• Sonuç bulunamadı

In Vitro Koşullarda Flukonazol ve Ketokonazol ile GranŸlosit-Koloni StimŸüle Edici Faktöšr Kombinasyonunun İnsan Nšötrofil Fonksiyonları †Üzerine Etkisi

N/A
N/A
Protected

Academic year: 2021

Share "In Vitro Koşullarda Flukonazol ve Ketokonazol ile GranŸlosit-Koloni StimŸüle Edici Faktöšr Kombinasyonunun İnsan Nšötrofil Fonksiyonları †Üzerine Etkisi"

Copied!
6
0
0

Yükleniyor.... (view fulltext now)

Tam metin

(1)

Girifl

Candida ve Aspergillus türleri, nötropenik kanser hasta-lar›nda yaflam› tehdit eden infeksiyonlara yol açan en önem-li mantarlard›r (1). En s›k f›rsatç› mantar infeksiyonu olufltu-ran Candida türleri, Candida türlerinden de kliniklerde en s›k izole edilen Candida albicans’t›r. Candida türlerinin oluflturdu¤u f›rsatç› infeksiyonlar, geçen 10-15 y›ll›k süre içinde art›fl göstermifl, 1985-1988 y›llar› aras›nda ABD’de nozokomiyal kandan yay›lan infeksiyonlar›n % 7.7’sini Candida türleri oluflturmufltur (2). PMN’ler, sistemik mantar infeksiyonlar›na karfl› en önemli konak savunma elemanla-r›d›r. Nötropeninin sistemik kandidiyaz için majör

predispo-zan faktör oldu¤u bilinmektedir. PMN fonksiyonlar›nda olu-flan bask›lanmalar, f›rsatç› infeksiyonlar›n kontrol edileme-mesine yol açar. Kullan›lan birçok antifungal ilac›n normal terapötik konsantrasyonlarda fungistatik olmas› nedeniyle baflar›l› tedavi için efektif fagositik hücre fonksiyonlar› s›k-l›kla önemlidir. Antineoplastik ajanlar, analjezikler, antibi-yotikler ve antifungal ilaçlar›n PMN fonksiyonlar› üzerinde olumlu ve olumsuz etkilerinin oldu¤u bilinmektedir (3,4).

Sistemik Candida infeksiyonlar›n›n tedavisinde poliyen yap›l› amfoterisin B, toksisitesine ra¤men hâlâ seçkin bir ilaç olarak kullan›lmaktad›r (5). Sentetik azol yap›l› antifun-gal ilaçlar ise, halen sistemik mantar infeksiyonlar›n›n teda-visinde verilerin az olmas› nedeniyle alternatif tedavi seçe-nekleridirler. Flukonazol ve ketokonazol, azol yap›l› iki an-tifungal ilaçt›r. Flukonazol, sistemik kandidiyaz tedavisinde ümit verici gözükmekte, nötropenik olmayan hastalarda ve stabil nötropenik hastalardaki sistemik kandidiyaz tedavisin-de önerilmektedir. Ketokonazol ise, immündüflkün (immu-nocompromised) hastalarda etkisiz olmas› nedeniyle öneril-memektedir (6-8).

In Vitro Koflullarda Flukonazol ve Ketokonazol ile

Granülosit-Koloni Stimüle Edici Faktör

Kombinasyonunun ‹nsan Nötrofil Fonksiyonlar›

Üzerine Etkisi

Nazif Elald›

1

, ‹lyas Dökmetafl

1

, Sevtap Bak›r

2

, Mehmet Bak›r

1

, Mehmet fiencan

3

,

M. Zahir Bak›c›

4

, Hüseyin Ayd›n

2

, E. Gül Delibafl

4

Özet: Sistemik mantar infeksiyonlar›n›n tedavisinde kullan›lan flukonazol ve ketokonazolün granülosit-koloni sti-müle edici faktör (rhG-CSF) ile kombine edilmesinin polimorfonükleer lökosit (PMN) fonksiyonlar› üzerine etkisi araflt›r›ld›. Sa¤l›kl›, gönüllü üç donörden elde edilen PMN’ler, in vitro koflullarda rhG-CSF ile muamele edildikten son-ra Candida albicans CBS 2730 blastosporlar›n› fagosite etme ve hücre içi öldürme gibi fonksiyonlar› aç›s›ndan gözlem-lendi. Ayn› donörlerden elde edilen PMN’ler antifungal ilaçlar ve blastosporlarla birlikte inkübe edildi ve PMN fonksi-yonlar› gözlemlendi. Üçüncü aflamada yine ayn› donörlerden elde edilen PMN’ler, önceden 3000 U/ml rhG-CSF ile mu-amele edildikten sonra antifungal ilaçlar ve blastosporlarla birlikte inkübe edilerek PMN fonksiyonlar› gözlemlendi. Bulgular›m›z, rhG-CSF’nin sistemik mantar infeksiyonlar›n›n tedavisinde antifungal ilaçlarla, özellikle flukonazol ile birlikte kullan›ld›¤›nda yararl› olabilece¤ini düflündürmektedir.

Anahtar Sözcükler: G-CSF, flukonazol, ketokonazol.

Summary: Effects of combination with granulocyte-colony stimulating factor, fluconazole and ketoconazole on the function of human neutrophils. In this study combination of fluconazole and ketoconazole which were used in the treat-ment of systemic fungal infections with rhG-CSF were tested on neutrophil functions. Neutrophils which were taken from three healthy volunteers were treated with rhG-CSF in-vitro conditions. Then those neutrophils were tested with phagocy-ting and intracellular killing of Candida albicans CBS 2730 blastospores. Neutrophils which were taken from the same do-nors were incubated with antifungal drugs and blastospores, and neutrophil functions tested. In the third step, neutrophils which were taken from same donors were treated with 3000 U/ml of rhG-CSF and then incubated with antifungal drugs and blastospores, and neutrophil functions tested. As a result, we concluded that rhG-CSF could be helpful in the treat-ment of systemic fungal infections when used with ketoconazole, and especially fluconazole.

Key Words: G-CSF, fluconazole, ketoconazole.

