臺北醫學大學 藥學研究所
Graduate Institute of Pharmacy
Taipei Medical University
博士論文
Ph. D. Thesis
指導教授：侯文琪 博士 Wen-Chi Hou, Ph. D.
共同指導：林耀輝 博士 Yaw-Huei Lin, Ph. D.
劉得任 博士 Der-Zen Liu, Ph. D.
麩胱甘肽過氧化酶活性染色新方法之建立及山
藥塊莖儲藏性蛋白質對於心血管疾病之預防–
從調節血壓到改善血液流變之研究
The new staining method of glutathione peroxidase and
studies on the yam tuber storage protein in the protection
of the cardiovascular disease – from blood pressure
regulation to improvement of the hemorheology
研究生：林建良
Graduate student：Lin, Chien-Liang
中華民國九十六年一月
目
錄
中文摘要….……….……I. 英文摘要………...III第一部份 麩胱甘肽過氧化酶活性染色新方法之建立
第壹章 緒論……….……….………..……....2 第貳章 實驗材料與方法….……….……..……….………...5 一、實驗材料……….…..….……..…5 二、試藥與儀器………...………..….…5 三、方法與步驟....……….………...……..…....6 四、聚丙烯醯胺膠體電泳..……….…...6 五、GSH-Px 活性染色……….………..8 第參章 結果與討論.………..10 第肆章 參考文獻….………..15第二部分 山藥塊莖儲藏性蛋白質對於心血管疾病之預防–
從調節血壓到改善血液流變之研究
第壹章 緒論……….……….…..23 一、山藥..……….…..……..……….23 二、高血壓..……….……….………...……....27 三、血管收縮素轉化酶..……….………..……….. 30 四、自發性高血壓鼠..………..…………31 五、血液流變…………..………..…………32 六、血液黏度儀…………..………..………36 七、紅血球變形測試原理…………..………..……38 八、紅血球聚集測試原理………..………...…..………41 第貳章 實驗材料與實驗方法……….…..….…………53 一、山藥塊莖儲藏性蛋白質(dioscorin)的純化與分離..…….….…….53 1. 實驗材料………..……….…..….53 2. 試藥及儀器.….……….…….….….53 3. 山藥塊莖粗抽液的製備.………...………54 4. 離子交換管柱層析分離純化.………...……….. 54 5. 聚丙烯醯胺膠體電泳..……….…………55 6. 蛋白質免疫染色……….…... 557. 酵素水解山藥塊莖儲藏性蛋白質..………..….57 二、ACE 活性測定及抑制酵素動力學………..…….….59 1. ACE 活性測定…..…………..……….……….……59 2. ACE 酵素動力學測定………..………60 三、自發性高血壓鼠餵食實驗.…….……….….……….61 四、糖尿病鼠血液流變實驗……….………62 1. 誘發糖尿病鼠…….………..……….….…….…62 2. 血液的採集……….……….62 3. 血液黏度測定……….……….63 4. 紅血球變形及聚集度測量……….……….63 第參章 結果與討論……….……….…..…...64 一、山藥儲藏性蛋白質 dioscorin 的分離與純化..………….………..64 二、抑制 ACE 活性試驗.……….………….………64 1. 不同山藥 dioscorins 抑制 ACE 活性的測定..………..….……...64 2. ACE 抑制動力學.………65 三、自發性高血壓鼠(SHR)餵食實驗..……….………67 四、血液流變的探討………...………..70 第肆章 參考文獻………87
圖表目錄
圖一. 市售之 GSH-Px 0.1, 0.25, 0.5 及 0.75 單位，經 7.5 % native PAGE，蛋白質染色(A)及以 FPF method (B)及 PM method (C)
測得之 GSH-Px 不同濃度的活性染色……...………..……….12
圖二. 市售之 GSH-Px 0.1, 0.25 及 0.5 單位後再經 7.5 % SDS- PAGE， 蛋白質染色(A)及以 FPF method (B)及 PM method (C)測得之 GSH-Px 不同濃度的活性染色..….……….…...…13 圖三. 圖三 (a)薑塊莖萃取物經硫酸銨沈澱後的蛋白質染色。(b) 以 FPF method 活性染色 及(c)以 PM method 活性染色…………14 圖四. 各種山藥塊莖示意圖..…….….………...44 圖五. 腎素-血管加壓素系統…….………...………...…………45 圖六. 雌雄 SHR 在 5-40 週齡血壓變化的情況………46 圖七. 血液黏度測定儀……….……….47
圖八. 血液黏度測定儀之 Double cone/plate sensor 圖…….….…….48
圖九. 紅血球變形及聚集分析儀之感應器示意圖.…..………..49
圖十. 紅血球變形集聚及分析儀之 sensor 圖………..….……...50
圖十一. 紅血球變形測試範例………...51
圖十二. 紅血球聚集測試範例……….……….52 圖 十 三 . 以 DE-52 離 子 交 換 管 柱 進 行 山 藥 塊 莖 儲 藏 性 蛋 白 質
dioscorins 之分離純化………...73 圖十四. 經純化的各種山藥 25μgdioscorins 經 10 % SDS-PAGE 後分 別以 a. Coomassie Brillian Blue R (CBR)染色及 b. 免疫染色 分析之結果………..74 圖十五. 各種山藥 dioscorins 不同的濃度(250, 500, 750, 1000 μg 相當 於 6.4 , 12.8, 19.21, 25.6 μM)及 captopril (0.047, 0.094, 0.141, 0.189 μM)抑制 ACE 活性之能力…….…..………75 圖十六. 各種不同 FAPGG 濃度 (1 x 10-3 –1 x 10-4 M) 對於 ACE(20 mU)有加入及沒加台農一號山藥 dioscorin 活性之 Lineweaver -Burk 曲線圖………..………..76 圖十七. 以血壓測量器測量 SHR 尾動脈血壓示意圖………..77 圖十八. 各種不同山藥 dioscorins 以及 captopril 經口服給予後，測量 SHR 尾動脈收縮壓 24 小時之變化.………79 圖十九. SHR 連續 25 天經口餵食台農一號山藥 dioscorin (YSP-TN1) 40 mg/kg 後 24 小時內測得尾動脈收縮壓(a)、舒張壓(b)及平 均壓(c)的測量值………...………..….80 圖二十. 台農一號山藥 dioscorin 經 pepsin 水解後(PH-TN1)，以 40 mg/kg 經口服給予後，測量 SHR 24 小時尾動脈收縮壓(a)、 舒張壓(b)及平均壓(c)之變化…...………...81
圖二十一. 台農一號山藥 dioscorin 經 Trypsin 水解後(TH-TN1)，以 20 mg/kg 經口服給予後，測量 SHR 24 小時尾動脈收縮壓之 變化………...82 表一. 以各種山藥 dioscorins 口服餵食 SHR，第 0, 2, 4, 6, 8, 10 及 24 小時間與空白對照組收縮壓的差異變化………..78 表二.Wistar 誘導成糖尿病兩週後給予台農一號山藥 dioscorin 10 及 40 mg/kg 三週與未給藥對照組體重及血液生化值之比較……...83 表三. Wistar 誘導成糖尿病兩週後給予台農一號山藥 dioscorin 10 及 40 mg/kg 三週與未給藥對照組血液流變值之比較…………...…84 表四. Wistar 誘導成糖尿病八週後連續給予台農一號山藥 dioscorin 10, 20 及 40 mg/kg 三週與未給藥對照組體重及血液生化值比較.85 表五. Wistar 誘導成糖尿病八週後連續給予台農一號山藥 dioscorin 10 , 20 及 40 mg/kg 三週與未給藥對照組血液流變值之比較…….86
