T.C.
GAZĠOSMANPAġA ÜNĠVERSĠTESĠ
Bilimsel AraĢtırma Projeleri Komisyonu
Sonuç Raporu
Proje No:2009/40
TÜRKĠYE DOĞAL FLORASINDA YETĠġEN
Papaver CĠNSĠ Oxytona SEKSĠYONUNA AĠT GEN HAVUZUNUN
SRAP TEKNĠĞĠ ĠLE GENETĠK KARAKTERĠZASYONU
Proje Yöneticisi
Yrd. Doç. Dr. Ġskender PARMAKSIZ
Birimi
GaziosmanpaĢa Üniversitesi Fen-Edebiyat Fakültesi
Biyoloji Anabilim Dalı
AraĢtırmacılar ve Birimleri Elif KAYMAK GaziosmanpaĢa Üniversitesi
Fen-Edebiyat Fakültesi Biyoloji Anabilim Dalı
ÖZET (*)
TÜRKĠYE DOĞAL FLORASINDA YETĠġEN
Papaver CĠNSĠ Oxytona SEKSĠYONUNA AĠT
GEN HAVUZUNUN SRAP TEKNĠĞĠ ĠLE GENETĠK KARAKTERĠZASYONU
Elif KAYMAK
GaziosmanpaĢa Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü
Biyoloji Anabilim Dalı
DanıĢman: Yrd. Doç. Dr. Ġskender Parmaksız
Oxytona seksiyonu içerisinde yer alan Papaver bracteatum (2n=14), P. pseudo-orientale
(2n=42) ve P. orientale (2n=28) türleri ülkemiz doğal florasında bulunmaktadır.
Papaveracea familyasında yer alan Papaver cinsi morfin, kodein, tebain, oripavin gibi zengin
alkaloit içeriklerine sahiptir. Alkoloit içeriklerinin, ilaç sanayinin hammadde sorununa katkı
olması ve uyuĢturucu madde olarak kullanılması sebebiyle önemi yüksek bir familyadır. Her ne kadar bu üç türün morfolojik ve biyokimyasal özellikleri belirlense de bu özellikler
intersipesifik hibridizasyon ve çevresel faktörlerden etkilendiğinden dolayı birbirlerinden ayrılması oldukça güçtür ve karıĢıklıklar yaĢanmaktadır. Bu karıĢıklığın giderilmesinde moleküler metotlardan yararlanılmaktadır. Genetik varyasyonun araĢtırılmasında moleküler markörlerden yaygın olarak kullanılan SRAP tekniği kullanılmıĢtır. Farklı bölgelerden toplanan 40 bitki örneği 10 adet SRAP primeri kullanılarak analiz edilmiĢtir. Shanon indeksi 0,55, Nei indeksi 0,38, polimofizm oranı 89,66 „dır. 29 okunan banttan ise 26‟sının polimorfik olduğu bulunmuĢtur. 3 nolu SRAP primeri en fazla sayılabilir bant veren primer olmuĢtur. Ortalama genetik mesafe 0,46 olarak bulunmuĢtur. En yakın mesafe 0,109 olarak 1 nolu ve 2 nolu populasyonlar arasında bulunmuĢtur. En uzak genetik mesafe ise 1,00 olarak 14 nolu ve 18 nolu populasyonlar arasında bulunmuĢtur.
2010, 31 sayfa
Anahtar Sözcükler: SRAP, Moleküler markörler , Papaver, Oxytona, P. bracteatum,
P. orientale, P. pseudo-orientale
(*) Bu çalıĢma GaziosmanpaĢa Üniversitesi Bilimsel AraĢtırma Projeleri Komisyonu tarafından desteklenmiĢtir. (Proje No: ……..)
ABSTRACT
GENETIC CHARACTERIZATION OF GENE POOL OF Papaver GENUS Oxytona SECTION GROWN in WILD FLORA OF TURKEY BY SRAP TECHNIC
Elif KAYMAK GaziosmanpaĢa University
Graduate School of Natural and Applied Sciences Deparment of Biology
Supervisor: Asst. Prof. Dr. Ġskender Parmaksız
P. bracteatum (2n=14), P. pseudo-orientale (2n=42) and P. orientale (2n=28) species
of Oxytona section in Papaver genus are found widely in native flora of Turkey. Genus
Papaver from Papaveracea family has rich alkoloids such as morphine, codeine, tebaine,
oripavine. Papaveracea family is highly important due to its contribution to pharmaceutical industry and usage for narcotic analgesic. Although the morphologic and biochemical traits of 3 species have been determined, because these traits are effected from interspesific hybridizations and environmental conditions, the identification of the plant populations of Oxytona section is very difficult and causes confusion. Molecular methods are used to eliminate this confusion.In our study, SRAP technic that is widely used in the investigation of molecular markers was employed to research genetic variation. Forty plant species collected from different regions were investigated using 10 SRAP primers. Shannon index was found to be 0,55, Nei index 0,38, rate of polymorphism is 89,66. 26 bands were polymorphic from 29 scorable amplification bands. The highest number of scorable bands were generated by SRAP 3 primer. Average genetic distance was found to be 0,46 The nearest genetic distance between population 1 and population 2 was 0,109. The farthest genetic distance between population 14 and population 18 was 1,00.
2010, 31 pages
Key words : SRAP, Molecular markers , Papaver, Oxytona, P. bracteatum, P. orientale, P.
pseudo-orientale
ĠÇĠNDEKĠLER DĠZĠNĠ
Sayfa
ÖZET ABSTRACT ii ÖNSÖZ iii ĠÇĠNDEKĠLER DĠZĠNĠ iv SĠMGE ve KISALTMALAR DĠZĠNĠ vi ġEKĠLLER DĠZĠNĠ viii ÇĠZELGELER DĠZĠNĠ ix 1. GĠRĠġ 1 2. KAYNAK ÖZETLERĠ 3
2.1. Papaveraceae Familyasının Genel Özellikleri 3
2.2. Oxytona seksiyonun Genel Özellikleri 3
2.3. Morfolojik Markörler 5
2.4. Biyokimyasal Markörler (Enzim veya Protein Markörleri) 6
2.5. DNA Markörleri 7
2.5.1. Hibridizasyona Dayalı DNA Markörleri (RFLP= Restriction Fragment Length Polymorphism = KesilmiĢ Parçaların Uzunluk
Polimorfizmi ) 8
2.5.2. RAPD (Randomly Amplified Polymorfic DNA = Rastgele ArtırılmıĢ Polimofik DNA)
8
2.5.3. SCAR Markörleri (Sequence Characterized Amplified Region Markers=BelirlenmiĢ Ve ÇoğaltılmıĢ Polimorfik Diziler)
9
2.5.4. SSR (Simple Sequence Repeats= Basit Dizi Tekrarları) 9
2.5.5. ISSR (Inter Simple Sequence Repeats =Basit Ġç Dizi Tekrarları)
10
2.5.6. AFLP(Aplified Fragment Length Polymorphism = ÇoğaltılmıĢ Parça
Uzunluğu Polimorfizmi) 10
2.5.7. SRAP Markörler (Sequence-related amplified polymorphism= Sekans
ĠliĢkili Polimorfizm) 10
3.1. Materyal 18
3.2.Yöntem 18
3.2.1. Bitki Örneklerinin Laboratuar ÇalıĢmaları Ġçin Hazırlanması 18
3.2.2. DNA Ġzolasyonu 18
3.2.3. PCR Uygulaması 19
3.2.4. ÇalıĢmada Kullanılan SRAP Primerleri 21
3.2.5. Elektroforez ĠĢlemi 21
3.2.6. DNA Bantlarının Görüntülenmesi 21
3.2.7. DNA Bantlarının Değerlendirilmesi 22
4. BULGULAR 23 5. TARTIġMA VE SONUÇ 25 5.1. Sonuç 27 KAYNAKLAR 28 ÖZGEÇMĠġ 31 SĠMGE ve KISALTMALAR DĠZĠNĠ Simgeler Açıklama
bp Base pair (baz çifti =bç)
cM Sentimorgan
kb kilo base
mM milimolar
ng nanogram
rpm revolutions per minute (dakikadaki devir)
μg mikrogram
μl mikrolitre
μM mikromolar
UV Ultraviole
Kısaltmalar
AFLP Amplified Fragment LengthPolymorphism(ÇoğaltılmıĢ Fragmentlerin Uzunluk Polimorfizmi)
cDNA Komplementer deoksiribonukleik asid dNTP deoksiribonükleosidtrifosfat
DNA deoksiribonükleik asid EDTA Ethilendiamintetraasetik asid
ISSR Inter Simple Sequence Repeats(Basit Ġç Dizi Tekrarları) MEGA Molecular Evolutionary Genetics Analysis (Moleküler Evrim
Genetik Analizi)
MAS Marker Assisted Selection (Marker Yardımlı Seçim) ORF Open Reading Frame (Açık Okuma Çerçevesi)
PCR Polymerase Chain Reaction (Polimeraz Zincir Reaksiyonu) PAGE Polyacrilamide Gel Electrophoresis (Poliakrilamid Jel
Elektroforezi)
POPGENE Population Genetic Analysis (Populasyon Genetik Analizi ) RAPD Randomly Amplified Polymorfic DNA (Rastgele ÇoğaltılmıĢ
Polimorfik DNA)
RFLP Restriction Fragment Length Polymorphism (KesilmiĢ Parçaların Uzunluk Polimorfizmi)
RNA Ribonukleik Asid
SCAR
Sequence Characterized Amplified Region Marker( BelirlenmiĢ ve ÇogaltılmıĢ Polimorfik Diziler)
SRAP Sequence Related Amplified Polymorphism (Sekans ĠliĢkili Polimorfizm)
SSR Simple Sequence Repeat (Basit Dizi Tekrarı)
UPGMA Unweighted-Pair Group Method Arithmetic Average(Aritmetik Ortalamaları Kullanılan Ağırlıklı Olmayan Çift Grup Yöntemi) Taq Thermus aquaticus
TBE Tris/borat/EDTA (Buffer=Tampon) TE Tris/EDTA (Buffer=Tampon)
Tris Tris(hidroksimetil) aminometan
ġEKĠLLER DĠZĠNĠ
ġekil Sayfa
ġekil 4.1. SRAP 1 Nolu Primerin %1‟lik Agaroz Jel Görüntüsü 23 ġekil 4.2. SRAP 3 Nolu Primerin %1‟lik Agaroz Jel Görüntüsü 23 ġekil 4.3. SRAP primerlerinin oluĢturduğu, bitkiler arasında filogenetik
ÇĠZELGELER DĠZĠNĠ
Çizelge Sayfa
Çizelge 3.1. PCR mix bileĢenlerinin konsantrasyonları ve miktarları 20
Çizelge 3.2. PCR protokolü 20
Çizelge 3.3. Kullanılan primerlerin isimleri ve baz dizileri 21 Çizelge 4.1. Kromozom sayısı, önemli morfolojik özellikler ve tebain içerikleri
17
1.GĠRĠġ
Günümüzde bitki türlerinin tanımlanmasında ve genetik varyasyonun araĢtırılmasında moleküler markörler yaygın olarak kullanılmaktadır. GeliĢen moleküler markör teknolojisi ile gen kaynaklarının karakterize edilmesi, çeĢitlerin birbirleri arasındaki genetik farklılığın belirlenmesi, kromozom haritalamaları ve evrimsel geliĢim analizlerinde yeni yöntemler ortaya çıkmıĢtır. Morfolojik ve biyokimyasal markörlerin uygulamadaki yetersizlikleri moleküler markörlerin uygulanmasıyla ortadan kalkmıĢtır. Moleküler teknikler, diğer tekniklere göre daha fazla avantajlara sahip olup, çevre faktörlerinden etkilenmezler ve polimorfizm oranları yüksektir.
