒線體中 CPT 的活性。 2. 藥品配製 (1)116mM Tris-HCl Buffer(pH=7.4) 取 1.8282g Tris-HCl(Sigma-4103)，溶入 100mL 二次水中，以 NaOH 調整為 pH 值為 8.0 後，定量到 20mL 於 4℃冰箱中保存。 (2)0.09% Triton X-100 取 0.018 mL Triton X-100(Sigma X-100)，溶入二次水中使總體積 為 20mL，於 4℃冰箱中保存。 (3)1.1mM EDTA-2Na 取 0.0082g EDTA-2Na(Sigma JT-8993-01)溶入 20mL 二次水中， 儲存於 4℃備用。 (4)0.035mM Palmitoyl-CoA 取 0.71mg Palmitoyl-CoA(Sigma P9716)溶入 20mL 二次水中，儲 存於-20℃備用。. 50.
(62) (5)0.12mM 5.5’-Dithiobis(2-nitrobenzoic acid)(DTNB) 取 0.95mg DNTB((Sigma D8130)，溶入 20mL 二次水中，儲存於 4℃備用。 (6)1.1mM L(-)Carnitine 取 0.0022g L(-)Carnitine(Sigma C0283)，溶入 10mL 二次水中，儲 存於 4℃備用。. 3.活性分析 Sample(µL). 藥品 116mM Tris-HCl Buffer(pH=7.4). 100. 0.09% Triton X-100. 20. 1.1mM EDTA-2Na. 20. 0.12mM DTNB. 20. 1.1mM L(-)Carnitine. 10. Mitochondria. 10. Total. 200 51.
(63) 4.活性分析 依據上表依序加入酵素反應物質於 96well ELISA microplate 中混 合均勻後再加入 20µL 0.035mM Palmitoyl-CoA，震盪混合均勻後，掃 描 412nm 時的吸光值，每 30 讀取一次吸光值，共歷時 5 分鐘。 5.酵素比活性計算 酵素比活性(n mole/min/mg protein) =【V/(E×d×p×v】×△A412nm/△t V=酵素反應液總容積(mL) v=肝臟酵素測定液容積(mL) p=肝臟酵素測定液蛋白質濃度(mg protein/mL) d=光路徑(光路徑=1cm) E=光子吸光係數(E=6.2mL/µ mole.cm) △A412nm/△t=單位時間內，酵素反應液於 412nm 時的吸光值變化. 52.
(64) 六、組織學分析 將肝臟及脂肪組織以 10%福馬林固定後加以脫水，並以石蠟包埋 的方式固定後，切片。最後以 Oil red O 和 Fat stain 染色觀察肝臟中 脂肪堆積情況及脂肪細胞大小。. 53.
(65) 第四節、統計分析 所有數據以 mean±SEM 表示，以 Statistic Analysis System 9.0 統 計軟體(version 8.2, SAS Institute Inc, Cary, NC, USA)進行 Two-way ANOVA 分析，並以 Fisher’s least significant difference test 比較組間差 異，當 p＜0.05 表示有統計上之差異。. 54.
(66) 第四章、結果. 第一節、芝麻素成分組成分析 經由 HPLC(High pressure liquid chromatography)來測定本實驗材 料芝麻素的組成分。此結果是經由臺北醫學大學藥學系生藥學研究所 的李慶國教授以 HPLC 來檢驗，其結果如圖 4-1。此圖只有一個明顯 的波峰，指出此樣品是純度相當高的物質。也更再次確認此芝麻素的 純度達到廠商所給予的數值 91.2%以上。. 55.
(67) 圖 4- 1、本次實驗所用芝麻素的 HPLC 分析圖 Figure 4-1 Contents of the additive sesamin of the experiment by HPLC.. 56.