附圖一. 台農一號山藥 dioscorin (250, 500, 750, 1000 μg 相當於 6.4 , 12.8, 19.21, 25.6 μM)抑制 ACE (20 mU)活性之能力…..…103 附圖二. 台農二號山藥 dioscorin (250, 500, 750, 1000 μg 相當於 6.4 , 12.8, 19.21, 25.6 μM)抑制 ACE (20 mU)活性之能力…..…104 附圖三. 基隆山藥 dioscorin (250, 500, 750, 1000 μg 相當於 6.4 , 12.8, 19.21, 25.6 μM)抑制 ACE (20 mU)活性之能力……….…..105 附圖四. 名間山藥 dioscorin (250, 500, 750, 1000 μg 相當於 6.4 , 12.8, 19.21, 25.6 μM)抑制 ACE (20 mU)活性之能力…….……..106 附圖五. 日本山藥 dioscorin (250, 500, 750, 1000 μg 相當於 6.4 , 12.8, 19.21, 25.6 μM)抑制 ACE (20 mM)活性之能力…...……….107 附表一.誘導糖尿病鼠(兩週)，自然攝食三週後之對照組之血液參 數…..………..108 附表二. 誘導糖尿病鼠(兩週)，再餵食台農一號山藥 dioscorin 40 mg/kg 三週後之血液參數.………..…….………...….109 附表三. 誘導糖尿病鼠(兩週)，再餵食台農一號山藥 dioscorin 10 mg/kg 三週後之血液參數………...…….…...……....110 附表四. 正常鼠飼養後八週之血液參數.……….…….………..111 附表五. 誘導糖尿病鼠後八週後之血液參數………..………..112 附表六. 誘導糖尿病鼠(八週)，再餵食台農一號山藥 dioscorin 40
mg/kg 三週後之血液參數………..….….113 附表七. 誘導糖尿病鼠(八週)，再餵食台農一號山藥 dioscorin 20
mg/kg 三週後之血液參數…………..………….….………114
附表八. 誘導糖尿病鼠(八週)，再餵食台農一號山藥 dioscorin 10
中文摘要
為了能夠快速尋找
麩胱甘肽過氧化酶(
Glutathione peroxidase,GSH-Px)的活性，市售的 GSH-Px (Sigma Co., G6137)在 7.5 % native PAGE 或是 7.5 % SDS-PAGE 電泳後浸泡在 50 mM Tris-HCl buffer (pH
7.9)內含 13 mM
麩胱甘肽(glutathione)
及 0.004 % 過氧化氫(H2O2)中搖晃 10- 20 分鐘，再參照 Ukai 等人在 1997 年所提出對於 C-S lyase 活性染色的方法加以修改，以 1.2 mM 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT)及 1.6 mM phenazine methsulfate (PMS)來對 GSH-Px 做活性染色，可以發現在反應 10 分鐘後 GSH-Px 的活性會在膠體上以透明澄清的部分在紫色的背景下呈現出來。接著 從薑塊莖的萃取液以不同濃度之硫酸銨沈澱後( 30–45 %, 45–60 %, 60–75 %, 75–90% )的各部分重複上述方法，發現薑塊莖的萃取物有 GSH-Px 的活性。本實驗建立了這個具有快速靈敏的新方法，可以用 在動植物細胞中酵素的純化及鑑定。 另外第二部分的研究是從台農一號山藥、台農二號山藥、基隆山 藥、名間山藥以及日本山藥中經由 DE-52 陰離子交換樹脂分離出來 之儲藏性蛋白質 dioscorin，在運用 N-[3-(2-furyl) acryloyl]-Phe-Gly-Gly (FAPGG) 當 受 質 時 皆 具 有 抑 制 血 管 收 縮 素 轉 化 酶 (angiotensin-converting enzyme，ACE)之活性，且台農一號山藥 dioscorin 之作用
較為明顯，其 IC50為 15.98 μM (相當於 623.8 μg)；另進行酵素動力
學分析以台農一號dioscorin 12.8 μM 當作抑制劑，由 Michaels-Menten
方程式求得 Km及 Km’各為 0.387 及 0.727 mM，帶入公式 Ki = [I] /
(Km’/Km) – 1，求得抑制常數 Ki為27.35 μM，其 Vmax不變 Km變大，
一次台農一號山藥 dioscorin 20 及 40 mg/kg，與對照組作比較，在第 4 小時有最高之降血壓量，收縮壓分別下降 2.4 mmHg、21.5 mmHg。 而且以 pepsin 水解台農一號山藥 dioscorin (PH-YSP) 40 mg/kg 其第八 小時收縮壓下降了 32.8 mmHg。另外再以台農一號山藥 dioscorin 40 mg/kg 連續餵食 25 天，與對照組比較發現，實驗組血壓都比空白對 照組低，第九天時其收縮壓有 27.7 mmHg 之最大降低效果。 在血液流變的部分，Wistar 誘導成糖尿病三週後再餵食台農一號 山藥 dioscorin 10mg/kg 三週，其紅血球的變形度指數與沒餵食台農一 號山藥 dioscorin 時比較差別不大(p=0.854)，但紅血球聚集指數也降 低了 15.3 % (p<0.001)，而剪應力= 300, 600 sec-1時所測得的黏度比對 照組時的黏度降低了 18.2 % (p=0.1008)、27.5 % (p<0.05)。而 Wistar 誘導成糖尿病八週後再餵食台農一號山藥 dioscorin 10 , 20 及 40 mg/kg 三週，其紅血球變形度指數分別提高了 7.0 % (p<0.001), 9.7 % (p<0.001)及 11.7 % (p<0.001)。另外在紅血球聚集度分別降低了 20.8 % (p<0.001), 42.3 % (p<0.001)及 54.4 % (p<0.001)，在給予剪應力=10, 300, 600 sec-1 時餵食 10 mg/kg 分別有 35.2 % (p= 0.201), 21.2 % (p<0.01), 28.4 % (p<0.01)的降幅、20 mg/kg 有 23.0 % (p=0.0579), 21.5 % (p<0.01), 23.9 % (p<0.01)的降幅、40 mg/kg 有 5.3 % (p<0.05), 15.2 % (p<0.01) , 12.5 % (p<0.01)的降幅，比起空白對照組，有餵食台農一號 山藥 dioscorin 皆有明顯改善血液流變參數的效果。在現階段的農產 保健食品當中，山藥可謂具有很大的發展，且對於未來開發成輔助調 整血壓及改善血液流變的食品，亦具有相當的潛力。
英文摘要
To quickly screen the activity of the glutathione peroxidase (GSH-Px), from commercial bovine erythrocytes or ammonium sulfate fractionations (30-45%, 45-60%, 60-75% and 75-90% saturations) of ginger rhizome, was detected on polyacrylamide gels after native polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE) or sodium dodecyl sulfate (SDS-PAGE). The gel was submerged in a 50 mM Tris-HCl buffer (pH 7.9) containing 13 mM glutathione and 0.004 % hydrogen peroxide with gentle shaking for 10-20 min. The GSH-Px activity was stained with a solution containing 1.2 mM 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl-tetrazolium bromide (MTT) and 1.6 mM phenazine methsulfate (PMS) for 10 min. The clear zone of GSH-Px activity on a purple background was found in both native and SDS-PAGE gels. This fast and sensitive method can be used in the process of enzyme purification and characterization of mammalian or plant cells.