(1) Cumhuriyet Üniversitesi, T›p Fakültesi, Klinik Bakteriyoloji ve ‹nfeksiyon Hastal›klar› Anabilim Dal›, S›vas

(2) Cumhuriyet Üniversitesi, T›p Fakültesi, Biyokimya Anabilim Dal›, S›vas

(3) Cumhuriyet Üniversitesi, T›p Fakültesi, ‹ç Hastal›klar› Anabilim Dal›, S›vas

(4) Cumhuriyet Üniversitesi, T›p Fakültesi, Mikrobiyoloji Anabilim Dal›, S›vas

(2)

Daha önce sistemik mantar infeksiyonlar›n›n tedavisin-de kullan›lan flukonazol ve ketokonazolün PMN fonksiyon-lar› üzerine olan etkileri araflt›r›lm›fl ve de¤iflik sonuçlar el-de edilmifltir (4,9-14). Yine rhG-CSF’nin ise, PMN’lerin fonksiyonlar›n› art›rd›¤› bildirilmifltir (15-17). Ayr›ca nötro-penik farelerde gelifltirilen sistemik Candida infeksiyonla-r›nda tek bafl›na kullan›ld›¤›nda (18), flukonazol ve itrako-nazol ile kombine edildi¤inde mortalite oran›n› azaltt›¤› da bildirilmifltir (19). ‹mmündüflkün hastalarda geliflen sistemik mantar infeksiyonlar›n›n tedavisinde antifungal tedaviye ek olarak koloni stimüle edici faktör uygulamalar›n›n hastalar› bu infeksiyonlardan koruyabilece¤i de öne sürülmüfltür (8). Biz bu çal›flmada, sistemik mantar infeksiyonlar›n›n te-davisinde kullan›lan flukonazol ve ketokonazolün in vitro koflullarda tek bafllar›na ve rhG-CSF ile kombine edildi¤in-de PMN fonksiyonlar› üzerine olan etkilerini incelemeyi planlad›k. Amac›m›z, triazol grubu flukonazol ile imidazol grubu iki azol yap›l› antifungal ilac›n rhG-CSF ile kombine edildi¤inde rhG-CSF’nin daha önce deney hayvanlar›nda görülen yararl› etkisinin in-vitro koflullarda PMN fonksiyon-lar› üzerinde gözlenip gözlenmeyece¤ini de¤erlendirmekti.

Yöntemler

PMN’lerin Elde Edilmesi: PMN’ler, daha önce Candi-da infeksiyonu anamnezi olmayan 3 sa¤l›kl› gönüllü donör-den (yafl ortalamas› 28 y›l) al›nan kandan Verbrugh’un ta-n›mlad›¤› modifiye Böyum tekni¤iyle elde edildi (20). Özetle, PMN’ler, 5-10 U/ml benzil alkol içermeyen heparin (Nevparin®, Bilim ‹laç) ile s›vanm›fl injektörlere al›nan

ka-n›n, dekstran (Macrodex®, Baxter) ile 45 dakika çökmeye

b›rak›lmas› ve fikol (Histopaque®,Sigma, katalog no. 1077-1) ile santrifüje edilmesi ile elde edildi. Elde edilen PMN’ler, Hanks’›n dengeli tuz solüsyo-nu (HBSS) ile iki kez y›kand›. Sosolüsyo-nunda hücrelerin canl›l›¤› tripan mavisi (Sigma, katalog no. T8154) ile test edildi (boyan›rsa ölü, boyanmazsa canl›) ve % 0.05 oran›nda s›¤›r serum albümini (Sigma, kata-log no. B 4287) içeren HBSS içinde Neubauer lam› ve lökosit pipeti yard›m›yla 5x106/ml’ye ayarland›.

Candida albicans: Araflt›rma boyunca C. albi-cans CBS 2730 suflu kullan›ld› ve Refik Saydam H›fz›ss›ha Merkezi’nden sa¤land›. C. albicans’lar, araflt›rmadan 24 saat önce saklama besiyerinden Sabouraud dekstroz agara ekilip 24 saat süreyle 37°C’de inkübe edildi. Candida’lar bu flartlarda psödohif veya germ tüpü oluflturmadan sadece blastospor faz›nda üredi. Blastosporlar, HBSS içinde 1x107/ml’ye

ayar-land›.

AB Serumu Haz›rlanmas›: AB grubu kandan elde edi-len serum opsonizasyon için kullan›ld›. 1 ml’lik küçük ha-cimler halinde -20°C’de donduruldu ve araflt›rmadan hemen önce oda ›s›s›nda bekletilerek çözünmesi sa¤land›. Candi-da’lar›n opsonizasyonu için hacimce % 20’lik konsantras-yonlar› kullan›ld›.

‹laçlar: Flukonazol (Triflucan®, Pfizer) piyasadan temin

edildi. ‹laç intravenöz infüzyon için haz›rlanm›fl preparas-yondu; 2 mg/ml konsantrasyonda ve serum fizyolojik içinde çözündürülmüfltü. ‹laç, seri seyreltmelerle HBSS içinde 1-25 µg/ml konsantrasyona ayarlan›p araflt›rmada kullan›ld›.

Ketokonazol (Bilim ‹laç), toz halde al›narak önce 0.2 N HCl içinde çözündürüldü ve 50 mg/ml konsantrasyona getirildi. Takiben, steril dam›t›k su ile 100 µg/ml’ye ayarland›. 1-25 µg/ml aras›ndaki konsantrasyonlar HBSS içinde haz›rland›. Ketokonazol, araflt›rma süresi içinde günlük olarak haz›rla-n›p kullan›ld›. Sitokin, rhG-CSF (Neupogen®, Roche) piya-sadan sa¤land›. Mililitresinde 30 milyon U (300 µg) sitokin içeriyordu ve Escherichia coli’den elde edilmiflti.