PCR ile spesifik DNA parçacıkları çoğaltılarak DNA polimorfızmi belirlenebilmektedir. Protein veya DNA markörlerine dayanan haritalar "moleküler haritalar" olarak bilinmektedir. Günümüzde birçok bitkide genetik uzaklık, moleküler, kimyasal ve morfolojik özellikler kullanılarak belirlenebilmektedir. Canlılar arasındaki genetik çeĢitliliğin daha iyi anlaĢılabilmesi için, bu yöntemlerin tamamına ihtiyaç duyulmaktadır. DNA dizinindeki polimorfizmin belirlenebilmesi için yaygın olarak kullanılan; RFLP, AFLP, SSR, ISSR, SRAP ve RAPD gibi moleküler markör teknikleri geliĢtirilmiĢtir.
SRAP, bitkilerde genetik farklılık çalıĢmaları için son dönemlerde geliĢtirilmiĢ bir moleküler markör sistemidir ( Li ve Quiros, 2001). Ġki primer amplifikasyonunu temel alan ve açık okuma çerçevelerini çoğaltmayı amaçlayan bir markör tekniğidir. Taksonomik analizlerde, genetik varyasyonun araĢtırılmasında, moleküler harita yapımında ve filogenetik akrabalık analizlerinde ayrım gücü yüksek olan SRAP tekniği sıklıkla tercih edilen bir teknik olmuĢtur. Marul, pirinç, çin lahanası, elma, limon, sap kerevizi, kavun, patlıcan, kenevir SRAP primerleri kullanılarak analiz edilen bitki türlerinden bazılarıdır.
Bu tez çalıĢmasının amacı ülkemiz doğal florasındaki değiĢik bölgelere ait Papaver cinsi
Oxytona seksiyonu içerisinde yer alan 3 türe ait toplam 40 adet bitki üzerinde SRAP
(Sequence Related Amplified Polymorphism) yöntemiyle genetik karakterizasyon araĢtırması yapmaktır. ÇalıĢmamızın sonunda elde edilecek verilerin; Oxytona seksiyonu ile ilgili yapılacak olan moleküler alanda ve diğer alanlardaki çalıĢmalara yardımcı olacağına inanmaktayız.
2. KAYNAK ÖZETLERĠ
2.1. Papaveraceae Familyasının Genel Özellikleri
Papaveraceae familyasına ait türler genellikle Kuzey Yarımkürenin ılıman ve subtropik bölgelerinde yayılıĢ göstermektedir. Bu familyada 28 cins ve yaklaĢık 250 tür vardır. Ülkemizde bu familyaya ait 5 cins bulunmaktadır (Seçmen ve ark., 1995).
2.2. Oxytona Seksiyonun Genel Özellikleri (Syn: Macrantha)
Oxytona Bernh., Linnaea 8:843. 1833. Macrantha Elk. Tant. Monog, Papaver 13.1839.
Oxytona seksiyonu Papaver cinsine ait olup, çok yıllık türleri içermektedir. Yayılım olarak
bulunmaktadır. Bu familyaya ait monograflar Fedde (1909) ve Medwedev (1918) ile baĢlamıĢ en son Goldblatt (1974) tarafından yapılmıĢtır.
Papaver bracteatum Lindl., Coll. Bot., t. 23 (1821)
Syn : P. lasiothrix Fedde.
P. bracteatum 1818‟de Avrupa‟ya Fischer tarafından Kraliyet Botanik Bahçesi (Imperial
Botanical Garden)‟ne muhtemelen Kafkaslardan tohum kolleksiyonu ile götürülüp, Batı Avrupa‟ya dağıtılmıĢ ve Lindley tarafından 1821‟de tanıtılmıĢtır.
Oxytona seksiyonunun en büyük bitkisidir. Bir metreye kadar boylanabilir. 15 kadar çiçek
açan gövdesi vardır. Yapraklar 45 cm kadar uzayabilir. Somatik kromozom sayısı 2n = 14‟dür (Goldblatt, 1974).
1700-2500 m arasında açık, yarı kuru yamaçlarda, nadiren gölgeli derelerde, sel yatakları ya da sulama bendlerinin çevresinde çok yoğun Astragalus, Thymus, dikenli bitkiler ve Ferula türleri ile beraber bulunurlar (Cullen, 1965; Golldblatt, 1974).
Erzurum Kop dağı. Bayburt AĢkale arası 2050-2100 m. Kars, Kayseri Erciyes dağı, Sivas, UlaĢ, Erzincan Karadağ 1960 m. Van, Çatak, Ağrı, Büyük Ağrı dağı, Niğde, Pertek 2000 m alanlarında yayılıĢ gösterirler (Cullen, 1965; Golldblatt, 1974).
Papaver orientale L., Sp. Pl. 508 (2753). Ic. Bot. Mag., 2: t. 57 (1794).
Syn: P. paucifoliatum (Trautv) Fedde; P. orientale var. paucifoliatum Trautv.; P. orientale. var. parviflora Busch.
P. orientale 1800 m‟nin genelde üzerinde bulunmasına rağmen bazen altında da Türkiye ve
Ġran‟da bulunabilmektedir. P. bracteatum‟a göre daha nemli ve sulu alanlarda, açık dağ eğimlerinde ve güneĢi az alan kuytularda bulunmaktadır. Somatik kromozom sayısı 2n = 28‟dir (Golldblatt, 1974).
Türkiye‟ de 1800 m‟nin genelde üzerinde bulunmasına rağmen bazan altında da bulunabilmektedir. P. bracteatum‟a göre daha nemli ve sulu alanlarda, açık dağ eğimlerinde ve güneĢi az alan kuytularda bulunmaktadır (Cullen, 1965; Golldblatt, 1974).
Orta ve Doğu Anadolu, Ağrı, Erzurum, Erzincan, Kars, Kayseri, Sivas, Tunceli ve Van çevresinde yayılıĢ gösterirler (Cullen, 1965; Golldblatt, 1974).
Papaver pseudo-orientale (Fedde) Medw.
Syn: P. intermedium DC.; P. bracteatum var. pseudo-orinale Fedde.
Genel olarak Ġran ve Türkiye‟nin nemli yerlerinde bulunmaktadır. Literatürde yaygın olduğu bildirilmektedir. Bu tür arazide kendini belirgin bir Ģekilde göstermektedir. Bitkide diğer iki türe kıyasla değiĢiklik vardır. Bunlar; dik tomurcuk, ince narin yayılmıĢ kaliks tüyleri, koyu kiremit kırmızısı petaller, koyu siyahımsı lekeler ve brakteli çiçeklerdir. 1600–2200 m arasında nemli yerlerde bulunmaktadır. Genel olarak akarsu kenarlarında, tabandan su çeken ıslak zeminlerde ya da bol miktarda yeĢil olan bölgelerde bulunmaktadır. Kuzey Batı Ġran ve Batı Türkiye de bol miktarda bulunmaktadır. Somatik kromozom numarası 2n=42‟dir (Golldblatt, 1974).
1600–2200 m yükseklikte nemli yerlerde, nemli kayalar arasında ya da küçük akarsu kenarlarında rastgele dağılmıĢ ve P. orientale ve P. bracteatum gibi kalabalık Ģeklinde olmayan populasyonlardır (Golldblatt, 1974).
Çoruh, Erzincan, Erzurum, MuĢ, Ağrı, Van, Niğde, Hakkâri çevresinde dağılım göstermektedir (Golldblatt, 1974).
2.3. Morfolojik Markörler
Akar (2002), morfolojik karakterlerin günümüzde de kullanılan çok yararlı bir yöntem olduğunu belirtmiĢtir. Ancak, incelenen özelliklerin çevre koĢullarından etkilenmeleri, her tür için morfolojik varyasyonun yeterli düzeyde olmayıĢı, çalıĢılan karakterlerin bir lokusla
sınırlayıcı oluĢu ve bazı karakterlerin ortaya çıkması için generatif döneme kadar beklenmesi bu yöntemi genetik varyasyonu ortaya koymada çoğu kez baĢarısız kıldığını belirtmektedir. Morfolojik markörlerin yararları:
• Genellikle dominanttırlar. Dominant bir geni resesif genden ayırmada kullanılır. • Sayı bakımından çok azdırlar. Herbir çaprazlamada birkaç tane bulunur.
• Herbir lokusta 2 allel bulunur. • Analizleri çok kolaydır.