In the second part, the dioscorins, the tuber storage protein of yam from Dioscorea alata L. cv. Tainong No.1 (TN1), D. alata L. cv. Tainong No.2, D. pseudojaponica Tamamoto, D. alata L. var. purpurea and D. batatas Decne were purified from DE-52 ion-exchange chromatography. The activities of inhibit angiotensin-converting enzyme (ACE) were shown by using N-[3-(2-furyl) acryloyl]-Phe-Gly-Gly (FAPGG) as substrate. And the effect was more observably by TN1 with the 50%
inhibition (IC50) of ACE activity was 15.98 μM (equal to 623.8 μg)
dioscorin. In the analysis of enzyme kinstics, using 12.8 μM TN1
dioscorin as an inhibitor, the Km and Km’were 0.387 and 0.727 mM
was 27.35 μM obtain from Ki=[I]/(Km’/ Km)-1. In the test of spontaneous
hypertension rat (SHR), it was also found that the systolic pressure of SHR was decreased 12.4 mmHg and 21.5 mmHg respectively after 4 hours fed on 20 and 40 mg/kg of the TN1 dioscorin. And 40 mg/kg of the peptic hydrolyzate was fed, 8 hours later the systolic pressure of SHR was decreased 32.8 mmHg. For long-term 25-day oral administration of 40 mg/kg TN1 dioscorin SHR once a day, it was found that the SBP were lower than the control, and the ninth day the systolic pressure of SHR was maximum reducetion by 27.7 mmHg.
And in the haemorrheological properties, after diabetes mellitus (DM) was induced by streptocozocin, 3 weeks later the Wistar rats were fed with TN1 dioscorin 10 mg/kg for 3 weeks. The blood deformation index was no difference (p=0.854) compared with the control. But the red blood aggregation index was lower 15.3 % (p<0.001), and the blood
viscosity was lower by 18.2 % (p=0.1008) (γ=300), 27.5 % (p<0.05)
(γ=600). After 8 weeks DM induced, the Wistar rats were fed with TN1
dioscorin 10, 20 and 40 mg/kg for 3 weeks. The red blood deformation index was elevated 7.0 % (p<0.001), 9.7 % (p<0.001) and 11.7 % (p<0.001) respectively. The blood aggregation index was lower 20.8 % (p<0.001), 42.3 % (p<0.001) and 54.4 % (p<0.001) respectively. In the
blood viscosity test, when shear rate 10, 300, 600 sec-1 was given, the
Wistars fed on 10 mg/kg TN1 dioscorin was lower by 35.2 % (p= 0.201), 21.2 % (p<0.01), 28.4 % (p<0.01) respectively. The Wistars fed on 20 mg/kg TN1 dioscorin was lower by 23.0 % (p=0.0579), 21.5 % (p<0.01),
23.9 % (p<0.01) respectively, and the Wistars fed on 40 mg/kg TN1 dioscorin was lower by 5.3 % (p<0.05), 15.2 % (p<0.01), 12.5 % (p<0.01) respectively. Accroding to the above, it was found that the Wistars fed on TN1 dioscorin significantly improve the blood hemorheology. In the health-care food propellent infancy, dioscorea is more potencial to design as a complementary alternative medicine to adjust blood pressure and improve the blood hemorheology.
第一部分
麩胱甘肽過氧化酶活性染色新方法之建
立
The new activity staining method of
glutathione peroxidase
第壹章 緒
論
O2 在進入細胞後，一方面提供可以能量給予需氧器官，另一方
面會產生氧代謝物及過氧分子，即所謂的 reactive oxygen species (ROS) 而對細胞造成傷害。經過 NAD(P)H-dependent oxidase 的作用會變成 O2 ． -(Clark , 1990)， O2 ．-與 H+結合後經過 superoxide dismutase 的催 化變成 H2O2，H2O2 在含有少量 Fe 3+的情況下會產生有害的 OH．
(Haber et al., 1934)。OH．會攻擊細胞的 protein、DNA 及 lipid 等等
(Imlay et al., 1988)。而 H2O2經過 Glutathione peroxidase 的催化與
Glutathione 作用後，會轉變成沒有毒害的 H2O 與 GSSG (Miller et al.,
1997)。所以 Glutathione peroxidase 在細胞中扮演著清除有害自由基的 角 色 。 Glutathione peroxidase (GSH-Px, E.C. 1.11.1.9) 為 帶 有 硒 (Selenium)之蛋白質，依照 Glutathione peroxidase 的來源及序列的不 同，目前可分成五種類型(Chu, 1994)，第一種為 classical 或是 cytosolic GSH-Px (cGPx) (Mills, 1957)，是最早被分離出來的含硒蛋白質(Flohe et al., 1973, Rotruck et al., 1973)，在紅血球、肝、腎及肺中分佈較多； 第二種為 phospholipid hydroperoxide GSH-Px (PHGPx)在 1982 年首度 被從豬的肝中被純化出來(Ursini et al., 1982)，且被定序發現亦為含硒 蛋白質(Schuckelt et al., 1991)；第三種為 plasma GSH-Px (pGPx)最早 是在血漿中被發現的(Takahashi et al., 1987)，然而主要的來源是腎