Araflt›rmada sadece sitokin ile çal›fl›lan grupta ilac›n 1 500-6 000 U/ml konsantrasyonlar› kullan›ld›. Çünkü bu konsantrasyonlar, hastalara parenteral 1.5-3 µg/kg G-CSF verilmesinden sonra ulafl›labilen serum sitokin konsantras-yonlar›d›r (21). G-CSF’nin antifungal ilaçlarla kombine edildi¤i gruplarda ise PMN’leri önceden 3000 U/ml sitokin ile muamele ettik. Çünkü bu konsantrasyon, hem hastalarda serumda ulafl›labilen konsantrasyonu, hem de sadece sitokin Tablo 1. rhG-CSF ile Gözlenen PMN Fonksiyonlar›*

Konsan-trasyon

(U/ml) Fag (%) HÖ (%) F‹ CH‹A (%)

0 39.3±1.8 17.8±2.4 2.2±0.1 84.7±0.7 1 500 44.0±5.8 21.2±1.9 2.0±0.3 85.3±3.7 3 000 50.0±4.0 24.9±2.5 1.8±0.1 90.6±1.8 4 500 48.6±3.3 30.0±4.6 1.9±0.1 91.3±1.3 6 000 52.6±0.7 29.5±6.8 1.7±0.1 90.0±1.2 *Bütün de¤erler, üç ölçümün ortalamas› ± SE olarak verilmifltir.

Fag: fagositoz oran›, HÖ: hücre içi öldürme oran›, F‹: fagositik indeks, CH‹A: Candida’lar›n hücre içine al›n›m oran›.

Tablo 2. Flukonazol ve Ketokonazol ile Gözlenen PMN Fonksiyonlar›*

‹laç Flukonazol Ketokonazol

Konsan-trasyonu

(µg/ml) Fag (%) HÖ (%) F‹ CH‹A (%) Fag (%) HÖ (%) F‹ CH‹A (%)

0 41.3±2.4 17.8±0.4 2.1±0.2 87.3±4.0 44.7±2.7 17.6±1.6 2.0±0.1 85.3±1.8 1 41.3±3.5 19.8±1.5 2.0±0.2 80.7±0.7 38.0±0.1 22.8±4.0 2.0±0.1 75.5±2.7 5 40.0±3.0 21.7±1.3 1.9±0.1 78.0±3.0 38.0±1.2 25.9±4.9 1.9±0.1 71.3±2.7 10 36.0±2.3 21.5±1.2 2.2±0.2 78.0±1.2 38.7±1.8 26.8±1.9 1.9±0.2 74.7±2.4 25 34.7±0.7 18.9±1.4 2.2±0.1 77.3±1.3 41.3±1.8 25.2±3.0 2.0±0.2 83.3±6.8 *Bütün de¤erler, üç ölçümün ortalamas› ± SE olarak verilmifltir.

(3)

ile çal›fl›lan grupta ortalama sitokin konsantrasyon de¤erini ifade ediyordu. Antifungal ilaçlar›n klinikte güvenle ulafl›labilecek serum konsantrasyonlar›, flukonazol için 25

µg/ml, ve ketokonazol için 5 µg/ml’dir (4).

PMN’lerin Önceden Sitokinle Muamelesi: Sadece sito-kin ile çal›fl›lan grupta, 5 adet steril 12x75 mm kapakl› plas-tik tüp al›nd›. Daha önceden haz›rlanan (5x106/ml PMN)

solüsyondan her birine 0.2 ml (1x106PMN) mikropipet

yar-d›m›yla yavaflca aktar›ld›. ‹lk tüp, kontrol tüpü kabul edildi ve 0.2 ml HBSS (tampon) kondu. ‹kinci tüpe 1 500 U/ml, 3. tüpe 3 000 U/ml, 4. tüpe 4 500 U/ml, 5. tüpe 6 000 U/ml so-nuç konsantrasyon olacak flekilde sitokin içeren solüsyon-dan 0.2 ml mikropipet yard›m›yla eklendi. Böylece PMN’le-rin 4 ayr› konsantrasyondaki sitokinle muamele edilmesi sa¤land›. Sitokinin antifungal ilaçlarla kombine edildi¤i ça-l›flma gruplar›nda ise, PMN solüsyonu tüplere da¤›t›ld›ktan sonra 1. tüp kontrol tüpü olarak kabul edilip 0.2 ml tampon, di¤er 4 tüpe ise 3 000 U/ml sonuç konsantrasyon olacak fle-kilde sitokin içeren solüsyondan 0.2 ml eklendi. Böylece PMN’ler, fagositoz ve hücre içi öldürme iflleminden önce kontrol grubu hariç 3 000 U/ml sitokinle muamele edildiler. Kapaklar› s›k›ca kapat›lan tüpler, 30 dakika süreyle 37°C’deki benmari içinde uçtan uca olacak flekilde ortalama 4 devir/ dakika h›zla elle çevrildiler. Bu ifllem sonunda hüc-relerde kümelenme görülmedi. Önceden PMN’lerin canl›l›-¤›, deney bafllang›c›na kadar her basamakta tripan mavisi ile test edildi. Hücreler % 95’ten fazla canl› idiler. Canl›l›¤› % 95’ten az olan hücre solüsyonlar› çal›flmaya al›nmad›.

Candida’lar›n Opsonizasyonu: PMN’lerin sitokin ile muamele edilmesiyle eflzamanl› olarak Candida’lar opsoni-ze edildi. Daha önce haz›rlanm›fl 1x107/ml say›da blastospor

içeren solüsyondan steril bir tüpe 0.5 ml kondu. Üzerine % 40’l›k AB serumdan 0.5 ml konup, toplam 1 ml % 20 AB serum ve 5x106/ml blastospor içeren solüsyon elde edildi.

Candida’lar, 30 dakika süreyle 37°C s›cakl›kta benmari içinde ortalama 4 devir/dakika h›zla uçtan uca olacak flekil-de elle çevrildiler. Bu ifllem s›ras›nda hücrelerflekil-de kümelenme ve psödohif oluflumu gözlenmedi. Candida’lar›n canl›l›¤› tripan mavisi ile test edildi ve deney bafllang›c›na kadar hüc-reler % 98’den fazla canl› idiler. Canl›l›¤› % 95’ten az olan hücre solüsyonlar› çal›flmaya al›nmad›.