• Haritalama populasyonunda yapılacak bir gözlemle kolayca belirlenirler. Morfolojik markörlerin sakıncaları:
• Heterozigotları belirleyemezler • Mutasyonlarla oluĢmuĢ olabilir • Çevresel faktörlerden etkilenirler
• Epistatik veya pleiotropik etkilere maruz kalırlar
2.4. Biyokimyasal Markörler (Enzim veya Protein Markörleri)
Morfolojik karakterlerin çevreden etkilenmelerini ortadan kaldırmak için geliĢtirilen protein markörleri, doğrudan gen ürünleri oldukları için çok önemli üstünlüklere sahiptirler. EĢbaskın (ko-dominant) markör oluĢları ve birim baĢına maliyetlerinin düĢük olması kullanım alanlarını artırmıĢtır. Ancak üzerinde çalıĢılacak lokus sayısının azlığı ve varyasyon oranının düĢük oluĢu bu tekniğin kullanımını sınırlamaktadır(Parmaksız, 2004).
Tanksley (1983)‟ e göre enzim markörleri gen ürünü oldukları için DNA markörlerine göre sayıca azdır, dokulara ve geliĢme dönemlerine göre değiĢkenlik gösterirler ve çevre faktörlerinden etkilenmelerinden dolayı kullanımları sınırlıdır.
Bachmann (1993)‟ a göre enzimler ile DNA markörleri arasındaki farklardan birisi DNA markörlerinin sayıca çok fazla olmasıdır. Teorik olarak DNA markörleri genomun tümünü kaplamaktadır. Bir baĢka deyiĢle, genom üzerinde kodlama yapan, kodlama yapmayan, tek kopya veya DNA dizi tekrarlarının da bulunduğu bölgelerin hepsinde DNA polimorfizmi meydana gelebilir. Oysa enzimi kodlayan lokuslar genom boyunca rastgele dağılım göstermemektedirler. Diğer bir ifadeyle, alloenzim markörleri genel olarak genlerin kodlama
yapan dizilerindeki farklılıklarla ve fonksiyonel enzim gruplarıyla sınırlıdır. Bu nedenle de tüm genomu kaplamazlar.
Biyokimyasal Markörlerinin Avantajları: •Kodominant markörlerdir.
•Analizleri çabuk, ucuz ve güvenilirdir. •Çevreden ve diğer lokuslardan etkilenmezler. Biyokimyasal Markörlerinin Dezavantajları: •Sayıları çok azdır.
•Bazı izoenzimlerin ancak özel dokularda ve belli bir geliĢme peryodunda gözlemlenebilmesidir. Örneğin esteraz ve peroksidazlarda olduğu gibi.
•Çok azda olsa bazen epistatik etki gösterirler. 2.5. DNA Markörleri
Günümüzde bitki türlerinin tanımlanmasında ve genetik varyasyonun araĢtırılmasında moleküler markörler yaygın olarak kullanılmaktadır. Son 20 yıl içerisinde hızla geliĢen moleküler markör teknolojisi, çeĢitlerin birbirleri arasındaki genetik farklılığın belirlenmesi, kromozom haritalamaları, gen kaynaklarının karakterize edilmesi, evrimsel geliĢim analizi ve transformasyonda baĢarı düzeyinin belirlenmesinde yeni yöntemler ortaya koymuĢtur. Bu yöntemler klasik yöntemlere göre büyük avantajlar sağlamaktadır. Morfolojik ve biyokimyasal markörlerin uygulamadaki yetersizlikleri moleküler markörlerin uygulanmasıyla ortadan kalkmıĢtır. Moleküler teknikler, diğer tekniklere göre daha fazla avantajlara sahip olup, çevre faktörlerinden etkilenmezler ve polimorfizm oranları yüksektir. Aynı zamanda pleotropik (bir genin birden fazla fenotipik karakter üzerindeki etkisi) ve epistatik (bir karakterin ortaya çıkmasından sorumlu olan farklı genler arasında baskılayıcı etkilerin olması durumu) etki göstermeyip son derece stabildirler (Beckmann ve Soller, 1986; Tanksley, 1983; Avise, 1994; Bretting ve Widrlechner, 1995).
Moleküler belirteç, DNA‟nın bir parçası diğer bir deyiĢle belirli bir genle beraber kalıtılan bir DNA parçasıdır. Aslında tanımlanan bir gendir ama genomun belirli bir parçasını ifade ettiği için belirteç denmiĢtir. Canlıların yapısını belirleyen Ģifre de DNA zincirlerinde oldugundan
moleküler belirteçler, canlı populasyonundaki çesitlilik veya o populasyon içindeki canlı genotipleri arasındaki iliskilerin tespitinde %100‟e yakın güvenilirlikle değerlendirilirler (Gülsen ve Mutlu 2005).
Moleküler belirteçlerin avantajları; 1. Çevre faktörlerinden etkilenmezler.
2. Genetik degisiklikleri daha fazla yansıttıkları için daha az pleiotrofiktir. 3. Her bir ebeveynden gelen farklı karakterler tespit edilebildigi için bitkilerin genetik orjini tespit edilebilir.
4. Sonsuz sayıda moleküler belirteç elde edilebilir (Kabaoğlu, 2007). 2.5.1. Hibridizasyona Dayalı DNA (RFLP) Markörleri
Bu markörler çeĢitli Ģekillerde etiketlenmiĢ bir DNA parçasının (prob DNA) araĢtırılan bir DNA örneğindeki benzer veya aynı diziliĢteki DNA‟ya melezlenebilmesini baz almaktadır. Bu teknik RFLP analizi ile çok yaygın bir kullanım alanı bulmuĢtur.
RFLP analizi dokulardan izole edilen genomik DNA‟nın nükleik asit diziliĢlerini tanıyan DNA kesim enzimlerince spesifik olarak kesilmesi ve prob DNA nın melezlendiği DNA etrafındaki farklı kesim yapılarının saptanması esasına dayanır. Genomik DNA nın kesimi tipik olarak 4–6 nükleotid tanıyan enzinmlerce yapılır. Kesim sonrasında DNA bir jel destek sistemi içinde elektroforeze tabi tutulduğunda taĢıdığı negatif yüklerden dolayı pozitif yöne doğru hareket edecektir. DNA nın bu hareketi kütlesinin logaritması ile ters orantılıdır. Kesilen parçalar elektroforez sonucunda jel içinde büyüklüklerine göre sıralanırlar. Bu sıralama sonrası DNA jel ortamdan daha kullanıĢlı olan naylon filtrelere tek iplik halinde southern transfer metoduyla transfer edilir (Yıldırım ve Kandemir, 2001).
2.5.2. RAPD (Rastgele ArtırılmıĢ Polimofik DNA)
RAPD (Rastgele ArttırılmıĢ Polimorfik DNA, Randomly Amplified Polimorphic DNAs) ilk defa 1990‟ da rastgele seçilmiĢ primerlerin kullanıldığı ve Polimeraz Zincir Reksiyonu‟ nu (PCR) temel alan bir teknik olarak ortaya çıkmıĢtır (Williams ve ark., 1990).
RAPD yönteminin temel prensibi ilgili olan türe ait genomik DNA üzerinde rastgele seçilmiĢ, tek bir 9–10 bp oligonükleotidin, düĢük bağlanma sıcaklığında tesadüfi olarak bağlanarak
PCR ile çoğaltma yapmasıdır. Tekniğin devamında elde edilen çoğaltma ürünü radyoaktif olmayan standart jel elektroforezinde yürütülür ve çoğaltma ürünleri bantlar halinde gözlemlenerek incelenir. Bantların varlığı veya yokluğuyla sonuçlar değerlendirilmektedir (Williams ve ark., 1990; Welsh ve McClelland, 1990).
2.5.3.SCAR Markörleri (Sequence characterized amplified region markörs)
Bireysel RAPD parçalarından köken alan PCR tabanlı markörlerdir ancak uzun, özel primerlerin kullanımıyla tanımlanırlar. Spesifik SCAR markörlerini elde etmek için RAPD veya ISSR parçaları (fragments) jelden kesilir, klonlanır ve dizi analizi yapılır. Dizi analizinden sonra genellikle 20–25 baz uzunluğundaki parçaların terminal bölgeleri için SCAR primerleri seçilir. Bu markörler marul (Keselsi ve ark. 1993), domates (Deng ve ark. 1997) ve buğday (Laroche ve ark.2000) da çeĢitli hastalıklara karĢı direnç genlerinin tanımlanması ve haritalanmasında baĢarılı bir Ģekilde kullanılmıĢtır (Gostimsky ve ark. 2005).
2.5.4.SSR (Simple Sequence Repeat)
SSR markörleri 1–4 arasında tekrarlanan nükleotid motifleri içerir (Braaten ve ark., 1988, Vergnoud 1989). Bu bölgeler "mikrosatellit" olarak adlandırılır (Litt ve Luty 1989) ve PCR (Saiki ve ark., 1988) da bireysel olarak amplifiye olurlar. (GT)
n veya (CT)n gibi birbiri
arkasına tekrar eden 2 den 10 a kadar tekrarlı olabilen dizinlerdir.
Bitki nükleer DNA‟sında tekrarlanan basit dizi motiflerinin (örneğin CACACA...) varlığı Delseny ve ark. (1983) tarafından kanıtlanmıĢtır. Mikrosatelit olarak da adlandırılan basit dizi tekrarlarının, sonradan bitki genomu ve organel genomu içeren çoğu organizmalarda bolca bulunduğu görülmüĢtür (Lagercrantz ve ark. 1993, Wang ve ark. 1994). Bu diziler, bitki genetiğinin araĢtırılması için uygun olan genetik varyasyonun büyük bir kaynağını oluĢturmaktadır (Tautz ve ark. 1986).
SSR metodu, tekrarlanan dizilerin iki yanına bağlanan primerlerin bu bölgeleri PCR‟la çoğaltması ve agaroz jel, poliakrilamid jel aracılığı ile büyüklüklerine göre ayrılması üzerine kuruludur.
2.5.5. ISSR (Basit Ġç Dizi Tekrarları)
Teknik 5‟ ve 3‟ sonda güçlendirilen kısa, tekrarlanan DNA zincirlerinin primer olarak kullanılmasını, PCR ürünlerinin elektroforez ile büyüklüklerine göre ayrılmasını ve jel üzerinde DNA‟ların tespitini içerir. Primer olarak 2-4 farklı veya aynı nükleotidlerle sabitlestirilen, basit olarak tekrarlanan DNA zincirleri kullanılır. Bir reaksiyonda tekrarlanan zincir aynı kalmak kaydıyla, sabitlestirici DNA‟ların farklı kombinasyonları primer olarak aynı reaksiyonda kullanılarak bir tek PCR reaksiyonunda güçlendirilen hedef DNA dizilerinin sayıları arttırılır. Böylece bir jel üzerinde yürütülecek bant veya belirteç sayısı arttırılmıs olur. Bu diger DNA belirteçlerinin üretebildigi sayılarla karsılastırıldıgında önemli bir avantaj saglar (Gülsen ve Mutlu, 2005).