(68) 第二節、動物體重、飲食和臟器重量分析 48 隻 SD 鼠經一週適應期後，於鼠齡六週大時將其隨機分為正常 體重組與肥胖組各 24 隻後給予誘發飲食，正常體重組給予標準 AIN93G 飲食，肥胖組給予以 AIN93G 為基礎調整為 45%熱量來自於 黃豆油的高脂飲食，其飲食成分如表 4-1 所示，給予四週後經統計分 析顯示肥胖組體重顯著高於正常飲食組後，給予四週的實驗飲食。在 鼠齡為十週大時，各別將正常體重組與肥胖組依體重分為三組並使各 組間沒有統計差異，正常飲食組繼續給予正常飲食，肥胖組繼續給予 高脂飲食，並在飲食中分別添加不同劑量的芝麻素，正常體重組不添 加芝麻素為 N0，正常體重組添加 0.1%芝麻素為 N1，正常體重添加 0.5%芝麻素為 N5；肥胖組不添加芝麻素為 F0，肥胖組添加 0.1%芝 麻素為 F1，肥胖組添加 0.5%芝麻素為 F5，其飲食成分如表 4-1 所示。. 一、體重和攝食量 體重方面如圖 4-2 所示。在攝食量方面，誘發期的攝食量各組間 沒有差異(N0：24.4±3.3 g，N1：24.5±1.2 g；24.5±1.1 g，F0：23.1±3.4g， F1：23.8±1.2 g，F5：23.9±4.8 g)，經過四週成功誘發後，給予五週的 實驗飲食，在期間攝食量各組間也都沒有差異(N0：23.9±2.8 g，N1： 24±1.5 g，N5：24±7.1 g；F0：23.5±0.5 g，F1：23.8±2.3 g，F5：23.9±5.5. 57.
(69) g)，可發現在誘發期與實驗期，正常體重及肥胖組各組間攝食量都沒 有差異。在體重方面，在第 0 週時隨機分為正常體重與肥胖組，使兩 組間體重沒有統計差異；在第 4 週，確定正常體重組與肥胖組體重具 有統計上差異，且 F 組的平均體重為 N 組的 127%，再依體重隨機各 分為三組，將正常體重組分為 N0、N1、N 來表示在飲食中添加 0、 0.1%及 0.5%的芝麻素，肥胖組也分為 F0、F1 及 F5 來表示在飲食中 添加 0、0.1%及 0.5%的芝麻素，N 組和 F 組中各組間體重無統計上 差異。 在第 8 週予以犧牲，正常體重組間 N0、N1 及 N5 間體重沒有統 計上的差異；肥胖組中 F5 顯著高於 F0 組(p=0.01)，但 F0 和 F1 之體 重沒有差異(p=0.06)，F1 和 F5 之體重沒有差異(p=0.5)。顯示在正常 體重組，給予芝麻素對其體重控制並沒有明顯的成效；肥胖組中，添 加高劑量芝麻素可顯著減少老鼠的體重，但添加 0.1%的芝麻素，則 對體重無影響。. 58.
(70) 二、臟器重量 犧牲時臟器重量部份，如表 4-2 所示。正常體重組間，肝臟重量 以及每 100 克體重的肝臟重量在 N0、N1、N5 三組間都沒有顯著差 異；肥胖組中，肝臟重量在三組間沒有差異，而在每 100 克體重的肝 臟重量部分，F1、F5 組都顯著高於 F0 組。顯示在正常體重組，芝麻 素對肝臟重量並沒有顯著影響；肥胖組中，添加高、低劑量芝麻素都 可顯著增加其每 100 克體重相對肝臟重量。 在腎臟重量部分，結果顯示肥胖組三組間腎臟重量都顯著高於正 常體重組中的三組，表示高脂飲食會引起腎臟重量的增加。而在每 100 克體重的腎臟重量部份，發現無論正常體重組或肥胖組，腎臟重 量都沒有顯著差異。. 59.
