In this study, we have aimed the determination of susceptibility of sea bass (Dicentrarchus labrax) and sea bream (Sparus aurata) which they have been cultured in Turkey to viral haemorrhagic septicemia virus. For this purpose, an infection trial has been conducted on a number of 360 sea bass and sea bream with using TB13/H15 and SW13/G
-5 -1 -5
isolates. The dose of infection applied as 10 TCID ml for infection via immersion and 10 TCID /fish for 50 50 intraperitoneal infection. As a result of the infection trial, the average mortality rate for sea bream and sea bass has been found as 13,3 % and 5 % in the intraperitoneal infections. At the end of the study, virus was not isolated from dead or alive fish which infected by immersion. In conclusion, it has been founded that viral haemorrhagic septicemia virus (Genotype 1e strains) has low pathogenicity on the sea bass and sea bream.
Keywords: viral hemorrhagic septicemia virus; pathogenicity; infection trial; sea bass, Dicentrarchus labrax; sea Abstract
* Sorumlu yazar: Tel:+90 5416102995Faks:+90 3462191812 e-posta: hisidan@cumhuriyet.edu.tr
Geliþ Tarihi: 22.11.2013 Kabul Tarihi: 08.01.2014
Bu çalýþmada, Türkiye'de kültürü yapýlan çipura ve levrek balýklarýnýn ülkemizden izole edilen, viral hemorajik septisemi virüs genotip 1e suþlarýna karþý duyarlýlýklarýnýn belirlenmesi amaçlandý. Bu amaçla TB13/H15 ve SW13/G izolatlarý ile 360'ar adet çipura (Sparus aurata) ve Levrek (Dicentrarchus labrax) üzerinde enfeksiyon denemesi
-5 -5 -1
gerçekleþtirildi. Enfeksiyon dozu intraperitoneal 10 DKID /balýk ve daldýrma 10 DKID ml olarak uygulandý. 50 50 Yapýlan enfeksiyon denemesinin sonunda çipuralarda en yüksek mortalite oraný % 13,33 bulunurken levrek balýklarýnda % 5 olarak bulundu. Ölen ve hayatta kalan balýklardan hücre kültüründe yapýlan ekimler sonunda, daldýrma yoluyla virüs verilen balýklarýn hiçbirisinden yeniden virüs izolasyonu yapýlamadý. Sonuç olarak yapýlan çalýþma ile viral hemorajik septisemi virüsün çipura ve levrek balýklarýnda düþük patojeniteye sahip olduðu ortaya konuldu.
Anahtar Kelimeler: Viral Hemorajik Septisemi Virüs; patojenite; enfeksiyon denemesi; çipura, Dicentrarchus labrax; Özet
Giriþ
© Su Ürünleri Merkez Arastýrma Enstitüsü Müdürlügü, Trabzon
Viral Hemorajik Septisemi Virüs Genotip 1e Suþlarýnýn Çipura (Sparus Aurata)
ve Levrek (Dicentrarchus Labrax) Balýklarý Üzerinde
Patojenitelerinin Belirlenmesi
1 2
Hakan IÞIDAN *, Ýlyas KUTLU
Viral hemorajik Septisemi, gökkuþaðý olivaceus) ve kalkan (Scophthalmus maximus)
alabalýðý (Oncorhynchus mykiss), kahverengi balýklarýnýn da içinde bulunduðu pek çok türün alabalýk (Salmo trutta), grayling (Thymallus enfeksiyöz viral bir hastalýðýdýr ve viral
thymallus), whitefish (Coregonus sp.), pike hemorajik septisemi virüs (VHSV) tarafýndan (Esox lucius), largemouth bass (Micropteus oluþturulur (Winton vd., 1989; Mortensen vd.,
salmoides), Japanese flounder (Paralichthys 1999; Schlotfeldt vd., 1991).
1
Cumhuriyet Üniversitesi, Veteriner Fakültesi, Viroloji Anabilim Dalý,58140, Sivas, Türkiye
2
Su Ürünleri Merkez Araþtýrma Enstitüsü, 61250, Yomra, Trabzon, Türkiye
Araþtýrma Makalesi Research Article
Viral hemorajik septisemi virüsü 1988 Araþtýrma Enstitüsü yetiþtirme ünitesinden
yýlýna kadar yalnýzca tatlý su balýk türlerini en- alýnan kalkan balýklarýndan izole edilen
TR-fekte eden bir etken olarak bilinmekteydi. WS13G ve TR-B13/15H (GeneBank kayýt
Kuzey Amerika'da 1988 yýlýnda chinook ve numaralarý; AB231160, AB231161)
izolat-coho salmon balýklarýndan, daha sonradan larýdýr.