臟，在近曲小管上皮細胞和鮑氏囊(Bowman’scapsule)腔壁細胞分泌
到血液中(Yoshimura et al., 1991)，其次分佈在肝、骨骼肌、胰臟、腦、 肺 等 等 (Martin-Alonso et al., 1993) ； 第 四 種 為 gastrointestinal GSH-Px(GI- GPx)，在人的肝臟及胃腸道上皮細胞中被發現(Chu et al., 1993) ； 第 五 種 為 epididymal GSH-Px ， 在 副 睪 、 精 子 中 被 發 現
(Ghyselinck 及 Dufaure, 1990)。所有的 GSH-Px 皆可降低 H2O2及 alkyl
hydroperoxides 等自由基的濃度，特別是對於過氧化物的清除更是明
顯。cGPx 只能降低水溶性過氧化物像是 H2O2，以及一些有機性的過
氧 化 物 ， 例 如 hydroperoxy fatty acid 、 t-butyl hydro peroxide 等 (Forstrom et al., 1979)。PHGPx 及 pGPx 亦可清除 phosphatidylcholine 類過氧化物(Yamamoto et al., 1993)。雖然 cGPx、PGPx 及 GI-GPx 是 同型四聚體(homotetramers)，PHGPx 的分子量卻比其他的 GPx 小， 是一個單體(monomer) (Brigelius-Flohe et al., 1994)。也因為 PHGPx 的 分子小及疏水性(hydrophobic)的特性，他能夠輕易的與細胞膜上的脂 質結合。 雖然 GSH-Px 的主要扮演抗氧化的角色，但是對於 GSH-Px 活性 染色的報導卻是相當少。Sun 等人修改 Woodbury 等人(1971)提出的 酵素活性染色的方法(1988)，以作為 GSH-Px 活性染色的方法。他們 運用 GSH 加上 H2O2或是 cumene hydroperoxide 當受質，以老鼠的肝 細胞均質液浸泡在受質溶液中，在展開 7.5 %的聚乙醯胺膠體電泳後 浸泡在受質溶液中，然後用 1 % FeCl3及 1 % K3Fe(CN)6溶液進行活 性染色，這個方法簡稱為 FPF method，其酵素活性所在位置呈現透 明，背景為藍色。
1997 年 Ukai 和 Sekiya 發展出一套針對 C-S lyase 的活性染色方 法，藉由將含有 C-S 鍵結的酵素水解(例如 cystine，homocystine， cystathionine)，讓含有硫基的部分暴露出來，然後加入 phenazine methosulfate (PMS) 當 成 電 子 的 攜 帶 者 ， 加 速 催 化 硫 基 將 MTT (3-(4,5-dimethyl-thiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide) 還 原 成 藍色的 formazan，這個方法簡稱為 PM method。在此我們利用這個方
法的特性再稍加修改，使之在經過 native PAGE 或是 SDS-PAGE 後能 測定 GSH-Px 的活性染色，不僅快速，並有靈敏的特性。在這個測定 GSH-Px 活性的方法建立後，我們使用薑的塊莖的萃取液經硫酸銨沈 澱 (30-45 %, 45-60 %, 60-75 %, and 75-90 %)，運用這個方法來分析 其 GSH-Px 的活性。
第貳章 實驗材料與方法
一、實驗材料
GSH-Px from bovine erythrocytes (Sigma Co., G6137) L-Glutathione reduced (GSH) (Sigma Co., G4251)
3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide) (MTT) (Sigma CO., M2128)
phenazine methsulfate (PMS) (Sigma Co., P9625) H2O2solution (30 %)
potassium ferricyanide (K3Fe(CN)6) (Sigma Co., P8131)
phenazine methosulfate (PMS) (Sigma Co., P9625) 以上皆購自 Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO, USA)
嫩薑 (Zingiber officinale Roscoe) 購自中央市場
二、試藥與儀器 1. 萃取緩衝液
100 mM Tris buffer, pH 7.9 (BioShip Co., TRS001) 1 % Vit. C (Riedel-deHaen Co., No.33034)
1 % polyvinylpolypyrrolidone (PVPP) (Sigma Co., P6755) 2. Ammonium sulfate 硫酸銨 (Sigma Co., A4915)
3. PD-10 column (Sephadex G-25M, Pharmacia, Uppsala, Sweden) 4. 均質機
三、方法與步驟 將嫩薑洗淨後切小塊後，加入三倍體積之萃取緩衝液，以均質機 均質化，再用紗布過濾，然後以桌上型高速離心機離心 (12,000 x g, 4 ℃, 30 min)， 取上清液再加入硫酸銨，分別進行 30 - 45 %、45 - 60 %、60 - 75%、75 - 90 % 之區分，分段收集，各部分之沈澱再以 50 mM Tris, pH 7.9 溶解後，加至 PD-10 column(Sephadex G-25M)，將鹽去除。
四、聚丙烯醯胺膠體電泳(polyacrylamide gel electrophoresis, PAGE) (Weber et al., 1969)
A.樣品處理
將薑塊莖萃取液之硫酸銨沈澱各部分，取75 μl後加入 25 μl之
60 mM Tris buffer (pH 6.8)含有 14.4 mM 之 2-mercaptoethanol、25 % glycerol、 0.1 % bromophenol blue，分成兩部分，一個加入 2 % SDS， 另一個則不加，native 不加 2-mercaptoethanol，然後置 4 ℃隔夜使用。 B.鑄膠 (1)試劑 A 液：丙烯醯胺液 丙烯醯胺液(Acrylamide) 146 gm Bis-acrylamide 0.8 gm 加水至 500 mL，30℃加熱使之溶解
B 液：分離膠體緩衝液 Tris HCl 45.4 gm TEMED 1.8 mL 用 150 mL 水溶解，加 1 M HCl 59.5 mL，調 pH 至 8.8，加水至 250 mL。 C 液： 焦集膠體溶液 Tris HCl 6.0 gm TEMED 0.4 mL 用 40 mL 水溶解，加 1 M HCl 47 mL，調 pH 至 6.8，加水至 100 mL D 液：電泳槽緩衝液 Tris HCl 30.3 gm Glycine 142.6 gm 加水 800 mL 溶解，調 pH=8.3 加水至 1000 mL，使用時以水稀釋 5 倍。 APS 溶液： Ammonium peroxodisulphate 過硫酸銨 50 mg 溶於 1 mL 水中，置於 4℃冰箱保存。 染色液
Coomassie Brilliant Blue R (CBR) 1.5 gm
脫色液 10 %醋酸與 20 %甲醇之混合液 (2) SDS 膠體溶液配製 (單位：mL) 分離膠體溶液(4 片) 膠體 溶液 7.5 % 10 % 焦集膠體溶液 (2 片) A 液 5.0 6.7 0.66 B 液 5.0 5.0 C 液 1.24 10 % SDS 0.2 0.2 0.05 水 9.9 8.2 2.95 APS 液 0.1 0.1 0.1