(71) 表 4- 1 正常體重組中 N0、N1、N5 組以及肥胖組中 F0、F1、F5 組 其實驗飲食所提供每日蛋白質、脂質、醣類、熱量及芝麻素含量 Table 4-1 Protein, Fat, Carbohydrate, Energy and Sesamin of normal and obesity rat fed six different diets Diet. N0. N1. N5. F0. F1. F5. 5. 5. 5. 7.23. 7.23. 7.23. Fat(g/day/rat). 1.75. 1.75. 1.75. 5.88. 5.88. 5.88. Carboxyhadrate. 15.74 15.74. 15.74. 10.21 10.21 10.21. Protein(g/day/rat). (g/day/rat) Calories. 98.7. 98.7. 0. 0.025. 98.7 122.6 122.6. 122.6. (kcal/day/rat) Experiment diet additive Sesamin(g/day/rat) 1. 0.125. 0. 0.025. 0.125. Normal rats were fed about 25g diet per day；obesity rats were fed about 25g per day. 60.
(72) Growth curve 570 520 Weight(g). a ab b. a ab. a a. 470. a. 420. a. a. ab b. a a. c c c. 370 320. b. b. b. b. b b. c. c. c c. c. c. b. 270 0. 1. 2. 3. 4. 5. weeks. 圖 4- 2 各組老鼠體重生長曲線Growth Curve Figure 4-2 Growth curve of rats in each group Data are expressed as mean ± SEM (n=8) N0: diet does not contain sesamin, N1: diet contains 0.1% sesamin, N5: diet contains 0.5% sesamin, F0: diet does not contain sesamin, F1: diet contains 0.1% sesamin, F5: diet contains 0.5% sesamin. a, b, c Values with different superscripts are significantly different at p＜0.05. 61. N0 N1 N5 F0 F1 F5.
(73) 表 4- 2 芝麻素對於增加體重量及肝臟、腎臟、副睪白色脂肪、副腎白色脂肪和總脂肪重量的影響 Table 4-2 Tht effect of sesamin on weight gain, liver, kidney, epididymal fat, perirenal fat and total fat weight in each group N0 Body weight gain(g) 138.0±4.9bc Liver weight 10.99±0.29b Relative liver weight (g/100g Wt) 2.7±0.1c Kidney weight 2.64±0.08b Relative kidney weight (g/100g Wt) 0.64±0.02a Epididymal fat weight 6.48±0.37c Relative epididymal fat weight(g/100g Wt) 1.56±0.08c Perirenal fat weight 1.35±0.99c Relative perirenal fat weight(g/100g Wt) 2.73±0.23c Total fat weight 17.8±3.6c Relative total fat weight(g/100g Wt) 4.3±0.29c. N1 128.5±1.8bc 10.78±0.05b. N5 123.6±5.2c 10.99±0.21b. F0 157.0±5.5a 16.21±0.44a. F1 144.9±7.6ab 16.77±0.67a. F5 135.4±9.5bc 16.80±0.46a. 2.7±0.0bc 2.65±0.03b. 2.8±0.0bc 2.64±0.05b. 2.9±0.0b 3.21±0.10a. 3.3±0.1a 3.21±0.08a. 3.3±0.1a 3.25±0.05a. 0.64±0.01a 6.56±0.54 c. 0.63±0.01a 6.02±0.43c. 0.62±0.02a 13.10±1.09a. 0.63±0.02a 11.75±0.79ab. 0.63±0.03a 10.61±0.85b. 1.56±0.1c 9.25±0.44cd. 1.44±0.07c 8.36±0.83d. 2.48±0.16a 19.41±0.88a. 2.25±0.09ab 16.02±0.94b. 2.06±0.12b 15.72±1.29b. 2.22±0.08d 15.8±2.6c. 1.91±0.11d 14±2.8c. 3.63±0.11a 32.7±5a. 3.25±0.12ab 27.8±4.8b. 3.1±0.19b 26.3±5.8b. 3.83±0.2c. 3.41±0.19d. 6.06±0.27a. 5.37±0.22ab. 5.19±0.30b. 60.