Fagositoz ve Hücre ‹çi Öldürülmenin Ölçülmesi: G-CSF ve tampon ile önceden muamele edilen ve 1x106PMN

ile opsonize edilmifl 1x106blastospor, steril 12x75 mm

bo-yutlar›ndaki kapakl› 5 adet plastik tüp içine mikropipet yar-d›m›yla yavaflça boflalt›ld›. Sadece sitokin ile çal›fl›lan grup-ta antifungal ilaç yerine eflde¤er hacimde grup-tampon, sadece an-tifungal ilaçlarla çal›fl›lan gruplarda ise sitokin yerine eflde-¤er hacimde tampon kullan›l›p ilaçlar›n de¤iflik konsantras-yonlar› tüpe eklendiler. Sitokin ve ilaçlar›n kombine edildi-¤i grupta önceden 3 000 U/ml sitokinle muamele edilen PMN’ler, ilaçlar›n de¤iflik konsantrasyonlar›yla ve eflde¤er say›da (1x106) blastosporla birlikte steril tüp içine

eklendi-ler. Her çal›flma grubunda deney, tüpler içinde 1 ml olan so-nuç hacimde yap›ld›. Tüpler, 37°C’deki benmari içinde 15 dakika süreyle 4 devir/dakika h›zla uçtan uca elle çevrildiler. Bu sürenin sonunda her tüpten ayr› ayr› 0.2 ml al›narak ste-ril, kapakl› 5 adet (12x75 mm) plastik tüp içine yavaflça bo-flalt›ld›. Tüplere, önceden al›nd›¤› tüp ile ayn› numarada ola-cak flekilde 1-5 aras›nda numaralar verildi. Yeni tüpler, 40xγ devirde 10 dakika süreyle santrifüje edildiler. Süpernatan k›-s›m at›larak altta kalan PMN ve Candida kar›fl›m›ndan temiz lam üzerinde yayma haz›rland›. Lamlara al›nd›¤› tüpe uygun flekilde 1-5 aras›nda numaralar verildi ve oda ›s›s›nda kuru-tulduktan sonra 15 dakika metil alkol ile tespit edildikten sonra Giemsa yöntemi ile boyand›lar. Hücre içi öldürme, Schmid ve Brune metoduyla ölçüldü (22). Benmari içindeki tüpler, hücre içi öldürmenin ölçülmesi için 45 dakika daha inkübe edildikten sonra al›n›p, üzerine tripan mavisinden ek-lendi. Oda ›s›s›nda 3 dakika bekletildikten sonra Neubauer lam› üstüne bir damla al›narak yafl preparat haz›rland› ve toplam 100 PMN tarand›. Hücreler içinde canl› (boya alma-m›fl) ve ölü (boya alalma-m›fl) blastosporlar ayr› ayr› her tüp için say›ld› ve kaydedildi (Resim 1). Say›m ifllemini yapan arafl-t›rmac›, preparat›n hangi tüpten haz›rland›¤›n› bilmiyordu. Fagositoz oran›, Giemsa ile boyanan preparatlarda her pre-parat için kandida fagosite etmifl ve etmemifl olan toplam 100 hücre say›larak hesapland› (Resim 2). PMN fonksiyon-lar›n›n ölçülmesinde kullan›lan formüller afla¤›da gösteril-mifltir.

Hücre içi öldürme oran› (%): [(100 PMN içindeki ölü Candida ÷ 100 PMN içindeki canl› ve ölü toplam Candida) x 100]

Tablo 3. PMN’lerin Önceden G-CSF ile Muamelesinden Sonra Flukonazol ve Ketokonazol ile ‹nkübe Edilmesiyle Gözlenen PMN Fonksiyonlar›*

‹laç Flukonazol Ketokonazol

Konsan-trasyonu

(µg/ml) Fag (%) HÖ (%) F‹ CH‹A (%) Fag (%) HÖ (%) F‹ CH‹A (%) 0 41.3±1.8 15.8±1.1 2.0±0.1 83.3±2.4 39.3±1.8 14.9±0.7 2.1±0.2 82.0±4.0 1 43.3±1.3 20.9±2.8 1.9±0.1 84.7±0.7 36.7±1.7 22.6±1.7 1.9±0.1 68.0±2.0 5 40.0±3.5 26.9±2.7a 1.8±0.1 72.7±0.7 40.0±2.3 22.3±1.6 2.0±0.2 79.3±2.4

10 39.3±2.7 29.2±1.0a 1.8±0.1 72.0±1.2 37.3±2.7 30.9±3.9a 1.9±0.1 70.7±5.4

25 33.3±2.4 32.2±2.7a 2.1±0.2 69.3±6.6 39.3±2.4 32.2±1.0a 2.1±0.2 82.0±4.6

* Bütün de¤erler, üç ölçümün ortalamas› ± SE olarak verilmifltir.

aKontrolden önemli derecede farkl› p < 0.01.

(4)

Fagositoz oran› (%): [(Fagositoz yapm›fl PMN ÷ say›-lan PMN) x 100]

Candida'lar›n hücre içine al›n›m oran› (%): [(100 PMN içindeki Candida ÷ 100 PMN için eklenen Candida) x 100]

Fagositik indeks: (100 PMN içindeki Candida ÷ fago-sitoz yapm›fl PMN).

‹statistiksel Yöntem: ‹statistiksel de¤erlendirmelerde, tekrarl› ölçümlerde varyans analizi ve Tukey testi kullan›ld›. De¤erler, ortalama ± standard hata fleklinde belirtildi. Gruplar aras›ndaki fark, donör say›s›n›n azl›¤› nedeniyle de¤erlendirilemedi.

Sonuçlar

Tek bafl›na rhG-CSF uygulanan grupta fagositoz aktivi-tesi doza ba¤›ml› olarak artt›. Ayn› flekilde artan konsantras-yonlarda Candida’lar›n hücre içine al›n›m› art›p, fagositik indeks azald›. Hücre içi öldürme oran›nda da artan konsant-rasyonlarda artma gözlendi. Sitokin ile elde edilen bu sonuç-lar, istatistiksel olarak anlaml› bulunmad› (p>0.05) (Tablo 1).

Flukonazolün, önceden tampon ile muamele edilen PMN ve Candida’larla birlikte inkübe edildi¤i grupta ilaç, kontrol grubuna göre PMN fonksiyonlar› üzerinde istatistik-sel anlamda önemli bir etki göstermedi (p>0.05). Sadece fa-gositoz ve Candida’lar›n hücre içine al›nma oran› artan kon-santrasyonlarda hafif derecede azald›. Fakat bu etkiler ista-tistiksel olarak önemli de¤ildi (Tablo 2).