Kuzey Amerika'da en az 18 farklý balýk
türünden de izole edilmiþtir (Winton vd., 1989). Enfeksiyon Denemeleri Ýçin Virüslerin
Denizden 1980'li yýllarda ilk VHSV izolas- Hazýrlanmasý
yonunun ardýndan Kuzey Amerika, Asya ve Enfeksiyon denemesinde kullanýlacak
Avrupa'dan en az 48 farklý türden daha VHSV virüslerin titrasyonu için bir gün önce 96
belirlenmiþtir. Yalnýzca Kuzey Avrupa'dan kuyucuklu pleytte hazýrlanmýþ BF-2 hücreleri
ringa, çaça balýðý, morina, Norveç yayýn balýðý kullanýldý. Bu amaçla her virüsün daha önceden
-ve yassý balýklarý da içine alan 15 türden VHSV 80°C'de saklanan viallerinden birisi açýlarak
izole edilmiþtir (Hedrick vd., 2003; Mortensen vortekslenip 100 µl alýndý. Alýnan virüsün (%1
vd., 1999; Takano vd., 2000). Ýzolasyonlarýn HEPES ilaveli MEM Earle vasatý) kullanýlmak
-1 -10
çoðu Baltýk Denizi, Kattegat, Skagerrak, Kuzey suretiyle 10 'den 10 'a kadar 10 tabanlý seri
Denizi ve Ýskoçya civarýndaki sulardan sulandýrmalarý hazýrlandý.
gerçekleþtirilmiþtir (Skall vd., 2005a). Hazýrlanan virüs sulandýrmalarýnýn her
Ülkemizde ilk izolasyon 2004 yýlýnda, sulandýrmasý dört göze olacak þekilde 96
Trabzon Su Ürünleri Merkez Araþtýrma Ens- kuyucuklu hücre pleytine 100 µl ilave edildi.
titüsünde kültür çalýþmalarý yapýlan kalkan Virüs ekimi gerçekleþtirilen hücreler 15°C'deki
balýklarýndan alýnan örneklerden yapýlmýþtýr inkübatörde inkübasyona býrakýlarak sitopatik
(Nishizawa vd., 2006; Kalaycý vd., 2007). etki (CPE) yönünden günlük kontrolleri yapýldý.
CPE gözlendikten sonra sonuçlar kaydedilerek
Gereç ve Yöntem Spermann-Köerber metoduyla DKID50 (doku
Balýklar kültürü enfektif doz 50) hesaplandý. Enjeksiyon
Enfeksiyon denemelerinde kullanýlacak yoluyla yapýlan enfeksiyon denemesinde her
-5
olan çipura “Sparus aurata” ve levrek balýða 10 DKID , immersiyon yoluyla yapýlan 50
-5
“Dicentrarchus labrax” balýklarý Ýzmir'de uygulamada ise havuzdaki suyun her ml'sine 10
akuakültür yapan bir iþletmeden (Kýlýç Deniz DKID olacak þekilde enfeksiyonlar gerçek-50
Ürünleri A.Þ.) temin edilmiþtir. Deneyde leþtirildi.
kullanýlacak çipuralar, 4-6 cm boy (~ 5,2 cm) ve
3-4 g (~3,4 g) aðýrlýða eriþmiþ olup her tanka 60 Deneme Tanklarýnýn Hazýrlanmasý ve Deney
adet olacak þekilde daðýtýldý. Levrekler ise 5-7 Tasarýmý
cm boy (~ 5,9 cm) ve 3-4 g (~3,6 g) aðýrlýða eriþ- Deneysel enfeksiyonlarýn
gerçekleþ-miþ olup her tanka 60 adet olacak þekilde tirebileceði 24 adet 50 lt'lik deneme tanký
daðýtýldý. Enfeksiyon denemesi öncesinde hazýrlandý. Her tanka 30'ar adet olmak üzere
balýklar 2 haftalýk adaptasyona tabi tutuldu. toplam 360 adet çipura ve bir o kadar da levrek
konularak balýklar adaptasyon süresi boyunca
Virüsler gözlendi. Enfeksiyon denemesi toplamda 2 tür, 2
Çalýþmada kullanýlan virüslerden biri tekrar, 2 suþ, 2 uygulama þekli ve kontrolleri ile
2005 yýlýnda Trabzon ili açýklarýndan yakalanan birlikte þekil 1 de þematize edildiði þekilde
Virolojik Muayene örnekler yeniden 24 kuyucuklu pleytte
Enfeksiyon denemesi süresince ölen hazýrlanan hücre hattýna 100 µl inokule edilerek
balýklar ile denemenin sonlandýrýlmasýnýn subkültürü yapýldý. Bir hafta daha 15°C'de
ardýndan sað kalan balýklardan alýnan kalp ve ön inkübasyona býrakýldý. Subkültür iþleminin
böbrek örneklerinden hücre kültüründe virüsün ardýndan CPE göstermeyen örnekler negatif
yeniden izolasyonu çalýþýldý. Bu amaçla doku olarak deðerlendirildi ve muayene sonuç
homojenatlarý hazýrlanarak, hazýrlanan doku formuna kaydedildi.