(74) Data are expressed as mean ± SEM (n=8) N0: diet does not contain sesamin, N1: diet contains 0.1% sesamin, N5: diet contains 0.5% sesamin, F0: diet does not contain sesamin, F1: diet contains 0.1% sesamin, F5: diet contains 0.5% sesamin. a, b, c Values with different superscripts are significantly different at p＜0.05. 61.
(75) 第三節、體脂肪堆積分析 副睪、附腎白色脂肪和總脂肪重量如表 4-2 所示。. 一、副睪白色脂肪 肥胖組中各組的副睪脂肪重量都顯著高於同劑量下的正常體重 組，表高脂飲食會增加副睪白色脂肪的囤積。正常體重組中三組間副 睪脂肪重量沒有顯著的差異。肥胖組中，在 F5 組副睪脂肪重量顯著 低於 F0 組(p=0.0196)，顯示在高脂飲食的給予下，高劑量芝麻素的添 加可顯著減少肥胖大鼠體內副睪白色脂肪囤積的情況。. 二、附腎白色脂肪 肥胖組間各劑量下的附腎白色脂肪重量都顯著高於同劑量的正 常體重組，顯示高脂飲食會引起附腎白色脂肪的囤積增加。正常體重 組間，N5 組的附腎白色脂肪重量顯著低於 N0 組(p=0.02)，但 F0 和 F1 之重量沒有差異，F1 和 F5 之重量也沒有差異，表示在正常飲食 下添加高劑量 0.5%的芝麻素，可顯著減少正常體重老鼠附腎白色脂 肪部份的囤積情形。肥胖組部分，F1 和 F5 組的附腎白色脂肪重量都 顯著低於 F0 組，表示無論是高、低劑量芝麻素的添加，都可顯著減 少附腎白色脂肪的堆積。 總脂肪部分，正常體重組中同劑量的總脂肪重量都顯著少於肥胖 62.
(76) 組。並發現正常體重組內總脂肪重量都沒有差異；肥胖組中，F1 組 以及 F5 組的總脂肪重量顯著低於 F0 組(p=0.03，p=0.007)，表示無論 是高、低劑量芝麻素的添加，都可顯著減少總脂肪囤積的情況。. 63.
(77) 第四節、血脂質濃度分析 血液中脂質的濃度如表 4-3 所示。. 一、 血漿中三酸甘油酯濃度 血漿中三酸甘油酯濃度如圖 4-3 所示。在正常體重組中，N1 和 N5 組血中三酸甘油酯濃度都顯著比 N0 組低。肥胖組中，也發現 F1 和 F5 組血漿中三酸甘油酯濃度都顯著比 F0 組低。表示無論在正常飲 食或在高脂飲食中添加芝麻素，都可顯著降低血漿中三酸甘油酯濃 度。且發現 N1、N5、F1、F5 四組間血清中三酸甘油酯濃度都沒有差 異，這也指出即使是給予高脂飲食下的肥胖大鼠，無論添加高、低劑 量的芝麻素，都可使其血漿中三酸甘油酯濃度與給予正常飲食下添加 芝麻素有相同的血漿中三酸甘油酯濃度。. 二、 血漿中總膽固醇濃度(Total cholesterol；TC) 血漿中總膽固醇濃度如圖 4-4 所示。F0 組血漿中總膽固醇濃度顯 著高於 N0 組，指出肥胖老鼠體內血漿中總膽固醇濃度顯著比正常老 鼠高。N5 組血漿中總膽固醇濃度顯著高於 N0 組(p=0.01)，但 N0 和 N1 之總膽固醇以及 N1 和 N5 之總膽固醇濃度都沒有差異，表添加高 劑量芝麻素可顯著減少正常體重老鼠血漿中總膽固醇的濃度。肥胖組 其血漿中總膽固醇濃度都沒有顯著差異，表芝麻素的添加對肥胖大鼠 64.