Flukonazolün rhG-CSF ile kombine edildi¤i grupta fa-gositoz oran›, ilac›n artan konsantrasyonlar›nda yaln›z flu-konazolün kullan›ld›¤› gruptaki gibi azalma gösterdi. Bu azalma, istatistiksel olarak anlaml› de¤ildi (p>0.05). Ayn› flekilde artan konsantrasyonlarda fagositik indeks ve Candi-da’lar›n hücre içine al›nma oran›nda da istatistiksel anlamda önemli bir de¤ifliklik gözlenmedi (p>0.05). ‹laç, 5, 10 ve 25 mg/ml konsantrasyonlarda hücre içi öldürme oran›n› istatis-tiksel olarak önemli derecede artt›rd› (p<0.01) (Tablo 3).

Ketokonazolün, önceden tampon ile muamele edilen PMN ve Candida’larla birlikte inkübe edildi¤i grupta ilaç, PMN fonksiyonlar› üzerinde istatistiksel olarak önemli bir etkide bulunmad› (p>0.05) (Tablo 2).

Ketokonazolün rhG-CSF ile kombine edildi¤i grupta, fa-gositoz oran›, fagositik indeks ve Candida’lar›n hücre içine

al›nma oran›nda kontrol grubuna göre istatistiksel anlamda önemli bir fark bulunamad› (p>0.05). Hücre içi öldürme ora-n›nda 10 ve 25 mg/ml konsantrasyonlarda istatistiksel olarak anlaml› derecede art›fl gözlendi (p<0.01) (Tablo 3).

‹rdeleme

Çal›flmam›zda yaln›z rhG-CSF’ün kullan›ld›¤› grupta PMN fonksiyonlar›nda istatistiksel olarak önemli bir art›fl gözleyemedik( p>0.05) (Tablo 1). Bulgular›m›z, Vechiarelli ve arkadafllar› (23) ile Roilides ve arkadafllar› (17)’n›n bul-gular›yla uyumludur. Bu araflt›r›c›lar da bizim çal›flmam›z-daki gibi sa¤l›kl› gönüllülerden elde ettikleri PMN’leri ön-ceden G-CSF ile muamele ettikten sonra Candida blastos-porlar› ile birlikte inkübe etmifller, fagositoz oran›nda ve hücre içi öldürme oran›nda istatistiksel olarak artma ya da azalma gözlememifllerdir. Yamamato ve arkadafllar› (19), PMN’leri G-CSF ve Candida’lar ile birlikte kültür ortam›n-da 15 saat süreyle inkübe etmifller, bu sürenin sonunortam›n-da kan-didalar›n hücre içi öldürülmesinin artt›¤›n› bildirmifllerdir. Bober ve arkadafllar› (24), PMN’leri 18 saat süreyle önceden G-CSF ile muamele ettikten sonra Candida’lar›n fagositozu-nun artt›¤›n›, ancak hücre içi öldürülmelerinin artmad›¤›n› bildirmifllerdir. Bu bulgular bizim ve önceki araflt›rmac›lar›n bulgular›yla uyuflmamaktad›r. Bu uyumsuzlu¤un, PMN’le-rin G-CSF ile muamele sürelePMN’le-rindeki farkl›l›ktan ve kullan›-lan hedef hücrelerin sufllar›n›n farkl›l›¤›ndan kaynakkullan›-land›¤›- kaynakland›¤›-n› düflünmekteyiz. Nitekim granülosit makrofaj koloni sti-müle edici faktör (GM-CSF) ile PMN’lerin artan sürelerle muamele edilmesi, biyolojik fonksiyonlar›nda art›fl sa¤la-m›fl, PMN’lerin oksidatif metabolizmas›n›n art›r›lmas› için GM-CSF ile 2 saat süreyle muamele edilmesinin gerekli ol-du¤u gösterilmifltir (25).

Flukonazolün tek bafl›na uyguland›¤› grupta elde etti¤i-miz bulgular, Roilides ve arkadafllar› (4)’n›n PMN’lerin ön-ceden ilaçla muamele edildi¤inde elde etti¤i bulgular›, Se-nior ve Shaw (9)’un, önceden PMN’leri 75 dakika süreyle flukonazol ile muamele ettikten sonra C. albicans’lar›n hüc-re içi öldürülmesini art›rmad›¤›na dair bulgular›n› destekle-mektedir. Akkoç ve arkadafllar› (10)’na göre ise flukonazol, PMN’lerin 30. ve 90. dakikalarda hücre içi öldürme yete-neklerini art›rmaktad›r. Flukonazol, 0.5-10 mg/ml konsant-rasyonlarda PMN’ler içine ekstraselüler konsantrasyonun-dan 2.2 kat kadar daha fazla oranda, h›zl› bir flekilde

geç-Resim 1. PMN içinde ölü ve canl› blastosporlar (yafl preparat). Tripan mavisi (x400).

Resim 2. Candida blastosporlar›n›n PMN taraf›ndan fagosite edilmesi. Giemsa boyas› (X 1000).

(5)

mekte, ancak amfoterisin B’ye göre daha az hücre içi aktivi-te gösaktivi-termekaktivi-tedir (26). PMN’lerin kemilüminesans (CL) ce-vab›, metabolik kapasitesiyle birlikte fagositoz kapasitesini de gösterir. Abruzzo ve arkadafllar› (27), flukonazolün oral yolla verilmesiyle plazmada elde edilen 1.4 µg/ml pik kon-santrasyonun 20 kat› kadar yüksek bir konsantrasyonda bile fare dalak hücrelerinin in vitro flartlarda luminol ile CL ce-vab›n› art›rmad›¤›n› göstermifltir. Buradan flukonazolün ne hücre içi öldürme, ne de fagositoz oran›na önemli bir etkide bulunmad›¤› sonucu ç›kar›labilir ki bizim bulgular›m›z› des-teklemektedir.