(3) native PAGE (Davis et al., 1964)
配置方法如同 SDS 膠體溶液配製，除了 10 % SDS 不加外其餘皆同。
五、GSH-Px 活性染色
A. FPF method (Sun et al., 1988)
取 GSH-Px 0.1, 0.25, 0.5, 0.75 U 進行電泳後，取下來的膠體一半 浸泡在 12.5 % trichloroacetic acid 中固定 15 min，再以 Coomassie Brillian Blue R-250 染色(Neuhoff et al., 1988)；另一半置於 25 % (v/v)
異丙酮 10 mM Tris buffer (pH 7.9) 中搖 10 min，洗去 SDS (native-PAGE 省略此步驟)，置於 50 mM Tris buffer (pH 7.9) 中平衡 15 min (Hou et al., 1998, 1999, 2001)，把 gel 移到 substrate solution (50 mM
Tris buffer, pH 7.9, 13 mM GSH, 0.004 % H2O2)室溫中搖晃 10 - 20
min，再加入 1 % FeCl3及 1 % K3(FeCN)6，gel 的背景顏色為藍色，有
活性的部分則成透明部分。
B. 改良自 MP method
取 GSH-Px 0.1, 0.25, 0.5, 0.75 U 進行電泳後，取下來的膠體一半 浸泡在 12.5 % trichloroacetic acid 中固定 15 min 後以 Coomassie Brillian Blue R-250 染色，另一半置於 25 % (v/v)異丙酮 10 mM Tris buffer (pH 7.9) 中搖 10 min 洗去 SDS (native-PAGE 省略此步驟)後， 置於 50 mM Tris buffer (pH 7.9) 中平衡 15 min，再把 gel 移到 substrate
solution (50 mM Tris buffer, pH 7.9, 13mM GSH, 0.004 % H2O2)室溫中
搖晃 10 - 20 min，然後再把 gel 移到含有 1.2 mM MTT 及 1.6 mM PMS 的溶液中反應 10 min，並且避光，gel 的背景顏色為紫色，有活性的 部分則成透明部分。
第參章 結果與討論
雖然 GSH-Px 扮演著保護細胞的角色(Kuroda et al., 1992; Eshdat et al., 1997; Gouaze et al., 2001)，但是對於其活性染色方法的報導卻很 少。因此我們運用改良自 MP method (Ukai et al., 1997)在以聚丙醯胺 膠體電泳(PAGE)後來探討 GSH-Px 的活性。
首先用市售分離自牛紅血球的 GSH-Px 在 7.5 % 聚乙醯胺膠體上 加入 0.1, 0.25, 0.5 及 0.75 單位後跑電泳，進行完電泳後把其中一塊膠 體浸泡在 12.5 %的 TCA 中靜置 15 分鐘後，再用 Coomassie Brillian Blue R-250 染色；另兩塊膠體則分別以 FPF method 及 MP method 做 活性染色。在以 FPF method 上 GSH-Px 有活性的部分會在以藍色為 背景的 gel 中以透明的形式顯現出來，而 MP method 上 GSH-Px 有活 性的部分會在以紫色為背景的 gel 中以透明的形式顯現出來。而且在 加入 0.1 單位的 GSH-Px 就可以測到其活性(圖一 b 及圖一 c 的 Lane 1)。另外以 7.5 % SDS-PAGE，在 110 kDa 有一條 band (圖二 a)，而以 native PAGE 時卻只有一條 band，所以可以推斷出 GSH-Px 是一個同 型四聚體(homotetramers)。Gunzler 等人(1984)也指出從牛紅血球分離 出來的 GSH-Px 單體含有 198 個氨基酸，其分子量約為 21.9 kDa。 Shichi 及 Demar 等學者(1990)亦指出從牛纖毛體分離出來的 GSH-Px 以 SDS-PAGE 跑出來的分子量為 29 kDa，而以 gel filtration 其分子量 為 112 kDa。而在以 FPF method 活性染色中可以發現只有 110 kDa 的 band 有活性的顯現(圖二 b)，而以 MP method 做活性染色時，在加入 0.1 單位的 GSH-Px 就可以測到 110 kDa 的活性，而在加入 0.5 單位則 110 kDa 可以測到其活性(圖二 c)。也就是說本實驗在以修改自 MP method 來偵測 GSH-Px 活性時，所需要的量不需要太多，而且與 FDP
method 相比較，更能有效偵測到 GSH-Px 的活性。這是首次從 SDS-PAGE 中以 MP method 成功地將 GSH-Px 活性染色的發表。 接著將這個方法進一步加以運用，從薑塊莖萃取物以硫酸銨沈澱 分出四個不同的區段後，以 10 % SDS-PAGE，蛋白質染色(圖三 a)及 分別以 FPF method 和 MP method 做的 GSH-Px 活性染色。在 SDS-PAGE 中 1-4 行分別為薑塊莖萃取物 30-45, 45-60, 60-75, 75-90 % 硫酸銨沈澱的區段，且每一行固定load 24 μg蛋白質的量。我們可以 發現在以 FPF method 中找不到有 GSH-Px 活性的 band 出現(圖三 b)， 但是以 MP method 卻可以發現到數條有 GSH-Px 活性的 bands (圖三 c)。在運用 MP 活性染色方法後可以發現薑塊莖中可能含有幾個不同 的 GSH-Px 異構酶(isozyme)，但是 FPF method 則無法發現。從圖一 及圖二中可以看出以市售來的 GSH-Px 以及圖三從薑塊莖萃取出來的 粗抽物所做出來活性染色的結果發現，經修改過的 MP method 在本實 驗中 GSH-Px 活性染色的效果比 FPF method 好。利用這個方法可以 進一步尋找不同來源的 GSH-Px。 總之，這個新方法是一個可以在經過 native 或是 SDS-PAGE 後快 速且靈敏偵測 GSH-Px 活性的染色方法，僅利用這個方法可以在 gel 上就能判斷分子量大小及其活性染色，這個方法很適合被運用在不同 的生理條件中尋找並分離出動物性或是植物性 GSH-Px。
1 2 3 4 1 2 3 4 1 2 3 4
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圖一 a 圖一 b 圖一 c
圖一.市售之 GSH-Px 0.1, 0.25, 0.5 及 0.75 單位，經 7.5 % native PAGE，蛋白質染色(A)及以 FPF method (B)及 PM method (C)測得之 GSH-Px 不同濃度的活性染色。箭頭所標示為 GSH-Px 活性所在的 band。
M 3 1 2 3 1 2 3
←
←
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圖二 a 圖二 b 圖二 c
圖二.市售之 GSH-Px 0.1, 0.25 及 0.5 單位後再經 7.5 % SDS- PAGE， 蛋白質染色(A)及以 FPF method (B)及 PM method (C)測得之 GSH-Px 不同濃度的活性染色。箭頭所標示為 GSH-Px 活性所在的 band。
1 2 3 4 1 2 3 4 1 2 3 4
←
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圖三 a 圖三 b 圖三 c 圖三 (a)薑塊莖萃取物經硫酸銨沈澱後的蛋白質染色。(b) 以 FPF method 活性染色 及(c)以 PM method 活性染色。10 % 聚乙醯胺膠 體，Lane 1-4 各為薑塊莖萃取物之 30-45 %, 45-60 %, 60-75 %及 75-90%硫酸銨沈澱，每個 lane 含有 24 μg蛋白質。M 為 Sea Blue SDS-PAGE