homojenatý 1/10 oranýnda hücre üretme vasatý
ile sulandýrýlýp 0,45µm enjektör filtreden Bulgular ve Tartýþma
(Sartorius AG, Goettingen, Almanya) geçirildi. Viral hemorajik septisemi virüsü Türkiye
Daha sonra 100 µl süzüntü daha önceden suþlarý kullanýlarak çipura ve levrek balýklarýnda
hazýrlanmýþ olan ve % 2 FBS ilaveli MEM enfeksiyon denemeleri gerçekleþtirildi.
vasatýnda çoðaltýlan, % 80 monolayer olmuþ 24 Çipuralar üzerinde SW13/G izolatý ile
kuyucuklu pleytteki (Grainer-Bio-one GmbH, yapýlan deneme enfeksiyonu çalýþmasýnda
Frickenhausen, Almanya) BF-2 ve/veya RTG-2 intraperitoneal enjeksiyon yoluyla yapýlan
hücrelerine ekildi. Ekimde her örnek için iki denemede toplam 8 balýk daldýrma yoluyla
kuyucuk kullanýldý. yapýlan denemede ise 2 balýk öldü. Buna göre
Hücreler CPE gözleninceye kadar kümülatif mortalite intraperitoneal enjeksiyon
15°C'de 2 hafta boyunca inkübatörde (MIR- grubunda % 13,33 ve daldýrma grubunda % 3,33
153, Sanyo, Japonya) inkübe edildi ve her iki olarak gerçekleþti. Diðer taraftan TB13/H15
günde bir CPE varlýðý yönünden invert izolatýyla yapýlan denemede ise intraperitoneal
mikroskop (CK30, Olympus Opt. Co., Japonya) enjeksiyon grubunda hiç ölüm olmazken
kullanýlarak kontrol edildi. Ýki haftalýk daldýrma grubunda 1 balýk öldü (% 1,66
inkübasyon sonunda CPE gözlenmeyen kümülatif mortalite).
Levrekler üzerinde SW13/G izolatý ile mýþtýr (Skall vd., 2005b). Daha önceki
yapýlan deneme enfeksiyonu çalýþmasýnda çalýþmalar viral hemorajik septisemi virüsünün
intraperitoneal enjeksiyon yoluyla yapýlan farklý genotiplerinin balýk türleri arasýnda
denemede toplam 2 balýk ölürken daldýrma duyarlýlýk bakýmýndan farklýlýklar olduðunu
yoluyla yapýlan denemede hiç ölüm gözlen- ortaya koymuþtur (Snow vd., 2004). Diðer
medi. Buna göre SW13/G izolatý kullanýlarak taraftan henüz çipura ve levrek balýklarýndan
intraperitoneal enjeksiyon yoluyla yapýlan virüs izolayonu gerçekleþtirilmemiþtir. Bununla
denemede kümülatif mortalite % 3,33 olarak birlikte levrek balýklarýnýn viral hemorajik
gerçekleþti. Diðer taraftan TB13/H15 izolatýyla septisemi virüsü ile oluþturulan deneysel
yapýlan denemede ise intraperitoneal enjek- enfeksiyona duyarlýlýðý gösterilmiþtir (Castric
siyon grubunda 3. daldýrma grubunda ise 1 balýk ve de Kinkelin, 1999). Çipura balýklarý ile ise
öldü. Buna göre kümülatif mortalite intra- yapýlmýþ bir enfeksiyon denemesi literatürde yer
peritoneal enjeksiyon grubunda % 5 ve almamakla birlikte benzer türlerden olan red sea
daldýrma % 1,66 olarak gerçekleþti. Diðer bream ve black sea bream balýklarýnýn deneysel
taraftan yapýlan denemelerde kontrol grup- olarak oluþturulan enfeksiyona duyarlý olduklarý
larýndaki balýklarýn tamamý deney sonuna kadar ortaya konulmuþtur (Isshiki vd., 2003; Ito vd.,
canlý kaldý. Tüm deneme guruplarýna iliþkin 2004). Yapýlan bu çalýþma, çipura ve levrek
günlük kümülatif mortalite oranlarý þekil 2'de balýklarýnýn viral hemorajik septisemi virüsü
gösterilmiþtir. genotip 1e suþlarý ile gerçekleþtirilen enfeksiyon
Çeþitli balýk türlerinin viral hemorajik denemesine az da olsa duyarlýlýk gösterdiklerini
septisemi virüsüne duyarlýlýðý çokça çalýþýl- ortaya koymaktadýr.