PMN yerine monositlerin kullan›ld›¤› bir çal›flmada flu-konazol ile monositler, birlikte 24 saat süreyle inkübe edil-di¤inde monositlerin hem flukonazole duyarl›, hem de di-rençli Candida sufllar›n›n öldürülmesini art›rd›¤› vurgulana-rak monositlerle flukonazol aras›nda sinerji oldu¤una ifla-retle ve bunun flukonazolün in vivo etkinli¤ini aç›klayabile-ce¤i öne sürülmüfltür (28). Flukonazolün monositlerle olan bu sinerjisinin mekanizmas› bilinmemekle birlikte in vivo etkisi, in vitro Candida’lar›n germ tüpü formasyonunu en-gellemesiyle ba¤lant›l› gibi gözükmektedir (26). Hedef hüc-re E. coli oldu¤unda PMN’lerin önceden flukonazol ile 60 dakika süreyle muamele edilmesi granül içeri¤inin boflalma-s› ve önceden muamele boflalma-s›raboflalma-s›nda vakuol içinde birikmifl olan flukonazolün serbestleflmesiyle E. coli’lerin hücre içi öldürülme oran›n›n artt›¤›, ayr›ca ortamda TNF-α, interlö-kin-1 ve interlökin-8 gibi sitokinlerin artmad›¤› daha önce yap›lan çal›flmalarla gösterilmifltir (11,12). Nassar ve arka-dafllar› (29), makrofajlar› önceden makrofaj koloni stimüle edici faktör (M-CSF) ile muamele ettikten sonra flukonazol ve Cryptococcus neoformans hücreleriyle birlikte kültür or-tam›nda inkübe ettikten sonra flukonazol ile makrofajlar aras›nda C. neoformans’lar›n hücre öldürülmesinin artt›¤›n› bildirmifllerdir. Bu çal›flmaya göre flukonazol ile M-CSF ve makrofajlar aras›nda sinerji bulunmaktad›r ve bizim göz-lemledi¤imiz; flukonazol ile rhG-CSF ve PMN’ler aras›nda Candida blastosporlar›n›n hücre içi öldürülmesindeki siner-jiyi destekler niteliktedir. Flukonazolün, iyi derecede hücre içi penetrasyonu ve yetersiz anti-Candida aktivite gösterdi-¤i (26) gözönüne al›n›rsa, bu sinerjinin sitokin ile PMN’le-rin oksidatif metabolizmas›n›n art›r›lmas› ve flukonazolün germ tüpü oluflumuna karfl› olan aktivitesi ile olufltu¤unu dü-flünmekteyiz. Böyle bir sinerjinin klinikte sistemik kandidi-yaz tedavisinde önemli olabilece¤ini düflünüyoruz. Nitekim bu konudaki bir deneysel araflt›rmada nötropenik farelerde-ki Candida sepsisinde G-CSF ve flukonazol kombinasyonu hem farelerdeki yaflam süresini art›rm›fl, hem de hedef organ oldu¤u kabul edilen böbrek homojenat kültürlerinde Candi-da koloni say›s›n› azaltm›flt›r (19). Ayn› çal›flmaCandi-da sitokin ile amfoterisin B ve flusitozin kombinasyonu hayvanlardaki ya-flam süresini kontrol grubuna göre art›ramam›flt›r. Araflt›r›c›-lar, flukonazolün 0.1 mg/kg gibi düflük dozlar›n›n bile G-CSF ile kombine edilmesiyle farelerin yaflam süresinde kay-da de¤er artma gözlemifller, kombinasyonun etkinli¤inin tri-azol s›n›f› ilaç kullan›ld›¤›nda iyi oldu¤unu bildirmifllerdir. Benzer sonuçlar Polak (30) taraf›ndan da gözlenmifltir. Nöt-ropenik farelerdeki sistemik Candida infeksiyonunda itrako-nazol ve flukoitrako-nazolün G-CSF ile kombine edilmesi fareler-de kontrol grubu, G-CSF grubu ve yaln›z antifungal ilaç alan gruptaki farelere göre anlaml› derecede artm›fl yaflam süresi

göstermifltir. Bir imidazol türevi olan ketokonazolün G-CSF ile kombine edilmesi farelerde yaflam süresini uzatm›fl, an-cak 20. gündeki yaflam süresi flukonazol ve itrakonazolün G-CSF ile kombine edildi¤i gruba göre daha düflük bulun-mufltur.

Ketokonazolün PMN’lerin fagositoz yetene¤i üzerine olan etkisiyle ilgili bulgular›m›z önceki çal›flmalarla uyum-ludur (4,13,14). Abruzzo ve arkadafllar› (31), ketokonazolün serumda terapötik olarak ulafl›labilen pik konsantrasyonla-r›nda (3.5-16 µg/ml) fare dalak hücrelerinin CL cevab›n› azaltt›¤›n›, dolay›s›yla hücre fonksiyonlar›na zararl› etkide bulundu¤unu belirtmifltir. Senior ve Shaw (9) da 1-8 µg/ml konsantrasyonlarda fare dalak hücrelerinin proliferasyonunu ve 20 mg/ml konsantrasyonda da insan PMN’lerinin Candi-da’lar›n hücre içi öldürülmesini azaltt›¤›n› bildirmifltir. Ro-ilides ve arkadafllar› (4), PMN’leri önceden ketokonazol ile 30 dakika süreyle muamele ettikten sonra Candida’lar›n hücre içi öldürülmesini art›rd›¤›n› ve ketokonazolün terapö-tik konsantrasyonlarda PMN’lerin kemotaksi yetene¤ini ar-t›r›p, süperoksid yap›m›n› azaltt›¤›n› göstermifltir. Bu araflt›-r›c›lar, Candida’lar›n hücre içi öldürülmesinin art›r›lmas›n›, germinasyonun engellenmesi ve takiben PMN’lerin Candi-da’lar› öldürmesini kolaylaflt›rmas›yla aç›klam›fllard›r. Coc-kayne ve Odds (32)’un ketokonazolün Candida hiflerinin uzamas›n› azaltt›¤›, Johnson ve arkadafllar› (13)’n›n ketoko-nazole duyarl› C. albicans sufllar›n›n germ tüpü oluflturma-s›n› engelledi¤i yönündeki bulgular› Roilides ve arkadafllar› (4)’n›n bulgular›n› destekler niteliktedir. Johnson ve arka-dafllar› (13)’na göre de ilac›n bu etkisi, PMN’lerin Candi-da’lar› öldürmesinde önemlidir. Rensburg ve arkadafllar› (14), sa¤l›kl› gönüllülere oral yolla tek doz 400 mg ketoko-nazol uygulam›fl, 2 saat sonra bu gönüllülerden elde etti¤i PMN’lerin motilitesinin artt›¤›n›, bu etkinin siklik Guanozin monofosfat (cGMP) seviyesinin artmas› nedeniyle olabile-ce¤ini ve ayn› etkinin ilac›n in vitro uygulanmas›yla elde edilemedi¤ini belirtmektedir. Ayn› araflt›r›c›lar, in vitro or-tamda PMN’lerin post-fagositik hegsoz monofosfat flant› ve myeloperoksidaz arac›l› iyodinasyonunun etkilenmedi¤ini ve hastalar›n hücresel ve hümoral ba¤›fl›kl›k sistemlerinde bask›lanma gözlenmedi¤ini bildirip, ketokonazolün gerçek etkisinin PMN’lerin göç yeteneklerini düzeltmesi oldu¤una inand›klar›n› da bildirmifllerdir.