第肆章 參考文獻
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第二部分
山藥塊莖儲藏性蛋白質對於心血管疾病
之預防–從調節血壓到改善血液流變之
研究
Studies on the yam tuber storage protein in
the protection of the cardiovascular
disease –from blood pressure regulation to
improvement of the hemorheology
第壹章 緒
論
一、山藥
山藥是薯蕷科薯蕷屬多年生纏繞性植物，別名淮山、薯蕷、淮藥 光條、山薯等。其塊莖肉質肥厚，成圓柱形，垂直生長，外皮成灰褐 色，生有鬚根。莖細長，蔓生，有稜，光滑無毛。葉對生或輪生，在 葉腋間常生珠芽，珠芽又稱零餘子。葉片形狀多變，三角狀卵形至三 角狀廣卵形，中央裂片，先端漸尖，兩側裂片成圓耳形，基部戟狀心 形，兩面均光滑無毛，葉脈7~9條基出，葉柄細長。花單性，雌雄異 株。花極小，黃綠色，穗狀花序，近無柄，苞片三角狀卵形。蒴果有 三翅，果翅長寬相等，種子扁，卵圓形，有膜質翅。7~8月開花，10 月結果。山藥之地下部分成兩類，根狀莖或塊莖，其形狀、顏色因種 類不同而異。塊莖的形狀變異較多，大致上可分為長形山藥、扁形山 藥和短形山藥，各個類型都有中間變異類型，變異之發生主要受遺傳 和環境的影響。山藥塊莖之全體部位都有不定芽，因此利用山藥塊莖 切段栽植，都可以長出新植株。 目前國內山藥之葉與塊莖之形狀與顏色有很大差異，可供辨識。 A. 大葉白肉類山藥：如山藥台農一號(D. alata) (圖四 a)、山藥台農 2 號(D. alata) (圖四 b)等，塊莖為長形或圓形，褐皮白肉，具有很高 的生產潛力，產量可達 20 - 40 t/ha。 B. 小葉白肉類山藥：如基隆山藥(D. pseudojaponica) (圖四 c)、恆春山 藥(D. doryophora)等等，塊莖為細長柱形，淡褐皮白肉，產量可達 20 t/ha。C. 紅肉類山藥：如名間長紅山藥(D. alata L. var. purpurea)(圖四 d)、 大紅品系(D. alata L. var. purpurea)等等，塊莖為長柱形，紫皮紫
肉，產量可達 20 - 40 t/ha。 山藥之生長環境要求溫暖氣候，其發芽適溫約為17 ~ 18 ℃，蔓 莖生長適溫約為25 ~ 26 ℃，新薯塊生長適溫約為22 ~ 23 ℃，故每年 1~2月為採收期。就雨量而言，在600 ~ 3,000 mm之降雨量地區，均可 栽植山藥。 神農本草經上記載，山藥味甘性溫，入脾、肺、腎經，主要用於 健脾、補肺、固腎、益精，治脾虛泄瀉、久痢、虛勞咳嗽、消渴、遺 精、帶下、小便頻數。 山藥塊莖的成分，一般而言水分含量約為65 –70 %，澱粉15 –20 %，粗蛋白6 –8 %，粗纖維1.2 - 1.8 %，粗灰份為2.8 - 3.8 %。其他尚 含有黏液質、鈣、磷、鐵、維生素C、皂苷、多酚氧化酶等等。 在最近的研究中，關於山藥的藥理研究陸續被發表：Vasiukova 等人(1977)發現D. deltoid中的steroid saponins具有抗黴菌的效果； Hikino等人(1986)從D. japonica萃取出dioscorans發現具有降血糖的作 用； Iwu等人(1990)發現D. dumetorum中的dioscoretine具有降血糖的 作 用 ； Aderiye 等 人 (1996) 發 現 D. alata 萃 取 物 有 抗 菌 的 效 果 ； Araghiniknam等人(1996)給予65-82歲的老年人服用Dioscorea營養補 充劑，發現血漿中DHEAS值、脂質過氧化都會增加，明顯的表現出 有 抗 氧 化 的 活 性 ； Hou 等 人 (1999) 發 現 D. batatas 中 的 dioscorin 有 carbonic anhydrase 以 及 trypsin inhibitor 的 活 性 、 dehydroascorbate reductase及monodehydroascorbate reductase的活性、清除自由基 (Hou et al., 2001)及抗氧化的活性(Hou et al., 2001, Hou et al., 2002, Chang et al., 2004)；Frindley等人(2001)發現D. cayenensis的萃取物可以降低 糖尿病鼠的血糖濃度；Hsu等人(2002)首度提出山藥在in vitro中有類
似 ACEI 降 血 壓 的 活 性 ； Lee 等 人 (2002) 發 現 懷 山 藥 (Rhizome Dioscoreae)有保護老鼠肝腎不被酒精傷害的效果，同時也發現D. alata 的水萃取物可以降低給予大劑量acetaminophen的老鼠肝腎壞死的作 用；Wang等人(2002)發現diosgenin有抗癌的活性；Ma等人(2002)也發 現diosgenin有抗高血脂的活性；Hu等人(2002)發現從D. collettii var. hypogluca中分離出來的protoneodioscin具有抗癌效果；Gao等人(2002) 發現D. bulbifera可以抑制JB6老鼠上皮癌細胞生長的作用； Wang等 人(2003)從D. futschauensis R. Kunth分離出來的prosapgenin B發現具 有抑制數種癌細胞生長的活性；Chen等人(2003)發現D. japonica Thunb var. pseudojaponica Yamamoto可以提高脂質的代謝；Choi等人 (2004)發現D. batatas中的mucopolysaccharide也可以增加免疫細胞的 活性；Chang等人(2005)發現D. alata cv. Tainung No.2有抗氧化的活 性；Kim等人(2004)發現D. tokoro有抗發炎的效果；Wang等人(2004) 發現D. alata的水萃取物可以保護DNA在copper-driven Fenton reaction 中不受到傷害； 2005年Wu等人在給予更年期後的婦女攝食山藥(D. alata)後也發現山藥有促雌激素分泌的作用； Ma等人(2005)也發現D. opposita有抗氧化及神經保護的作用；Yen等人(2005)發現D. villosa中 的 薯 蕷 皂 苷 元 (diosgenin) 有 誘 導 VEGF-A 的 表 現 而 促 使 血 管 增 生
(angiogenesis)的作用，另外也會在HCN-1A神經細胞外層刺激Ca2+-K+
電流(Wang et al., 2006)；McAnuff等人(2005)從D. polygonoides分離出 的 steroidal sapogenins 有 增 加 糖 尿 病 鼠 肝 臟 glucose-6-phosphate dehydrogenase的活性；2006年Fu等人也發現D. alata中的dioscroin在 macrophage有活化TLR4-signaling pathways而誘導cytokine的表現； Jeon等人(2006)發現D. batatas 中的dioscin對於腸道益菌有很大的幫
助。 在我國加入世界貿易組織(WTO)後，提升我國本土性農產品之競 爭力以維持本土農業的生存發展，如開發高價值藥用與保健植物，已 成為我國農業未來發展的趨勢，山藥在全球有六百多個物種，其中可 食性的有60多種，而台灣有15種，因此山藥是非常值得進行研究、探 討，加以開發利用為保健食品或具有特殊藥理作用之藥用植物。在由 行政院衛生署中醫藥委員會、中國醫藥大學及台灣省農業試驗所共同 主辦之「1999藥用植物之開發與利用研討會」中即將山藥列為重點栽 培作物之一。
二、高血壓