2.5.6.AFLP (ÇoğaltılmıĢ Parça Uzunluğu Polimorfizmi)
Restriksiyon enzimleri ile kesilmiĢ DNA fragmentlarının seçici amplifikasyonu temeline dayanır. Çoklu bantlar, tesadüfî bölgelerde DNA markörleri içeren amplifikasyon reaksiyonunda oluĢturulur. DNA analizleri, her örnekten 50 ile 100 bant elde edilecek Ģekilde sonuçlanır. AFLP analizleri ile heterozigot ve homozigot bireyler arasındaki farklılık tespit edilebilmektedir (Parmaksız, 2004).
2.5.7.SRAP Markörler (Sequence-related amplified polymorphism)
SRAP; patates, pirinç, marul, kıvırcık, çim, kereviz, limon, buğday, elma, salatalık, çin lahanası, mısır gibi pek çok üründe baĢarıyla kullanılmıĢ yeni, basit ve güvenilir PCR-tabanlı markör sistemidir ( Li ve Quiros,2004). Pek çok yayın SRAP markör sisteminin genetik çeĢitlilik analizlerinde, kültürlerin tanımlanmasında ve filogenetik çalıĢmalarda çok etkili bir araç olduğunu göstermiĢtir (Ferriol ve ark., 2003). Feriol ve ark. (2003) SRAP markörler tarafından verilen bilginin morfolojik çeĢitlilik ve morfotiplerin filogenetik geçmiĢi ile AFLP markörlerinden daha uygun olduğunu bildirmiĢtir.
SRAP, bitkilerde genetik farklılık çalıĢmaları için son dönemlerde geliĢtirilmiĢ bir moleküler markör sistemidir (Li ve Quiros, 2001). ISSR‟dan farklı olarak SRAP tekniği primer dizilerinin kendine has dizaynını kullanarak genomdaki kodlanmıĢ dizileri hedefler ve bir kısım ko-dominant markörlerin tanımlanması ile sonuçlanır. SRAP primerleri, 17 veya 18 nükleotid uzunluğundadır. 13 veya 14 bazlık bir öz dizi ve bunun içinde 5‟ ucunda spesifik olmayan 10 veya 11 nükleotidden oluĢur, bu diziyi forward primerde CCGG ve reverse primerde AATT izler. Ġç sekans 3‟ucunda üç selektif nükleotit tarafından izlenir. Forward ve reverse primerlerin filler sekansları birbirinden farklı olmalıdır (Li ve Quiros, 2001). SRAP markörleri genetik farklılığı belirlemek (Ferriol ve ark., 2003) ve aynı zamanda gen iĢaretleme ve genom haritalanması (Li ve Quiros, 2001) için kullanıĢlı bir yöntem olarak tanımlanmıĢtır.
Li ve Quiros (2001), Açık okuma çerçevelerini (ORF‟leri=Open Reading Frame) çoğaltmayı amaçlayan basit bir markör tekniği geliĢtirmiĢlerdir. Ġki primer amplifikasyonunu temel almaktadır. Ġlk beĢ siklusun annealing sıcaklığı 35 C° „dir. Devamındaki 35 siklus 50 C° „de çalıĢır. Çoğaltılan DNA fragmentleri akrilamid jellerle ayrılır ve otoradyografi ile belirlenebilir. Brassica „nın varolan rekombinant serileri ve doubled-haploid soylarını bu markör tekniği ile test etmiĢlerdir. Sekanslamadan sonra bantların % 45 „ i Genbank veritabanındaki bilinen genlerle eĢleĢmiĢtir. SRAP markörlarının %25‟i co-dominanttır ki bunları sekanslamayla gösterilmiĢtir. Bir linkaj (bağlantı) haritasının yapılması SRAP markörlerinin tam bir dağılımını 9 büyük linkaj grubunda açığa çıkarmıĢtır ve bu AFLP markörları ile farklı değildir. Çin lahanasının farklı dokularından elde edilen cDNA „ları da çoğaltmıĢlar ve bu sekansların parmakizini (fingerprinting) belirlemiĢlerdir.
Feng ve ark. (2009), Çinde bulunan16 Celosia argentea L. ve 6 Celosia cristata L. populasyonunun genetik çeĢitliliğini SRAP tekniğini kullanarak araĢtırmıĢlardır. Kullanılan 10 primer kombinasyonu 50 ila 2000 baz çifti arasında değiĢen 507 sayılabilir amplifikasyon bandı vermiĢtir, bunlardan 274 ü polimorfiktir ve primer baĢına ortalama olarak 54 polimorfik bant düĢmektedir. UPGMA küme analizi kullanılarak populasyonlar arasındaki genetik uzaklığı belirlemek için filogenetik ağaç oluĢturulmuĢtur ve bu veriler de coğrafi köken bilgileri ile uyuĢmaktadır. 22 populasyon iki büyük genetik gruba ayrılmıĢtır. C. argentea „da M1E6 olarak adlandırılan tipik bir fragment C.argentea’ nın C. cristata’ dan ayırımında alternatif bir yaklaĢım sağlamıĢtır. Aynı zamanda, önemli coğrafik farklarla C.argentea populasyonlarında var olan büyük genetik çeĢitlilik populasyon genetiği parametrelerinin
yüksek bir seviyesi ile doğrulanmıĢtır. Bu bilginin gelecekte C.argentea populasyonları için ıslah materyali seçimi ve korunması yönetiminde faydalı olabileceğini ileri sürmüĢlerdir.
Ding ve ark. (2008), Orchidaceae familyasına ait, klasik tıpta kullanılan, Çinde endemik olan ve kritik Ģekilde tehlike altında olan Dendrobium officinale „de genetik çeĢitliliğin belirlenmesi ve bitkinin korunmasına yönelik olarak SRAP tekniğini kullanmıĢlardır. Bu türün genetik yapısının araĢtırılması ve korunma stratejileri üzerine bazı tavsiyeler sunmak için 9 yabani D. officinale populasyonundan 84 bireyi analiz etmiĢlerdir. Tür bazında yüksek bir genetik çeĢitlilik belirlenmiĢtir (% 88,07). Ancak, diğer benzer yaĢam özelliklerine sahip türlerle karĢılaĢtırıldığında populasyon seviyesindeki genetik çeĢitliliğin daha düĢük olduğu gözlenmiĢtir (% 51,68). Bu çalıĢmada 4 farklı forward ve reverse SRAP primer kombinasyonu kullanılmıĢtır. Sonuç olarak 2 ana grup belirlenmiĢtir. Toplamda elde edilen 109 banttan 96‟sı polimorfiktir.
Genetik çeĢitliliğin belirlenmesi tehlikedeki türlerin korunması açısından çok önemli olduğunu ve genelde, nesli tehlikede olan bitkilerde düĢük bir genetik çeĢitliliğin varlığını ortaya koymuĢlardır. Fakat Goodyera procera, Changnienia amoena, Gastrodia elata gibi bazı tehlikede olan orkide türlerinde, yapılan RAPD ve ISSR çalıĢmalarında yüksek seviyede genetik çeĢitlilik belirlenmiĢtir. Dendrobium officinale‟ nin genetik yapısının belirlenmesi için yapılan bu çalıĢmada populasyon seviyesinde düĢük genetik çeĢitlilik belirlenmiĢken, tür seviyesinde yüksek genetik çeĢitlilik saptanmıĢtır. Buna sebep olarak muhtemelen populasyon dağılımı ve habitat parçalanması ile habitat kaybından kaynaklanan sınırlı gen akıĢını gösterilmiĢtir.
Wang ve ark. (2008), Cucumis melo L. (kavun) bitkisinin moleküler haritasını SRAP tekniğini kullanarak ortaya koymuĢlardır. Bu çalıĢmada 4G21 (C. melo var. chinensis) ve 3A832( C.
melo var. saccherinus) çaprazlanmasından elde edilen F2 bireylerinden oluĢan 114 birey ile
çalıĢılmıĢlardır. 29 primer çifti kullanılmıĢ ve 187 polimorfik lokus üretilmiĢtir. Haritanın 152 genetik markörı kapsayan 12 bağlantı grubu içerdiğini ve ortalama 13,67 cM genetik uzaklık ile 2077,1 cM‟ lik alan kapladığını belirtmiĢlerdir. Rastgele 15 forward primeri seçmiĢler ve 64 reverse primeri ile eĢleĢtirmiĢlerdir. Toplamda 960 adet primer çifti elde etmiĢlerdir. Bunlardan 29 primer çifti daha iyi polimorfizm göstermiĢ ve net bantlar vermiĢtir. Bir primer çiftinin 1 ila 15 arası polimorfik bant üretebildiğini ifade etmiĢlerdir.
Mutlu ve ark. (2008), patlıcan bitkisinde solma direnci genini SRAP, SRAP-RGA, RAPD ve SCAR markörleri ile araĢtırmıĢlardır. Fusarium wilt; patlıcan bitkisinde “pembe kar küfü” olarakta adlandırılan Fusarium nivale adlı fungusun neden olduğu vasküler bir hastalıktır. Bu çalıĢmada fusarium wilt direncinin monogenik kalıtımının doğrulanması ve bu dirençle iliĢkili moleküler markörlerin teĢhis edilmesi amaçlanmıĢtır. SRAP analizi 13 forward ve 16 reverse primerinden oluĢan 208 primer kombinasyonu ile yapılmıĢtır. Toplamda 598 bant ve primer baĢına ortalama olarak 2,9 bant elde edilmiĢtir. SRAP primerlerinin kodominant olduğu ifade edilmiĢtir.