(78) 血漿中總膽固醇濃度沒有顯著影響。. 三、 血漿中游離脂肪酸濃度 血漿中游離脂肪酸濃度如圖 4-5 所示。發現 F0 組血漿中游離脂 肪酸濃度顯著高於 N0 組，表示高脂飲食會引起血漿中游離脂肪酸濃 度的增加。在正常體重組內，血漿中游離脂肪酸的濃度都沒有顯著差 異。肥胖組間，F5 組血漿中游離脂肪酸的濃度顯著低於 F0 組 (p=0.0096)，但 F0 與 F1 的血漿中游離脂肪酸濃度，以及 F1 和 F5 組 血漿中游離脂肪酸濃度都沒有差異。表示芝麻素的添加，對於正常體 重的老鼠沒有影響，而對於肥胖大鼠，高劑量芝麻素的添加可顯著降 低其血漿中游離脂肪酸的濃度。. 四、 血漿中低密度脂蛋白膽固醇濃度(LDL-C) 血漿中 LDL-C 濃度如圖 4-6 所示。F0 組顯著高於 N0 組，表示 高脂飲食會引起老鼠血漿中 LDL-C 濃度的增加。而在正常體重組 間，N5 組血漿中 LDL-C 濃度顯著低於 N0 組(p=0.0217)，但 N0 和 N1 組間血漿中 LDL-C、及 N1 和 N5 組間血漿中 LDL-C 濃度都沒有 差異，表高劑量芝麻素可顯著減少正常大鼠血漿中 LDL-C 的濃度。 肥胖組中，F5 組血漿中 LDL-C 顯著低於 F0 組，且 F5 與 N0 組的濃. 65.
(79) 度沒有差異，但 F0 與 F1 組血漿中 LDL-C 濃度以及 F1 和 F5 組血漿 中 LDL-C 濃度都沒有差異。此結果指出，在飲食中添加高劑量芝麻 素，無論是對於正常體重或肥胖的老鼠，都具有顯著下降血清中低密 度脂蛋白膽固醇的功效，且在肥胖大鼠飲食中，高劑量芝麻素的添加 可使血漿中 LDL-C 濃度降到與正常體重大鼠血漿中濃度無差異。. 五、 血漿中高密度脂蛋白膽固醇濃度 血漿中高密度脂蛋白膽固醇濃度如圖 4-7 所示。結果發現 N0 與 F0 組沒有差異，指出正常飲食與高脂飲食對血清中 HDL-C 的濃度沒 有影響。在正常體重組內 HDL-C 濃度沒有顯著差異。在肥胖組中， F5 組血漿中 HDL-C 的濃度顯著比 F0 高(p=0.0032)，而 F1 與 F0 組血 漿 中 HDL-C 濃 度 相 較 雖 沒 有 統 計 上 的 差 異 但 有 增 加 的 趨 勢 (p=0.0607)。此結果指出，在肥胖大鼠體內，高劑量芝麻素的添加可 顯著增加血漿中 HDL-C 的濃度，低劑量芝麻素的添加也具有增加的 趨勢，但在正常體重大鼠體內則沒有顯著影響。. 六、血漿中葡萄糖的濃度 血漿中葡萄糖的濃度如圖 4-8 所示。發現 F0 組禁食下血漿中葡 萄糖濃度顯著高於 N0 組，表示高脂飲食會導致血漿中葡萄糖濃度的 增加。在正常體重組內，其血漿中葡萄糖濃度都沒有顯著差異，而在. 66.