PMN’lerin önceden 3000 U/ml rhG-CSF ile muamele edildikten sonra ketokonazolün artan konsantrasyonlar›yla inkübe edildi¤inde 10 ve 25µg/ml konsantrasyonlarda Can-dida blastosporlar›n›n hücre içi öldürmesini art›rmas›n›n ne-deni bilinmemektedir. Bunun nene-deninin anlafl›labilmesi için ileri araflt›rmalar gerekmektedir.

Antifungal ilaçlar›n ve sitokinlerin insan PMN’lerinin fagositik ve mikrobisid fonksiyonlar› üzerine olan etkileri-nin araflt›r›lmas›yla bulunan sonuçlar, birbirleriyle çeliflkiler göstermekte, kullan›lan yönteme, uygulanan ilaçlar›n kon-santrasyonlar›na ve hedef hücrelerin türüne göre de¤iflmek-tedir. Araflt›rmalar sonucu elde edilen sonuçlar›n birbiriyle karfl›laflt›rmas›, ayn› testlerin ve yöntemlerin, ayn› hedef hücrelerin kullan›lmas› halinde bile sufllar›n farkl›l›¤› nede-niyle zordur (3). Bulunan sonuçlar›n bu çerçevede de¤erlen-dirilmesi gerekti¤ini düflünmekteyiz.

Bulgular›m›z, nötropenik ve nötrofil fonksiyonlar› bo-zuk olan hastalarda geliflen sistemik mantar

(6)

infeksiyonlar›-n›n tedavisinde özellikle flukonazol ile olmak üzere azol ya-p›l› antifungal ilaçlarla birlikte rhG-CSF’ün birlikte kullan›l-mas›n›n PMN fonksiyonlar› üzerinde yararl› olabilece¤ini göstermektedir. Daha önce G-CSF ile flukonazolün nötrope-nik farelerdeki sistemik Candida infeksiyonlar›nda kombine edilmesiyle gözlenen yararl› etkisi bize göre bu iki ilac›n Candida’lar›n hücre içi öldürülmesinin art›r›lmas›ndaki si-nerjiyle k›smen aç›klanabilir. Benzer sinerjiyi rhG-CSF ile ketokonazol aras›nda da gözlemledik. Ama bu sinerji keto-konazolün 10 ve 25 µg/ml konsantrasyonlar›nda olufltu. Bu konsantrasyonlar›n ketokonazol için yüksek serum de¤erle-rini ifade etmesinin bilinmesi, in vitro koflullarda elde etti¤i-miz rhG-CSF ile ketokonazol aras›ndaki böyle bir sinerjinin bize göre klinikte önemli olmayabilece¤i sonucunu do¤ura-bilir.

Kaynaklar

1. Hawkins C, Armstrong D. Fungal infections in the immuno-compromised host. Clin Haematol 1984; 13: 599-630 2. Wright WL, Wenzel RP. Nosocomial candida, epidemiology,

transmission, and prevention. Infect Dis Clin North Am 1997; 11: 411-25

3. Pallister CJ, Johnson EM, Warnock DW, Elliot PJ, Reeves DF. In-vitro effects of liposome-encapsulated amphotericin B (AmBisome) and amphotericin B-deoxycholate (Fungizone) on the phagocytic and Candidacidal function of human poly-morphonuclear leucocytes. J Antimicrob Chemother 1992; 30: 313-20

4. Roilides E, Walsh TJ, Rubin M, Venzon D, Pizzo PA. Effects of antifungal agents on the function of human neutrophils in vit-ro. Antimicrob Agents Chemother 1990; 34: 196-201 5. Richardson MD. Systemic fungal infections. Care Crit Ill

1994; 10: 258-61

6. Bodey GP, Bowden RA, Büschner T, et al. International Con-ference for the development of a consensus on the management and prevention of severe candidal infections. Clin Infect Dis 1997; 25: 43-59

7. Hay RJ. Overview of the treatment of disseminated fungal in-fections. J Antimicrob Chemother 1991; 28 (Suppl B): 17-25 8. Walsh TJ, Pizzo A. Treatment of systemic fungal infections:

Recent progress and current problems. Eur J Clin Microbiol Infect Dis 1988; 7: 460-75

9. Senior DS, Shaw JTB. In vitro effects of fluconazole (UK-49.858) and ketoconazole on mouse lymphocyte proliferation and on Candida blastospore destruction by human polymorp-honuclear lekocytes. Int J Immunopharmacol 1988; 10: 169-73 10. Akkoç T, Soyo¤ul Ü, Çevikbafl A, Johansson C. Flukonazol, amfoterisin B ve interferon α-2a kombinasyonlar›n›n insan po-limorf nüveli lökositlerinin kemotaksisi ve Candida albicans’a karfl› hücre içi ölüm aktivitesinin in vitro araflt›r›lmas› [Özet]. In: A¤açfidan A, Badur S, Külekçi G, eds. XXVII. Türk Mikro-biyoloji Kongresi (7-10 May›s 1996, Antalya) Program ve Özet Kitab›. ‹stanbul: Türk Mikrobiyoloji Cemiyeti & Klinik Mikro-biyoloji ve ‹nfeksiyon Hastal›klar› Derne¤i, 1996: 189 11. Zervos EE, Bass SS, Robson MC, Rosemurgy AS.