Gao ve ark. (2008), SRAP markörlerini kullanarak, Çin Hedychium „unun 22 türünün populasyon haritasını anlamak için interspesifik filogenetik iliĢkisini analiz etmiĢlerdir. Aynı tekniği kullanarak, morfolojik karakterlere göre seçilen iki türün haritalarını yapmıĢlardır. Filogenetik analizler 22 türün 3 gruba ayrıldığını göstermiĢtir. Haritalanan ebeveynlerin 0,31‟lik benzerlik katsayısıyla aynı küme içerisinde olduğunu bulmuĢlardır ki bu 22 türün ortalama değerinden daha düĢüktür. Orta yoğunluklu iki harita yapmıĢlardır. Maternal (anasal) ebeveynler 139 lokus içermekte ve 917,1 cM‟ lik alan kaplamaktadır. Bu lokuslar 18 linkaj grubu içinde dağılmıĢtır. Paternal (babasal) ebeveynler 203 lokus içermektedir ve 1386,8 cM‟ lik alan kaplamaktadır ve 23 linkaj grubuna dağılmıĢtır. 3:1 ayırma oranıyla lokusların sayısının iki haritayı birleĢtirmek için etkili olmadığını belirtmiĢlerdir. Ebeveyn seçimi ile ilgili, karakterlerin yanı sıra filogenetik iliĢkilerin de göz önüne alınması gerektiğini önermektedirler. ÇalıĢmada, ortalama seviye civarında veya daha yüksek benzerliği olan iki tür Hedychium populasyonunun iyi haritalanma eğilimi gösterdiği sonucuna varılmıĢtır.
Li-jun ve ark. (2008), Toplamda 35 genotip, 33‟ü melez ve Çin ile Brezilyadan kökenlenen iki yabani tip keneviri SRAP tekniği ile çalıĢılmıĢlardır. Sonuçta; 81 primer kombinasyonundan 33‟ünün polimorfik olduğu anlaĢılmıĢ ve 332 bant elde edilmiĢtir, bunlardan 284‟ü (%85,54) polimorfiktir. Primerler Brassica ve diğer genusların çeĢitlilik analizinde kullanılan 9 forward ve 9 reverse primer kombinasyonundan seçilmiĢtir. UPGMA analizi ile genetik iliĢki belirlenmiĢtir ve Jaccard benzerlik katsayısı hesaplanmıĢtır. Sonuç olarak SRAP‟in etkili bir yaklaĢım olduğunu ve kenevir hatlarının taksonomik analizine uygun olduğunu ortaya koymuĢlardır.
SRAP‟in tercihen ORF‟leri (açık okuma çerçevelerini) çoğalttığı, iki birey arasındaki ve türler arasındaki gözlenen polimorfizmin temel olarak intronların, promotorların ve
spacerların uzunluğundaki çeĢitlenmeden kaynaklandığını ortaya koymuĢlardır. SRAP markörlerinin geniĢ ölçüde genetik linkaj (bağlantı) harita yapımında, genetik çeĢitliliğin analizinde kullanıldığını belirtmiĢlerdir. ÇalıĢmada ISSR primerleri de kullanılmıĢlardır ve polimorfik bantların SRAP‟ ten daha düĢük olduğu sonucunu elde etmiĢlerdir. SRAP‟in dominant bir markör olduğu sonucuna varmıĢlardır.
SRAP primerlerin tercihen C ve G „ce zengin eksonik bölgeleri ve A ve T „ce zengin promotor bölgeleri içeren intronik bölgeleri iki primerin kombinasyonunu kullanarak çoğalttığını bellirtmiĢlerdir. SRAP markörleri populasyonların genetik çeĢitliliğinin çalıĢılmasında klasik methodlardan daha doğru bir bilgi sağlamaktadır. SRAP gibi PCR tabanlı moleküler markörlerin Markör Yardımlı Seçim (MAS=markör assisted selection) için de ve genetik kaynak korunması çalıĢmalarında kullanılabileceğini belirtmiĢlerdir. Bu süreçteki daha ileri çalıĢmalar genotip ile fenotip arasındaki genetik iliĢkiyi anlamak amacıyla çoğaltılan DNA‟ların sekanslanması olacaktır.
Gulsen ve ark. (2007), SRAP ve fenotipik markörları 23 Abelmoschus esculentus (L) Moench (bamya) genotipi arasındaki iliĢkiyi ve çeĢitliliği belirlemek için çalıĢılmıĢlardır. 39 forward ve reverse primer kombinasyonu kullanmıĢlardır. 23 genotipin 21 „i Türk ve 2‟si dıĢ grup olarak rastgele seçilmiĢ Amerikan genotipidir. Ve 97 sayılabilir bant elde edilmiĢtir, %50 si tüm 23 genom için polimorfiktir. 23 genotipten 17‟si (%74) bir diğerinden ortalama olarak 0,93 „lük benzerlikle ayırt edilmiĢtir. Fenotipik markörlerden ise, 33 kalıtsal özellik arazide değerlendirilmiĢ, onlardan 28 „inin (%85) polimorfik olduğu bulunmuĢtur. UPGMA dendogramı tüm genotiplerde ayırt edilebilen 33 fenotipik marköre dayanmaktadır, fakat bamya genotiplerinin coğrafik birliklerinin belirlenmesinde baĢarısız olunmuĢtur. Sonuç olarak, SRAP markörlerinin bamya gametleri arasındaki çeĢitliliğin ve akrabalığın çalıĢılmasında kullanıĢlı olduğu ve markör tabanlı seçim, linkaj haritalama ve filogenetik çalıĢmalar için bir potansiyele sahip olduğu ortaya konmuĢtur.
Budak ve ark. (2004), Amerikada Great Plains bölgesinde çim olarak geniĢ ölçüde kullanılan tek doğal çim olan Buffalograss ile çalıĢmıĢlardır. Buffalograss’ ın kuraklığa olan direnci ve düĢük bakım gereksinimi ile dikkatleri çeken bir çim türü olduğunu belirtmiĢlerdir. ÇalıĢmada tohumluk biyotipler ve vejetatif biyotipler arasındaki genetik iliĢki üzerine genel bir bakıĢ elde etmeyi amaçlamıĢlardır. ÇalĢmada ISSR, RAPD, SRAP, SSR markörlarını kullanılmıĢlardır. Tüm çim kültürlerinin 4 markör sistemiyle parmakizlerini (fingerprinting)
elde etmiĢlerdir. Polimorfik SRAP‟ler yakın akraba türler arasındaki genetik çeĢitliliği göstermiĢtir. 34 SRAP primer kombinasyonundan 30‟u çalıĢılmıĢtır. Toplamda gözlenen 263 banttan 249‟unun (%95) polimorfik olduğu belirtilmiĢtir. Kullanılan SRAP markörleri genotipler arasında nisbeten yüksek seviyede bir genetik uzaklık açığa çıkarmıĢtır. Ortalama 5 olan allellerin sayısı 1 ila 9 arasında değiĢmiĢtir. Markör tiplerinin ortalama ayrım gücünün SRAP>SSR>ISSR>RAPD Ģeklinde olduğunu belirtmiĢlerdir.
Bu çalıĢmada SRAP markörlerinin, çalıĢılan diğer markör sistemleriyle karĢılaĢtırıldığında yüksek polimorfizme ve ayırt edici fragmentlere sahip olduğu ortaya konmuĢtur.
Parmaksız (2004), Oxyona seksiyonuna ait bitkilerde RAPD tekniğini kullanmıĢlardır. 53 populasyonda 15 primer kullanılmıĢ ve oluĢan 96 banttan 90 tanesinin polimorfik ve polimorfizm oranının % 84,3 olduğu belirtilmiĢtir. Yine Parmaksız ve ark. (2009) tarafından TÜBĠTAK projesi kapsamında gerçekleĢtirilen bir çalıĢmada; RAPD tekniğinin 183 populasyonda uygulanması sonuçlarına göre kullanılan 22 primerden 21 tanesinin polimorfik olduğu ve bu primerlerin toplam 87 bant oluĢturduğu belirlenmiĢtir. Polimorfizm oranı ise %92,55 olarak bulunmuĢtur. Ortalama genetik mesafe 0,38 olarak bulunmuĢtur. SSR tekniğinin 183 populasyonda uygulanması sonucu elde edilen veriler RAPD tekniği ile yapılan çalıĢmanın sonuçları ile benzerlik göstermektedir.
Gürkök (2009), Oxyona seksiyonuna ait farklı bölgelerden toplanmıĢ 180 bitki örneğinde ISSR tekniği ile moleküler karakterizasyon yapılmıĢtır. 20 ISSR primeri kullanılmıĢtır. ÇalıĢma sonucunda 180 bitkide polimorfizm oranı %96,97 olup toplam 82 bant oluĢturmuĢ 80 polimorfik bant vermiĢtir. Ortalama genetik mesafe 0,35 olarak, Shannon indeksi 0,50 olarak bulunmuĢtur.
Benli (2009), Oxyona seksiyonuna ait bitkilerin 12 SSR primeri kullanılarak genetik karakterizasyonu yapılmıĢtır. 60 bant üretilmiĢ olup, primer baĢına ortalama 5 bant belirlenmiĢtir. Matris sonucuna göre 183 populasyon arasındaki ortalama genetik uzaklık 0,41 olarak ve Shannon indeksi 0,53 olarak bulunmuĢtur.
Çizelge 4.1. Kromozom sayısı, önemli morfolojik özellikler ve tebain içerikleri (Parmaksız ve ark. (2009) TÜBĠTAK projesinden alınmıĢtır.)