根據我國行政院衛生署 93 年國人的十大死因的統計，高血壓取 代肺結核擠進男性十大死因。目前偵測與評估有兩大系統，一是 JNC (Joint National Committee)美國監測評估及治療高血壓聯合委員會，另 一是 WHO (The World Health Organization)世界衛生組織。對於高血 壓的定義，JNC 分成兩期，持續性舒張壓(diastolic pressure)在 90 ~ 99 mmHg 或是收縮壓(systolic pressure) 140 ~ 159 mmHg 為 stage 1，收縮 壓在 160 mmHg 以上或是舒張壓大於 100 mmHg 以上，則為 stage 2。 而 WHO 把高血壓分成三期，收縮壓在 140 ~ 159 mmHg，舒張壓在 90 ~ 99 mmHg 則為第一級(輕度)，收縮壓在 160 ~ 179 mmHg，舒張 壓在 100 ~ 109 mmHg 則為第二級(中度)，收縮壓大於 180 mmHg，舒 張壓大於 110 mmHg 則為第三級(重度)。而高血壓主要又分為原發性 高 血 壓 (Essential hypertension) 和 次 發 性 高 血 壓 (Secondary hypertension)。原發性高血壓佔大多數，病因尚無法被明確斷定，一 般來講與家族性遺傳、鈉離子攝取過多、喝酒有關。次發性高血壓則 因其他疾病所引起，若這些疾病被治癒，則次發性高血壓也得以痊 癒。高血壓表面上沒有什麼症狀，但是慢性高血壓經常會導致鬱血性 心衰竭(CHF)、心肌梗塞、冠狀動脈硬化及腦血管病變。 目前臨床上治療高血壓的方式，首要目標是將血壓控制在 140/90 mmHg 以下，一方面改變生活形態，另一方面使用藥物來治療。在 生活方式的調適方面，病人必須採用高鉀、高鈣、低鈉的飲食方式， 並且要多運動，戒煙，減重，維持排便通暢，預防便秘，不用太冷 或太熱的水洗澡。而在藥物治療上，控制血壓的藥物大致上可分為 六大類型：(一)利尿劑(diuretic)：此類藥物可抑制離子傳送而減低腎
元(Renin)在各不同部位鈉離子的再吸收，結果造成鈉離子以及其他 離子隨著水分進入尿液中而達降壓效果。此類藥物的副作用會產生 高尿酸血症及鉀離子的流失等副作用。本類藥物有 indapamide、
trichlormethiazide 等。(二)β-阻斷劑(β-blocker)：此類藥物藉由降低心
輸出量而達到降低血壓的效果。他們能降低交感神經的傳收活性， 並抑制腎臟分泌 renin，而使得 angiotension II 的形成及 aldosterone
的分泌降低。所以 β-blocker 會產生中樞神經系統之副作用，例如憂
鬱、疲倦、昏睡、失眠，氣喘病人亦應避免使用。本類藥物有
propranolol、atenolol。(三)鈣離子管道阻斷劑(Ca2+ channel blocker，
CCB)：本類藥物主要作用在於血管平滑肌和心臟，抑制鈣離子進入 心肌、冠狀動脈及全身動脈之平滑肌細胞，使平滑肌張力降低及降 低血管的阻力。故心臟功能不佳的病人禁止使用。本類藥物有 verapamil、nifedipine、amlodipine、felodipine 等等。(四)血管收縮素 轉化酶抑制劑(angiotension converting enzyme inhibitor，ACEI)：本 類藥物主要經由降低周邊血管阻力而降低血壓，而且不會引起反射 性心輸出量、心跳速率或收縮力之增加。最常見的副作用為口乾、 皮疹、發燒及嗜中性白血球減少症。目前臨床上本類使用的藥物有 Captopril、Enalapril、Lisinopril、Fosinopril、Moexipril 及 Perindopril 等等。(五)血管張力素接受器拮抗劑(Angiotension receptor blockers， ARB)，這類藥物有 Irbesartan、Valsartan、Losartan 及 Telmisartan 等 等，其主要副作用有血管水腫、皮疹及咳嗽。(六)其他類，如血管擴 張降壓劑：例如 Hydralazine、Minoxdil，這類藥物會直接引起血管
擴張但卻會反射地增加心跳速率及心輸出量，另外還有 α-blockers
為首選藥，其次是使用 β-blockers、CCB、ACEI 以及 ARB，而在 Stage 2 時則建議一開始就使用兩種降壓劑來合併使用，JNC-VII 建議此兩 種降壓劑其一需為 thiazide 類利尿劑。 早在 1979 年就有學者從食品蛋白質分離出具有降低血壓功能的 胜肽，這些食品分離出來之胜肽的胺基酸序列不一定相同，長度也各 異。在醫學上使用的降血壓藥物多半是短鏈胜肽的類似物，如應用最 廣的 Captopril 就是 Ala-Pro dipeptide 的含硫衍生物。由食物中分離出 來的 ACEI 與化學合成藥物最大的差別在於醫用藥物的藥效非常強， 食品 ACEI 則效果沒那麼強烈，但相對副作用也較小(Saito et al., 1994; Yamamoto et al., 1997)，適合作為日常服用的保健食品。
一些肉類或是食物蛋白的水解產物，經過不同酵素水解後其中的 一些短鏈胜肽具有相當強的 ACE 抑制效果(Yamamoto et al., 1997)， 另外在清酒與酒渣(Saito et al., 1994)、醬油(Kinoshita et al., 1993)、發 酵乳品(Nakamura et al., 1995; Masuda et al., 1996)、水解鰹魚(bonito) 所得胜肽皆有 ACE 抑制的發表(Fujita et al., 1995)。
三、血管收縮素轉化酶
血管收縮素轉化酶(EC 3.4.15.1, angiotensin-converting enzyme, ACE)是一種含有鋅金屬的蛋白酶(Byers and Wolfenden, 1973)，在 1954 年時被 Skeggs 等人發現， 其分子量約為 140 - 160 kD (Lanzillo et al., 1976；Baudin et al., 1988)，廣泛存在於血管內皮組織、肺臟、腎 臟、心臟、腦、胰臟、睪丸等組織及器官中，其中以肺部血管的管腔 表面內皮細胞分佈最多，於腎素-血管收縮素系統(renin-angiotensin system，RAS)中扮演調控血壓的重要角色(Studdy et al., 1983)。
腎素-血管收縮素系統(renin-angiotensin system，RAS)主要的調控 機轉是當腎臟內遠曲小管滲透壓變小、血壓下降或是鈉離子傳輸減少 時，入球小動脈(afferent arteriole)中膜內的 J-G 細胞(juxtaglomerular cell)會分泌一種蛋白分解酵素-腎素(rennin)。腎素能將從肝臟所分泌 出來的血管收縮素原(angiotensinogen)水解成一段含有十個胺基酸胜 肽-血管收縮素 I (angiotension I，Ang I)。而 Ang I 會被 ACE 把 C 端 的 His-Leu 水解掉而變成含八個胺基酸的血管收縮素 II (angiotension II，Ang II) (Mullally et al., 1996)，Ang II 會使血管壁收縮(Brunner et al., 1988)，並且刺激腎上腺皮質分泌醛固酮(aldosterone)，醛固酮會使鈉 離子滯留，體液容積因此變大，腎動脈壓上升，而引起高血壓(圖五)。 而且 Ang II 與內皮細胞上的 angiotensin type-I (AT-1) receptor 結合，
促使 NAD(P)H 在 NAD(P)H oxidase 的作用下變成 NAD(P)+，增加
hydrogen peroxide (H2O2)及 superoxide anion (．O2)等活化氧族(reactive
oxygen species，ROS)的產生。目前這些活化氧族被認為會造成血管 發炎、粥狀動脈硬化、中風以及腎臟衰竭有關(McFarlane et al., 2003)。
四、自發性高血壓鼠(Spontaneous Hypertension Rat,
SHR)