Fluconazo-le increases bactericidal activity of neutrophils. J Traum 1996; 41: 10-4

12. Zervos EE, Fink GW, Norman JG, Robson MC, Rosemurgy AS. Fluconazole increases bactericidal activity of neutrophils through non-cytokine-mediated pathway. J Traum 1996; 41: 465-70

13. Johnson EM, Warnock DW, Richardson MD, Douglas CJ. In-vitro effect of itraconazole, ketoconazole and amphotericin B on the phagocytic and Candidacidal function of human

neut-rophils. J Antimicrob Chemother 1986; 18: 83-91

14. Van Rensburg CEJ, Anderson R, Joone G, van der Merwe MF, Eftychis HA. The effects of ketoconazole on cellular and hu-moral immune functions. J Antimicrob Chemother 1983; 11: 49-55

15. Wang JM, Chen GC, Colella S, et al. Chemotactic activity of recombinant human granulocyte colony-stimulating factor. Blood 1988; 72: 1456-60

16. Lindemann A, Hermann F, Oster W, et al. Hematologic effects of recombinant human granulocyte colony-stimulating factor in patients with malignancy. Blood 1989; 74: 2644-51 17. Roilides E, Walsh TJ, Pizzo PA, Rubin M. Granulocyte

colony-stimulating factor enhances the phagocytic and bactericidal ac-tivity of normal and defective human neutrophils. J Infect Dis 1991; 163: 579-83

18. Uchida K, Yamamato Y, Klein TW, Freidman H, Yamaguchi H. Granulocyte colony-stimulating factor facilitates the restorati-on of resistance to opportunistic fungi in leukopenic mice. J Med Vet Mycol 1992; 30: 293-300

19. Yamamato Y, Uchida K, Klein TW, Friedman H, Yamaguchi H. Immunomodulators and fungal infections: use of antifungal drugs in combination with G-CSF. In: Friedman H, et al. eds. Microbial Infections. New York: Plenum Press, 1992: 231-41 20. Verbrugh HA, Peters R, Peterson KK. Phagocytosis and killing

of staphylococci by human polymorphonuclear and mononuc-lear leucocytes. J Clin Pathol 1978; 31: 539-45

21. Roilides E, Walsh TJ, Pizzo PA, Rubin M. Granulocyte colony-stimulating factor enhances the phagocytic and bactericidal ac-tivity of normal and defective human neutrophils. J Infect Dis 1991; 163: 579-83

22. Lehrer RI, Stiehm RS, Fischer TJ, Lowell SY. Severe Candidal Infections, clinical perspectives, immune defence mechanism, and current concepts of therapy. Ann Intern Med 1978; 89: 91-106

23. Vechiarelli A, Monari C, Baldelli F, et al. Beneficial effect of recombinant human granulocyte colony-stimulating factor on fungicidal activity of polymorphonuclear leukocytes from pati-ents with AIDS. J Infect Dis 1995; 171: 1448-54

24. Bober LA, Grace MJ, Catherine Pugliese-Sivo, et al. The effect of GM-CSF and G-CSF on human neutrophil function. Immu-nopharmacology 1995; 29: 111-19

25. Gasson JC, Golde DW, Weisbart RH. Colony-stimulating fac-tors and host defence. Ann Intern Med 1989; 110: 297-303 26. Pascual A, Garcia I, Conejo C, Perea EJ. Uptake and

intracel-lular activity of fluconazole in human polymorphonuclear le-ukocytes. Antimicrob Agent Chemother 1993; 37: 187-90 27. Abruzzo GK, Fromtling RA, Turnbull TA, Giltinan DM.

Ef-fects of bifonazole, fluconazole, itraconazole, and terbinafine on the chemiluminescence response of immune cells. J Anti-microb Chemother 1987; 20: 61-8

28. Garcha UK, Brummer E, Stevens DA. Synergy of fluconazole with human monocytes or monocyte-derived macrophages for killing of Candida species. J Infect Dis 1995; 172: 1620-23 29. Nassar F, Brummer E, Stevens DA. Macrophage

colony-stimu-lating factor (M-CSF) induction of enhanced anticryptococcal activity in human monocyte-derived macrophages: Synergy with fluconazole for killing. Cell Immunol 1995; 164: 113-8. 30. Polak A. Protective effect of human granulocyte

colony-stimu-lating factor (hG-CSF) on candida infections in normal and immunosuppressed mice. Mycoses 1991; 34: 109-18 31. Abruzzo GK, Giltinan DM, Capizzi TP, Fromtling RA.

Influen-ce of six antifungal agents on the chemiluminesInfluen-cenInfluen-ce response of mouse spleen cells. Antimicrob Agent Chemother 1986; 29: 602-7

32. Cockayne A, Odds FC. Interactions of Candida albicans yeast cells, germ tubes and hyphae with human polymorphonuclear leucocytes in vitro. J Gen Microbiol 1984; 130: 465-71

Referanslar

Benzer Belgeler

[r]

Yukar¬daki 1,2 ve 3 nolu problemlerde verilen kodlar için tam olmayan asgari uzakl¬k kod çözmeyi göz önüne alarak birer sendrom tablosu

Buna göre C’nin bir üreteç ve e¸ slik denetim matrisini

Ve makseme geldik- te Tophane meydanında adimil-misil hoş tarh sekiz musluk- lu çeşmeyi padişahı enam Sultan Mahmud han bina ve tekmil ve Azab kapısına valde sultanın bina

&#34;Fark Yaratan Koçlar&#34; projes sayes nde 200’den fazla profesyonel koçun koçluk saatler n arttırmaları ve koçluk hakkında çer k üretmeler sağlamıştır.. Çeş

Not: En üst sat›rdaki bir lamban›n üstü, bir sonraki sütunun en alt sat›r›ndaki lambay›; en sa¤ sütundaki bir lamban›n sa¤›, bir sonraki sa- t›r›n en

Lev Troçki - Yalnızca Burjuvazi İçin Parlayacaksa Güneşi de Söndürürüz.. O sosyalist bir devrimi savundu ve daha ileriye gitmek için Marksizm’in ortodoks yorumlarına karşı

Fakat Türk kültürde İncil sözcüğü daha geniş bir anlamı da içeriyor: İncil sözcüğü Yunanca Kutsal Yazılara ait olan 27 kitapların tümü için kullanılmaktadır..