Pop. No. Bitki Sırası Kromozo m Sayısı Toplanan Bölge Tomurcuk Görünümü
Brakte Kaolin Petal Petal rengi Petal leke durumu
Tebain miktarı (%)
1 25-C 28 TUNCELĠ Dik 5 Kiremit Kırmızı Ortada 2,504
2 29-C 28 TUNCELĠ Dik 6 6 Koyu kırmızı Tabana
kadar
1,27
3 70-E 42 TUNCELĠ Dik 1 4 Kiremit Kırmızı Ortada 0,395
4 34-C 28 TUNCELĠ Dik 4 Kiremit Kırmızı Ortada -
5 44-C 28 TUNCELĠ Eğik 3 2 6 Koyu kırmızı Tabana
kadar
0,217
6 69-E 42 TUNCELĠ Dik 4 Kiremit Kırmızı Yok
-
7 36-C 28 TUNCELĠ Eğik 13 Kiremit Kırmızı Ortada 0,057
8 40-C 28 TUNCELĠ Eğik 4 Kiremit Kırmızı Tabana
kadar -
9 47-C 28 TUNCELĠ -
10 67-E 28 TUNCELĠ Dik 4 Kiremit Kırmızı Ortada 1,196
11 30-C 42 TUNCELĠ Dik 5 6 Koyu kırmızı Ortada -
12 1-F 42 SĠVAS YILDIZ
Dik 4 1 6 Koyu kırmızı Ortada 13 2-F 42 SĠVAS YILDIZ 14 5-F 42 SĠVAS YILDIZ 15 10-F 42 SĠVAS TECER
Dik 4 2 6 Koyu kırmızı Tabana kadar
1,982
16 7-F 28 SĠVAS TECER
Dik 4 1 6 Koyu kırmızı Tabana kadar
2,074
17 8-F 42 SĠVAS TECER
Dik 5 6 Koyu kırmızı Tabana kadar
-
18 11-F 42 ERZĠNCAN Dik 5 1 6 Kiremit Kırmızı Tabana
kadar
2,006
19 16-F 28 ERZĠNCAN -
20 15-F 42 ERZĠNCAN Eğik 4 1 6 Koyu kırmızı Tabana
kadar
1,534
21 14-F 28 ERZĠNCAN Dik 3 2 5 Koyu kırmızı Tabana
kadar
-
22 18-F 42 ERZĠNCAN Dik 4 2 6 Koyu kırmızı Ortada -
23 99-D 14 A.Ü.Z.F. Dik 5 1 6 Koyu kırmızı Ortada 1,06
24 149-A 14 A.Ü.Z.F.
25 23-C 14 A.Ü.Z.F. Dik 4 1 5 Koyu kırmızı Ortada 2,597
26 118-D 42 NĠĞDE Dik 2 2 6 Kiremit Kırmızı Ortada 0,081
27 125-A 28 NĠĞDE Dik 7 Kiremit Kırmızı -
28 195-B 42 NĠĞDE Dik 4 Kiremit Kırmızı Ortada
29 162-B 42 NĠĞDE Dik 2 6 Kiremit Kırmızı Ortada
-
30 71-F 28 NĠĞDE Dik 6 Kiremit Kırmızı Ortada -
31 169-B 42 NĠĞDE Yarı Dik 6 Kiremit Kırmızı Ortada -
32 187-A NĠĞDE
33 201-B 28 NĠĞDE Yarı Dik 5 Kiremit Kırmızı Ortada çok
az
3,047
34 128-A 42 NĠĞDE Dik 3 4 Kiremit Kırmızı Ortada 0,086
35 231-D 42 NĠĞDE Yarı Dik 5 Kiremit Kırmızı Ortada
-
36 104-D 14 NĠĞDE Dik 4 2 6 Koyu kırmızı Ortada
37 222-B 42 NĠĞDE Eğik 4 Kiremit Kırmızı Ortada -
38 123-D 28 NĠĞDE Yarı Dik 1 3 6 Kiremit Kırmızı Ortada 0,089
39 189-B NĠĞDE
3. MATERYAL VE YÖNTEM
3.1. Materyal
Materyal olarak kullanılan örnekler; Türkiye‟nin çeĢitli yerlerinden toplanmıĢ, Oxytona seksiyonu içerisindeki Papaver cinsine ait bitkilerdir. Bu bitkiler TOVAG–105 O 501 Nolu TÜBĠTAK projesi kapsamında GaziosmanpaĢa Üniversitesi deneme tarlasında yetiĢtirilmiĢtir. Her bir bitkiden üç sırada beĢer bitki olacak Ģekilde 15 adet bitki deneme tarlasında yetiĢtirilmiĢtir. ÇalıĢılan bitkiler 183 Papaver cinsi içerisinden Çizelge 4.1.‟de verilen tebain oranları göz önüne alınarak seçilmiĢtir (Çizelge 4.1.). AraĢtırma materyali olarak kullanılan 40 adet bitkiden DNA izolasyonu amacıyla genç taze yapraklar alınmıĢtır. Papaver
bracteatum (2n=14), P. pseudo-orientale (2n=42) ve P. orientale (2n=28) çalıĢmada kullanılan türlerdir.
3.2. Yöntem
AraĢtırmamızda kullanılan SRAP tekniği DNA izolasyonu, PCR uygulaması ve PCR ürünlerinin Agaroz Jel ortamında yürütülerek jel görüntüleme sisteminde görüntülenmesi iĢlemlerini içermektedir.
3.2.1. Bitki Örneklerinin Laboratuvar ÇalıĢmaları Ġçin Hazırlanması
Moleküler analizlerde kullanılacak DNA materyalini izole etmek amacıyla bitkilerin genç yaprakları ilkbahar döneminde toplanmıĢtır. Bitkilerden toplanan yapraklar kuru buz içerisinde laboratuara getirilerek -80 o
C ye konulmuĢtur. Birkaç gün bekletildikten sonra sıvı azot ile beraber havanda dövülerek ekstrakt haline getirilmiĢtir. Ekstrakt haline gelen bitki örnekleri DNA izolasyonu yapılana kadar -80 o
C de bekletilmiĢtir.
DNA izolasyonu için Fermentas marka Genomic DNA Purification DNA izolasyon kiti kullanılmıĢtır. DNA izolasyon iĢlemi Ģu basamaklardan oluĢmaktadır.
50–100 mg bitki ekstraktı üzerine 400 µl lizis solüsyonu eklenmiĢtir. 5 dakika 65 oC de inkübe edilmiĢtir.
Üzerine 600 ml kloroform eklenmiĢ ve 3-5 kez alt üst edilmiĢtir. 2 dakika 10000 rpm de santrifüj edilmiĢtir.
Üst tarafta kalan kısım yeni bir tüpe alınmıĢtır.
800 ml dilue edilmiĢ precipitation solusyonu eklenmiĢtir. 1–2 dakika karıĢtırılmıĢtır.
2 dakika 10000 rpm de santrifüj edilmiĢtir. Üst tarafta kalan kısım atılmıĢtır.
Tüpün dibinde kalan DNA pelleti 100 ml NaCI solüsyonu ile çözülmüĢtür. 300 ml soğuk etanol eklenmiĢtir.
10 dakika -20 oC de inkübe edilmiĢtir.
4 dakika santrifüj edilmiĢ ve üstte kalan kısım atılmıĢtır. % 70‟lik soğuk etanol ile DNA peleti yıkanmıĢtır.
DNA peleti 100 ml TE (Tris –EDTA Buffer) içinde çözdürülmüĢtür.
3.2.3. PCR Uygulaması
PCR iĢlemi için Apollo Instrumentation ATC401 cihazı kullanılmıĢtır. PCR mix içerisine Çizelge 3.1‟de belirtilen hacimlerde ve konsatrasyonlarda PCR bileĢenleri katılmıĢtır (Çizelge 3.1).
Hazırlanan PCR mix için Çizelge 3.2‟de gösterilen PCR protokolü uygulanmıĢtır (Çizelge 3.2).
Çizelge 3.1. PCR mix bileĢenlerinin konsantrasyonları ve miktarları
PCR öğeleri Final Konsantrasyon Kullanılan Miktar (µl)
Su 15
10x Buffer Mg free (BIOBASIC) 1X 2,5
20 mM MgSO4 (BIOBASIC) 2,8 mM 3,5
10 mM dNTP (Vivantis) 0,3 mM 1,5
Forward primer 0,4µM 1,25
Reverse primer 0,4 µM 1,25
Taq DNA polimeraz (PROMEGA) 0,1U 0,4
DNA 30 ng 3 Toplam 28,4 Çizelge 3.2. PCR protokolü Sıcaklık (o C) Süre (sn) Döngü Sayısı Ön denatürasyon 94 300 1 Denatürasyon 94 60 5 Bağlanma 35(Tm) 60 Uzatma 72 120 2.Denatürasyon 94 60 30 2. Bağlanma 50 60 2. Uzatma 72 120 Son uzatma 72 300 1
3.2.4. ÇalıĢmada Kullanılan SRAP Primerleri
ÇalıĢmada baz dizileri aĢağıda belirtilen 10 adet SRAP primeri kullanılmıĢtır (Çizelge 3.3). Primerler daha önce yapılan çalıĢmalarda kullanılan ve iyi sonuç veren primerler arasından seçilmiĢtir.
Çizelge 3.3. Kullanılan primerlerin isimleri ve baz dizileri
3.2.5. Elektroforez ĠĢlemi
PCR ürünlerini elektroforez etmek için % 1‟lik agaroz jel hazırlanmıĢtır. DNA‟nın boyanması için etidium bromür kullanılmıĢtır. 28,4µl PCR ürünü üzerine 3µl yükleme solüsyonu eklenerek, elektroforez tankına yerleĢtirilen jel üzerine yüklenmiĢ ve 100 voltta ortalama 2,5 saat yürütülmüĢtür.
3.2.6. DNA Bantlarının Görüntülenmesi
Elektroforez uygulaması bittikten sonra KODAK Gel Logic 200 jel görüntüleme cihazı kullanılarak U.V. ıĢık altında resimler alınarak değerlendirilme yapılmıĢtır.
3.2.7. DNA Bantlarının Değerlendirilmesi
FORWARD PRĠMER REVERSE PRĠMER Primerin
YapıĢma Sıcaklığı o
C) F1 TGA GTC CAA ACC GGA TA R1 GAC TGC GTA CGA ATT AAT 49,5 F2 TGA GTC CAA ACC GGA GC R2 GAC TGC GTA CGA ATT TGC 54 F3TGA GTC CAA ACC GGA AT R3 GAC TGC GTA CGA ATT GAC 52 F4 TGA GTC CAA ACC GGA CC R4 GAC TGC GTA CGA ATT TGA 53 F5 TGA GTC CAA ACC GGA AG R5 GAC TGC GTA CGA ATT AAC 52 F6 TGA GTC CAA ACC GGA CA R6 GAC TGC GTA CGA ATT GCA 54 F7 TGA GTC CAA ACC GGA CG R7 GAC TGC GTA CGA ATT CAA 53 F8 TGA GTC CAA ACC GGA CT R8 GAC TGC GTA CGA ATT CAC 52 F9 TGA GTC CAA ACC GGA GG R9 GAC TGC GTA CGA ATT CAG 55 F10 TGA GTC CAA ACC GGA AA R10 GAC TGC GTA CGA ATT CAT 50
SRAP bandları 1 ve 0 olarak kayıt edilmiĢ olup, „1‟ bandın varlığını „0‟ ise bandın yokluğunu göstermektedir. Materyaller arasındaki genetik mesafe POPGENE32 versiyon 1.32 (Population Genetic Analysis) ve MEGA 4.1 (Molecular Evolutionary Genetics Analysis) programları ile analiz edilmiĢtir.