(80) 肥胖組內也沒有顯著差異。表示芝麻素的添加，無論是對於正常體重 或是肥胖的大鼠，對其血漿中葡萄糖的濃度都沒有顯著的影響。. 七、血漿中胰島素的濃度 血漿中胰島素的濃度如圖 4-9 所示。正常體重組中，胰島素濃度 都沒有顯著差異。肥胖組中，F1、F5 組的胰島素濃度都顯著較 F0 低 (p＜0.05)。此結果指出，對於正常體重的大鼠，芝麻素的添加不會影 響血漿中胰島素濃度，而在肥胖大鼠，無論高、低劑量的芝麻素的添 加，都可有效降低其血漿中胰島素的濃度。. 八、胰島素敏感性的計算 胰島素敏感性的結果如圖 4-10 所示。利用 HOMA-IR 計算胰島 素敏感性，結果指出，在正常體重組內，胰島素敏感性沒有顯著差異。 在肥胖組，F5 組胰島素敏感性顯著高於與 F0 組，但 F0 與 F1 組的 HOMA-IR 值以及 F1 和 F5 組的 HOMA-IR 值都沒有顯著差異。表示 高劑量芝麻素的添加，可顯著增加肥胖大鼠體內的胰島素敏感性，雖 對正常體重大鼠的胰島素敏感性都沒有顯著影響。. 九、血漿中 Leptin 的濃度 血漿中 Leptin 濃度如圖 4-11 所示。在正常體重組間，發現三組 間血漿中 leptin 濃度沒有差異。在肥胖組內，F5 組血漿中 leptin 濃度 67.
(81) 顯著低於 F0 組，而 F1 和 F0 組相較沒有顯著差異但具有下降的趨勢 (p=0.0578)。指出芝麻素的添加對正常體重老鼠血漿中 leptin 濃度沒 有影響。在肥胖組間，高劑量芝麻素的添加可顯著減少血漿中 leptin 的濃度，低劑量芝麻素的添加則具有減少血漿中 leptin 濃度的趨勢。. 68.
(82) 表 4- 3 芝麻素對血漿中 TG、TC、NEFA、HDL-C、LDL-C、insulin 和 leptin 濃度的影響 Table 4-3 Effect of sesamin on the plasma concentration of TG, TC, NEFA, HDL-C, LDL-C, insulin and leptin in rats N0 TG(mg/dL) 66.2±6.9a TC(mg/dL) 61.5±2.7bcd NEFA(nnol/L) 0.62±0.12c HDL-C(mg/dL) 17.8±0.7cd LDL-C(mg/dL) 33.4±1.6bc Insulin(ug/dL) 0.91±0.20ab Leptin(ng/mL) 4.89±0.04a. N1 29.6±2.7c 53.0±2.3de 0.52±0.03c 17.2±0.7cd 26.4±1.4cd 0.6±0.09b 4.82±0.05ab. N5 30.7±1.9c 46.6±1.9e 0.49±0.04c 16.7±0.5d 24.0±1.3d 0.80±0.12b 4.80±0.06abc. Data are expressed as mean ± SEM (n=8) N0:diet does not contain sesamin, N1: diet contains 0.1% sesamin, N5:diet contains 0.5% sesamin, F0:diet does not contain sesamin, F1:diet contains 0.1% sesamin, F5:diet contains 0.5% sesamin. a, b, c Values with different superscripts are significantly different at p＜0.0. 69. F0 41.3±2.5b 74.4±5.9a 1.12±0.03a 19.4±1.1bc 46.6±5a 1.31±0.27a 4.88±0.04ab. F1 26.3±1.7c 73.5±6.0ab 0.96±0.04ab 22.4±1.8ab 39.0±1.6ab 0.72±0.08b 4.76±0.02bc. F5 30.2±2.9c 65.5±5.0abc 0.86±0.07b 24.2±1.1a 37.4±3.5b 0.86±0.16b 4.69±0.04c.
(83) Concentration(mg/dL). Triacylglycerol 80 70 60 50 40 30 20 10 0. a. N0. b. c. c. N1. N5. F0. c. c. F1. F5. (group) 圖 4- 3 芝麻素對血漿中三酸甘油酯濃度的影響 Figure 4-3 Effect of sesamin on plasma triacylgleceride of rat in each group Data are expressed as mean ± SEM (n=8) N0: diet does not contain sesamin, N1: diet contains 0.1% sesamin, N5: diet contains 0.5% sesamin, F0: diet does not contain sesamin, F1: diet contains 0.1% sesamin, F5: diet contains 0.5% sesamin. a, b, c Values with different superscripts are significantly different at p＜0.05. 70.
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