ªekil 2. Çipura ve levrek balýklarýnda TB13/H15 ve SW13/G izolatlarý ile yapýlan enfeksiyon denemesinin kümülatif mortalite oranlarý.
Kaynaklar Iwamoto, H. ve Yoshimizu, M. 2006. Genotyping and Pathogenicity of Viral Hemorrhagic Castric, J. ve de Kinkelin, P. 1984. Experimental study of Septicemia Virus from Free-Living Turbot the susceptibility of two marine fish species, sea (Psetta maxima) in a Turkish Coastal Area of the bass (Dicentrarchus labrax) and turbot Black Sea. Applied and Environmental (Scophthalmus maximus), to viral haemorrhagic Microbiology, 72: 2373-2378.
septicaemia. Aquaculture, 41: 203–212. Schlotfeldt, H. J., Ahne, W., Vestergård-Jørgensen, P. E. Hedrick, R. P., Batts, W. N., Yun, S., Traxler, G.S., ve Glende, W. 1991. Occurrence of viral Kaufman, J. ve Winton, J. R. 2003. Host and h a e m o r r h a g i c s e p t i c a e m i a i n t u r b o t geographic range extensions of the North (Scophthalmus maximus): a natural outbreak. American strain of viral hemorrhagic septicemia Bulletin of the European Association of Fish virus. Diseases of Aquatic Organisms, 55: Pathologists, 11: 105–107.
211–220. Skall, H. F., Olesen, N. J. ve Mellergaard, S. 2005a. Isshiki, T., Nagano, T. ve Miyazaki, T. 2003. Prevalence of viral haemorrhagic septicaemia Susceptibility of various marine fish species to virus in Danish marine fishes and its occurrence in viral hemorrhagic septicemia virus isolated from new host species. Diseases of Aquatic Organisms, Japanese flounder. Fish Pathology, 38: 113–115 66: 145-151.
Ito, T., Mori, K. I., Arimoto, M. ve Nakajima, K. 2004. Skall, H. F., Olesen, N. J. ve Mellergaard, S. 2005b. Viral Virulence of viral hemorrhagic septicemia virus haemorrhagic septicaemia virus in marine fish (VHSV) isolates from Japanese flounder and its implications for fish farming-a review. Paralichthys olivaceus in rainbow trout and Journal of Fish Diseases, 28, 509-529.
several species of marine fish. Fish Pathology, Snow, M., Bain, N., Black, J., Taupin, V., Cunningham, 39: 103–104. CO., King, J. A., Skall, H. F. ve Raynard, R. S. Kalayci, G., Incoglu, S. ve Ozkan, B. 2006. First 2004. Genetic population structure of marine viral isolation of Viral haemorrhagic septicaemia haemorrhagic septicaemia virus (VHSV). (VHS) virüs from turbot (Scophthalmus Diseases of Aquatic Organisms, 61: 11–21. maximus) cultured in the Trabzon coastal area of Takano, R., Nishizawa, T., Arimoto, M. ve Muroga, K. the Black Sea in Turkey. Bulletin of the European 2000. Isolation of viral haemorrhagic septicaemia Association of Fish Pathologists, 26: 157-161. virus (VHSV) from wild Japanese flounder, Mortensen, H. F., Heuer, O. E., Lorenzen, N., Otte, L. ve Paralichthys olivaceus. Bulletin of the European
Olesen, N. J. 1999. Isolation of viral Association of Fish Pathologists, 20: 186–192. haemorrhagic septicaemia virus (VHSV) from
wild marine fish species in the Baltic Sea, Kattegat, Skagerrak and the North Sea. Virus Research, 63: 95–106.
Nishizawa, T., Savaþ, H.¸ Iþýdan, H., Üstündað, C.,
Winton, J. R., Batts, W. N., Nishizawa, T. ve Stehr, C. M. 1989. Characterization of the first North American isolates of viral hemorrhagic septi-cemia virus. Newsletter of American Fisheries Society, Fish Health Section, 17: 23.