4. BULGULAR
ÇalıĢmada 10 adet SRAP primeri kullanılmıĢ olup primerler çoğunlukla polimorfik, bazıları ise monomorfiktir. Kullanılan primerler toplam 29 adet SRAP bandı oluĢturmuĢtur. Polimorfik lokus sayısı 26 olarak bulunmuĢtur. Verilere göre en yakın genetik mesafe 0, en uzak genetik mesafe 1 dir. Bitkiler arasındaki genetik uzaklık veya yakınlık değeri 0 ise bitkiler %100 aynıdır, Ģayet bu değer 1 ise bitkiler %100 farklıdır.10 bitkide genetik mesafenin minimal değeri 0,1092 olarak bulunmuĢtur. 4 bitkide ise 1 olarak bulunan değer, 10 bitkide de 0.96 olarak bulunmuĢtur. Ortalama genetik mesafe ise 0,46‟dır. Shannon indeksi 0,55 (standart sapma: 0,21) olarak, Nei indeksi 0,38 ( standart sapma: 0,15) olarak bulunmuĢtur. Ayrıca çalıĢmanın sonucunda % 89,66 „lık polimorfizm oranı saptanmıĢtır.
25 C 29 C 8 F 18 F 187 A 231 D 104 D 123 D 231 D 70 E 34 C 201 B 67 E 149 A 47 C 222 B 44 C 36 C 69 E 40 C 30 C 2 F 5 F 10 F 1 F 7 F 169 B 118 D 162 B 195 B 71 F 189 B 11 F 23 C 16 F 14 F 15 F 99 D 128 A 125 A
ġekil 4.3. SRAP primerlerinin oluĢturduğu, bitkiler arasında filogenetik iliĢkiyi gösteren dendogram (Mor renk : 14 Kromozomlu, yeĢil: 28 Kromozomlu, kırmızı: 48 Kromozomlu bitkileri ,sarı renk ise kromozom sayısı bilinmeyen bitkileri simgelemektedir.)
Tür içi ve türler arası genetik çeĢitliliğin belirlenmesinde ayrım gücü yüksek olan markör sistemlerinden biri olan SRAP markör sistemi etkili ve basit kullanımı sayesinde yaygınlaĢmıĢtır. ÇalıĢılan örnek sayısının artıĢı SRAP‟in spesifitesini olumsuz etkilememektedir. Budak ve ark. (2004), ayrım gücü bakımından markör sistemlerini karĢılaĢtırmıĢlar ve SRAP > SSR > ISSR > RAPD Ģeklinde bir sıralama elde etmiĢlerdir. ÇalıĢmada kullandığımız bitkiler Oxytona seksiyonuna ait çok yıllık bitkilerdir. Sivas, Erzincan, Tunceli, Niğde ve A.Ü.Z.F. (Ankara Üniversitesi Ziraat Fakültesi) bitkilerin toplandığı bölgelerdir. Toplamda 40 bitkinin 16‟sı Niğde, 11‟i Tunceli, 6‟sı Sivas, 5‟i Erzincan ve 3‟ü de A.Ü.Z.F. bölgesinden toplanmıĢtır. Kullanılan SRAP primerleri daha önce yapılmıĢ olan çalıĢmalarda kullanılan ve iyi sonuç veren primerler arasından seçilmiĢ olup, en fazla bant veren 3 nolu primer olarak tespit edilmiĢtir (Çizelge 3.3). Feng ve ark.(2009), Çin de bir süs bitkisi olan Celosia argentea L. ve Celosia cristata L. populasyonlarının genetik çeĢitliliğini araĢtırmıĢlardır. Me2/Em2 olarak adlandırdıkları primer, kulandıkları 10 primerden biridir. Bu primer kombinasyonu bizim çalıĢmamızdaki 3 nolu primerdir. 16
Celosia populasyonundan 11‟i diğerlerine göre daha yüksek bir genetik çeĢitlilik göstermiĢtir.
Bunun daha büyük bir populasyonun varlığı ve daha az insan etkisi ile açıklanabileceğini belirtmiĢlerdir. Ayrıca çalıĢmadaki kültür bitkilerinin polimorfizm oranı ve genetik çeĢitliliğin daha düĢük olduğu bulunmuĢtur. Yabani populasyonlar arasındaki çaprazlamalar genetik çeĢitliliği artırmıĢtır. Bizim çalıĢmamızda da bitkilerin Türkiye doğal florasında yetiĢen yabani türler olması polimorfizm oranının yüksek seviyede gözlenmesine neden olmuĢtur.
Feng ve ark.(2009) Celosia ile yaptıkları genetik çeĢitliliğin tespiti çalıĢmasında, benzer Ģekilde 10 primer çifti kullanmıĢlardır. Primerlerin seçimi ve sayısı konusunda herhangi bir sınırlama olmadığından dolayı farklı çalıĢmalarda farklı sayıda primer kombinasyonu kullanılabilmektedir. Ding ve ark.(2008), Çin de endemik ve nesli tehlike altında olan Orchidaceae familyasından Dendrobium officinale „ nin genetik çeĢitliliğinin belirlenmesi ve bitkinin korunmasına yönelik olarak yaptıkları çalıĢmada SRAP tekniğini yalnızca 4 primer çifti kullanarak gerçekleĢtirmiĢlerdir. Li-jun ve ark.(2008) ise 35 kenevir genotipini 33 SRAP primer çifti kullanarak analiz etmiĢlerdir. Oxyona seksiyonuna ait bitkilerde RAPD tekniği ile yapılan bir çalıĢmada (Parmaksız, 2004), benzer bölgelerden toplanan 53 populasyonda 15 primer kullanılmıĢ ve oluĢan 96 banttan 90 tanesinin polimorfik ve polimorfizm oranının % 84,3 olduğu belirtilmiĢtir. Bizim çalıĢmamızda ise polimofizm oranı % 89,66 olarak bulunmuĢtur. RAPD ve SRAP tekniği verileri bu bakımdan birbirini destekler niteliktedir.
Yine Parmaksız ve ark. (2009) tarafından gerçekleĢtirilen bir çalıĢmada; RAPD tekniğinin 183 populasyonda uygulanması sonuçlarına göre kullanılan 22 primerden 21 tanesinin polimorfik olduğu ve bu primerlerin toplam 87 bant oluĢturduğu belirlenmiĢtir. Polimorfizm oranı ise %92,55 olarak bulunmuĢtur. Ayrıca aynı bitki gruplarında ISSR tekniği ile yapılan diğer bir çalıĢmanın verilerine göre (Gürkök, 2009) çalıĢılan 20 primerin oluĢturduğu toplam 82 banttan 80 tanesinin polimorfik ve polimorfizm oranının %96,97 olduğu bildirilmiĢtir. Bitkilerin toplandıkları bölgelerin aynı olmasının yanı sıra, ISSR tekniği kullanılarak yapılan çalıĢmada 180 farklı bitkinin çalıĢıldığı göz önüne alınırsa daha yüksek bir polimorfizm oranı ĢaĢırtıcı olmamıĢtır. Çünkü farklı genotipler genetik çeĢitliliği artırmıĢ ve buna bağlı olarak polimorfizm oranı bizim çalıĢmamıza oranla yaklaĢık %7‟lik bir farklılık göstermiĢtir.
Elde edilen dendogram incelendiğinde, bitkilerin 2 ana gruba ayrıldığı görülmektedir (ġekil 4.3.) Alt gruplar incelendiğinde ise bitkilerin 9 alt gruba ayrıldığı görülmektedir. Sivas ve Niğde bölgesine ait olan P. pseudo-orientale (2n=42) türü dendogram üzerinde aynı grupta yer almıĢtır. Erzincan ve Tunceli bölgesine ait P. orientale (2n=28) türlerine ait bitkiler ayrı
noktalarda gruplanmıĢtır. Papaver bracteatum (2n=14) türü ise net bir gruplanma
göstermemiĢtir.
ÇalıĢmamızda en yakın genetik mesafe değeri 0,109 olarak bulunmuĢtur. 25-C kodlu 1 nolu populasyon ile 29-C kodlu 2 nolu populasyon arasında 0,109‟luk bir genetik mesafe saptanmıĢtır. Sıfıra çok yakın olan bu değer iki bitkinin birbirine genetik olarak oldukça yakın olduğunu göstermektedir. Bu iki bitkinin de 28 kromozomlu ve Tunceli bölgesine ait oluĢu bu sonucu desteklemektedir. Matris verileri ile coğrafi köken bilgileri uyuĢmaktadır. 5-F kodlu 14 nolu populasyon ile 11-F kodlu 18 nolu populsayon arasında ise 1,00‟lik genetik mesafe saptanmıĢtır. Bu da 40 bitki içerisinde bu bitkilerin genetik olarak birbirine en uzak iki bitki olduğunu göstermektedir. Bu bitkilerin her ikisi de 42 kromozomlu olup, 14 nolu populasyon Sivas bölgesine, 18 nolu populasyon ise Erzincan bölgesine ait bitkilerdir.
5.1. Sonuç
Bu tez çalıĢması ile ülkemiz doğal bitki örtüsünde var olan Oxytona seksiyonu bireylerinde gen potansiyelinin genetik düzeyde tanımlanması açısından SRAP tekniği ile ilk uygulama olarak gerçekleĢtirilmiĢ ve daha sonraki çalıĢmalar için optimize edilmiĢtir. Bunun yanında bundan sonra yapılacak olan çalıĢmalar için uygun DNA izolasyon yöntemi ve PCR koĢulları belirlenmiĢtir. SRAP tekniğinin genetik olarak farklı olan populasyonların tespit edilmesinde güvenle kullanılabileceği bulunmuĢtur. Dolayısıyla bu çalıĢma, bundan sonra Oxtona seksiyonu içersinde bulunan belki de Papaver cinsine ait türlerde yapılacak olan gen kaynaklarının karakterize edilmesi ve markörler yardımıyla seleksiyon çalıĢmalarına alt yapı hazırlamıĢtır.
KAYNAKLAR
Akar, T., 2002. Türkiye‟de yetiĢtirilen yerel makarnalık Buğday çeĢitlerinde Genetik
farklılığın polimorfik DNA Analizi ile belirlenmesi. Tarla Bitkileri Anabilim Dalı.Doktora Tezi. Ankara Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü. Ankara.
Avise, J.C. (1994) Molecular Markers, Natural History and Evolution, Chapman and Hall, New York, NY. 511 pp.
Bachmann, K., 1993. Molecular markers in plant ecology, Tansley Review, No: 63; 403-414. Beckmann, J.S., Soller, M., 1986. Restriction fragment length polymorphisms and
genetic improvement of agricultural species. Euphytica 35:111–121.
Benli, Ġ., 2009. Türkiye Doğal Florasında YetiĢen Papaver Cinsi Oxytona Seksiyonuna Ait Gen Havuzunun SSR Tekniği Ġle Genetik Karakterizasyonu. (Yüksek Lisans Tezi), GaziosmanpaĢa Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü Biyoloji Anabilim Dalı, Tokat. Bretting, P.K., Widrlechner, M.P., 1995. Genetic markers and plant genetic resource
management. Plant Breed Rev 31:11–86.
Budak, H. Shearman, R. C., Parmaksiz, I. and Dweikat, I. 2004. Comparative analysis of seeded and vegetative biotype buffalograsses based on phylogenetic relationship using ISSRs, SSRs, RAPDs, and SRAPs. Theoretical and Applied Genetics.109 (2): 280– 288.
Cullen, J., 1965. Papaver L., Ref.: Davis, P.H.(ed.):Flora of Turkey and East Aegean Islands, 1; 219-236, University Press, Edinburg.
Delseny M., Laroche M., Penon P. (1983) Detection of sequences with Z-DNA forming potential in higher plants, Biochem Bioph. Res. Commun., 116:113-20.
Deng, Z., Huang, S., Xiao, S.Y., and Gmitter, F.G., Jr., 1997. Development and Characterization of SCAR Markers Linked to the Citrus Tristeza Virus Resistance Gene from Poncirus trifoliate, Genome, vol. 40 697–704.
Ding, G. Zhang, D. Ding, X. Zhou, Q. Zhang, W. and Li, X.,2008. Genetic variation and conservation of the endangered Chinese endemic herb Dendrobium officinale based on SRAP analysis. Plant Syst. Evol. 276, 149-156.
Fedde, F., 1909. Papaver L. Ref.: Engler, A.: Das Pflanzenreich 40 (IV,104); 288-344, Weinheim.
Feng, N. Xue, Q. Guo, Q. Zhao, R. Guo, M.,2009. Genetic diversity and population structure of Celosia argentea and related spacies revealed by SRAP. Biochem. Genet. 10.1007, 10528-10532.
Ferriol, M., Pico, B., Nuez, F., 2003. Genetic diversity of a germplasm collection of cucurbita pepo using SRAP and AFLP markers. Theor. Appl. Genet., 107, 271–282.
Gao, L. Liu, N. Huang, B. Hu, X., 2008. Phylogenetic analysis and genetic mapping of Chinese Hedychium using SRAP markers. Scientia Horticulturae. 117 (2008), 369-377.
Goldblatt, P., 1974. Biosystematic studies in papaver section oxytona. Annals of The Missouri Botanical Garden, 61 (2): 264-296.
Gostimsky, S.A., Kokaeva, Z.G., and Konovalov, F.A. 2005. Studying Plant Genome Variation Using Molecular Markers. Russian Journal of Genetics, Vol. 41, No. 4, 2005, 378–388.
Gülsen, O. and Mutlu, M., 2005. Bitki biliminde kullanılan genetik markerlar ve kullanım alanları. Alatarım 4(2); 27-37.
Gülsen, O. Karagül, S. and Abak, K., 2007. Diversity and relationships among Turkish okra germplas by SRAP and phenotypic marker polymorphism. Biologia, Bratislava, Section Cellular and Molecular Biology. 62(1), 41-45.
Gürkök, T., 2009. Türkiye Doğal Florasında YetiĢen Papaver Cinsi Oxytona Seksiyonuna Ait Gen Havuzunun ISSR Tekniği Ġle Genetik Karakterizasyonu. (Yüksek Lisans Tezi), GaziosmanpaĢa Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü Biyoloji Anabilim Dalı, Tokat.
Kabaoğlu, A. , 2007. Türkiye‟de Bulunan Hypogymnia (Nyl.) Nyl. Türlerinde rDNA
ITS Bölgesi Dizi Analizi ile Çesitliligin Tanımlanması. A.Ü. Fen Bilimleri Enst. Yüksek Lisans Tezi, Ankara.
Kesseli, R.V., Paran, J., and Michelmore, R.W., 1993. Efficient Mapping of Specifically Targeted Genomic Regions and the Tagging of These Regions with Reliable PCR-Based Genetic Markers, in Application of RAPD Technology to Plant Breeding: Joint Plant Breeding Symposia Series, Minneapolis, Minn., 31–36.
Lagercrantz, U., Ellegren, H., and Andersson, L. 1993, The abundance of various polymorphic microsatellite motifs differs between plants and vertebrates, Nucleic
Acids Res., 21, 1111-1115.
Laroche, A., Demeke, T., Gaudet, D.A., et al., 2000. Development of a PCR Marker for Rapid Identification of the Bt-10 Gene for Common Bunt Resistance in Wheat, Genome, 43 217–223.
Li, G., Quiros, C.F., 2001. Sequence-related amplified polymorphism (SRAP), a new marker system based on a simple PCR reaction: its application to mapping and gene tagging in Brassica. Theor. Appl. Genet., 107 (1), 168–180.
Li-jun, L. Ding-xiang, P. and Bo, W., 2008. Genetic relation analysis on Ramie [ Boehmeria
nivea (L.) Gaud.] inbred lines by SRAP markers. Agricultural Sciences in China. 7(8),
944-949.
Medvedew, J.S. and Kavkazsk,Sv.Mus. 1918: Ann. Caucas. Dusb, ll; 204–207.
Mutlu, N. Boyacı, F.H. Göçmen, M. Abak, K., 2008. Development of SRAP, SRAP-RGA,RAPD and SCAR markers linked with a Fusarium wilt resistance gene in eggplant. Theor Appl Genet. 117, 1303-1312.
Parmaksız, Ġ., 2004. Papaver Cinsi Oxytona Seksiyonunun Türkiye‟de YetiĢen Türlerinde Genetik ÇeĢitliliğin RAPD Markörleri Ġle Analizi. Doktora Tezi, Ankara Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü / Tarla Bitkileri Anabilim Dalı, Ankara .
Parmaksız, Ġ., Önen, H., Yıldırım, A., GümüĢcü, A., Ġpek, A., Arslan, N., 2009. Türkiye Doğal Florasında YetiĢen Papaver Cinsi Oxytona Seksiyonuna Ait Gen Havuzunun RAPD ve
SSR Teknikleriyle Genetik Karakterizasyonu, Morfolojik ve Alkaloit Kompozisyonlarının Kromozom Sayılarıyla ĠliĢkilendirilmesi. Ankara.TÜBĠTAK 105 O 501 nolu proje sonuç raporu.
Saiki, R. K., Gelfand, D. H., Stoffel, S., Scharf, S. J., Higuchi, R., Horn, G. T., Mullıs,
K. B. and Erlıch, H. A., 1988. Primer-directed enzymatic amplificatication of DNA with a termostable DNA polymerase. Science, 239: 937-945.
Seçmen, Ö., Gemici, Y., Görk, G., Bekat, L.ve Leblebici, E., 1995. Tohumlu Bitkiler
Sistematiği (Ders Kitabı). 4. baskı . Ege Ünv. Fen Fak. Ders Kitapları Serisi No: 116. Ġzmir.
ġahin, S., 2008. Türkiye Doğal Florasında YetiĢen Oxytona Seksiyonuna Ait Papaver Türlerinin Morfolojik ve Palinolojik Yönden Ġncelenmesi. (Yüksek Lisans Tezi), GaziosmanpaĢa Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü Biyoloji Bölümü, Tokat.
Tanksley, S.D. and Orton, T.J., 1983. Isozymes in Plant Genetics and Breeding, Part B, Elsevier Science Publishers B. V., Amsterdam, p; 147-163.
Tautz D. and Renz M.,1986. Simple sequences are ubiquitous repetitive components of eukaryotic genomes. Nucleic Acids Res. 12, 4127–4138.
Wang, J. Yao, J. and Lı, W., 2008. Construction of a molecular map for melon ( Cucumis
melo L.) based on SRAP. Front Agric China, 2 (4), 451-455.
Welsh, J., McClelland, M., 1990. "Fingerprinting Genomes Using PCR With Arbitrary Primers", Nucleic Acids Research,Vol 18, 7213-7218.
Welsh, J., Petersen, C., 1991. And "Polimorphisms Genereted By Arbitrarily Primed PCR Ġn The Mouse: Application To Strain Ġdentification And Genetic Mapping", Nucleic
Acids Research, Vol 19, 303-306.
Williams, J.G.K., Kubelik, A.R., Livak, K.J., Rafalski, J.A., Tingey, S.V., 1990. "DNA Polimorphism Amplified By Arbitrary Primers Are Useful As Genetic Markers",
Nucleic Acids Research, Vol 18, 6531-6535.
Yıldırım, A. ve Kandemir, N. 2001. Genetik Markörler ve Analiz Metodları. Bölüm 23. In : Özcan, S. Gürel, E., Babaoğlu, M. Bitki Biyoteknolojisi II. Genetik Mühendislığı ve Uygulamaları. (ed.). Selçuk Üniv. Vakıf Yayınları, Sayfa 112–159. ISBN 975-6652-05-5. Konya.