西元 1963 年 Okamoto 與 Aoki 利用選擇性近親交配法(selective inbreeding)將帶有明顯高血壓的 Wistar Kyoto 雄鼠與輕微高血壓之雌 鼠雜交，再經過十幾代的培育後成功的分離出高血壓鼠(SHR)。SHR 雄鼠在第四週齡前血壓跟正常鼠沒什麼差別 ，其收縮壓(systolic pressure)約在 130 mmHg 左右，第 5~10 週其雄鼠之收縮壓明顯上升 至 200 mmHg 左右，最後血壓則維持在穩定的高值(圖六)。此品系最 常見的病理變化為結節性周圍動脈炎、心肌梗塞、心臟腫大及腎臟硬 化，因此 SHR 為試驗抗高血壓藥劑之動物模式。
五、血液流變
糖尿病是一種代謝異常的疾病，而且與紅血球的功能息息相關。 紅血球功能的改變會影響到身體的各個組織。一般而言，血糖是糖尿 病患各種慢性併發症的主要危險因子，由於血液流變產生變化的關係 會有循環系統的併發症，其血漿及血液黏度會增加(Ziegler et al., 1994; Tsukada et al., 2001)，紅血球硬度也會增加(Dintenfass et al., 1977) ， 另外紅血球凝集度、脂質過氧化(Kesavulu et al., 2001; Sekeroglu et al., 2000)也都會增加，而血漿和血液黏度增加會使紅血球的變形度降低 (Schmid-Schoenbein et al., 1976)。由於血漿蛋白、纖維原的增加以及 膜表面負電荷的降低，而使紅血球凝集度也增加 (McMillan et al., 1992)。膜上蛋白的糖化程度也會改變紅血球血液流變的特性(Wautier et al., 2001)。 血液在流動時受到血管壁作用的力，因此在血流內部會產生一種 力，稱為剪應力(Shear stress)，而血液與剪應力平行之平面單位時間 產生的移動量稱為剪切率(Shear rate)。剪應力與剪切率的比值就是黏 度(Viscosity)，也就是液體在層流時流體內部摩擦所造成之阻抗其流 動之一種表現，若在溫度恆定環境下，越接近管壁之流體則流速越慢 且黏度越高，離管壁越遠之流體則流速越快且黏度越低。血液流動狀 況受其血液黏度影響甚大，於低剪切率時，由於內部紅血球之聚集， 造成血液黏度上升，而於高剪切率時，紅血球被打散於血漿中，血球 聚集現象消失，其血液黏度趨於下降。黏度之數學定義為 τ(剪應力) η(黏度) = ---γ(剪切率)
黏度對於血流的影響，從Poiseuille’slaw (Pearsonet al., 2001)中 可以得知，血液流量與黏度成反比，而與血管半徑的四次方成正比。 Q = △Pπr4/8Lη = △P / vascular resistance * η Q：血流量 η：血液黏度 △P：血管兩端之壓力差 r：血管半徑 L：血管長度 血液由血漿、血球及其他蛋白質所組成，其黏度不僅取決於血液 的組成、成分的結構與性質、成分之間的相互作用外，還取決於血流 狀態，如剪切率等多種因素。於低剪切率時，儘管有輕微的剪切取向 效應，但紅血球顆粒的布朗運動使所有顆粒都處於無序狀態，黏度增 高。當剪切率增至一定程度時，剪切率所引起的顆粒取向作用遠遠超 過布朗運動的隨機效應，血液黏度則急遽下降。由於白血球與血小板 在未被活化前，所佔的相對體積分率非常低，因此對全血的黏度影響 最小，所以影響全血黏度的主要因素在於血漿及紅血球。下面幾項是 影響血液黏度的因素： (1) 血漿黏度：血液是由血球細胞與血漿所構成，血漿主要含有 92% 的水及 8 %的蛋白質及脂質，纖維蛋白原的結構是鍊狀，所以對 血漿的黏度影響最大。血漿的黏度增大，全血黏度亦增大(Danesh et al., 2000)。 (2) 血球容積比(Hematocrit；Hct)：為紅血球所佔全血的體積百分比， 一般男性之 Hct 為 41~53 %，女性為 36~46 %，因此它是決定血
液黏度大小的主要因素之一。血球容積比愈高，血液黏度亦愈高 (Danesh et al., 2000)。 (3) 溫度：血液的黏度會隨溫度上升而降低，因此血液的測量為配合 人體生理機制，控制在 37 ℃為標準(Barbee, 1973)。 (4) 紅血球的聚集：紅血球的聚集會受剪切率之影響。在低剪切率的 情況下，作用於紅血球表面的剪應力小，纖維蛋白原等血漿蛋白 會將紅血球橋連起來，進而使血液黏度增加，此聚集現象是由於 血漿蛋白質的關係，特別是纖維蛋白原的作用，使相鄰血球間形 成橋聯，以克服血球表面負電荷所產生的排斥力(Rakow et al., 1981; Schneditz et al..1987)，且其聚集體結構愈緊密，血液黏度也 就愈高，不過，當剪切率夠大時，聚集體將可以逐漸解聚，血液 黏度逐漸降地，流動性增強。 (5) 紅血球的變形：紅血球處於自由狀態時成雙凹圓盤形，細胞膜極 柔軟易變形。在剪切力作用下可變成橢圓球形等各種形狀。隨著 剪切率的增大，作用在紅血球的剪切力也增大，使紅血球沿流動 方向伸長，變成各種有利於流動的形狀。紅血球隨流動管道的形 狀，隨當時當地的流動狀況而改變其形狀。隨著剪切率增大，紅 血球變形度加大，有利於流動，使血液黏度降低。故高剪切率下 的黏度表徵於紅血球的變形，也就是說如果紅血球變形性差，則 在高剪切率時黏度增高(Stoltz, 1985)。 (6) 剪切率：牛頓流體，如血漿的黏度與流體中剪切率或剪應力無 關，是個常量。而非牛頓泥安流體，如血液的黏度隨血液中的剪 切 率 或 剪 應 力 增 大 而 減 小 ， 這 是 因 為 血 液 具 有 切 薄 特 性 (Whittington et al., 1982)。
(7) pH 值：pH 值下降時紅血球呈現球形變化，使膜中的 Spectrin 凝 集，紅血球膜硬度增加，變形度降低。體內組織缺氧和酸中毒時 會使紅血球內黏度增加，紅血球和血小板聚集性改變，促使血液 黏度進一步升高(Lux et al., 1977)。 事實上，以上因素都會相互影響，例如血漿蛋白質濃度的增加， 會影響血漿黏度及紅血球的聚集，使得全血黏度增加；然而血漿黏度 上升，卻會使得血球與血漿間的剪應力增加，造成血球易於變形，如 此則全血黏度有降低的影響。因此血液黏度的變化實際上是由這些因 子交互作用下的結果，而不是其中單一因子所能決定的。
六、血液黏度儀
本研究所使用之黏度計儀 HAAKE Rotation Rheometer RS-1, Germany)(圖七)，其主要結構為一甚小錐狀之 Cone 與 Cap 之底面保
持輕微接觸。圓錐狀的 Cone 與 Sample cap 之底面成一小角度 θ(本儀
器所使用之 Cone 的角度 θ為 1°) (圖八)，其工作原理是：Cone 在一 定的角速度下旋轉，透過測量施於 Cone 的錐狀斜面之力矩，再利用 力矩與剪應力(Shear stress, τ)之關係式(黏度(η)= 剪應力(τ)/剪切率(γ) = k *力矩/轉速)計算出剪應力(τ)及黏度值(η)。 對於此黏度計而言，優點是在一定角速度下，剪切率為一定值， 因此在一定之剪切率下可以量測出血液之黏度。本實驗所用之黏度計 的設計特點之一是使用空氣軸承支撐轉子軸，保持驅動杆處於中心位 置，確保以幾乎無摩擦的方式將施加應力傳達到檢體，使儀器可用剪 切速率範圍擴展到 10-4甚至 10-6 (sec-1)，在這種剪切率範圍尚能測得 有效的扭矩/剪應力數據，並換算得到黏度(Schramm et al., 1998)。量 測系統大致可分為硬體和軟體兩部分，硬體部分主要包括黏度測量主 機(含力矩測量系統、檢體傳感器及轉速控制與選擇系統等)、空氣壓 縮機、電腦、恆溫槽及角度 1°之 Cone 及 Plate。在操作模式上可分為 下列三種：
(1) CS (control stress) model：
CS model 即是控制剪應力的意思，其量測模式是利用剪應力大 小來控制 cone 之轉動而得到量測試樣之黏度值。對 1°和 2°之 Double cone 感應器而言，其量測範圍為 0.003450 Pa 到 690.0 Pa。
(2) CR (control rate) model：
控制 cone 之轉動而得到量測試樣之黏度值。對 1°和 2°之 Double cone 感應器而言，其量測範圍為 0.008378 Sec-1到 1005.0 Sec-1。 (3) OSC model： 此種量測之模式有異於前述兩種模式，通常用於量測流體之黏彈 性參數所用。對 1°和 2°之 Double cone 感應器而言，其量測範圍為 0.00001 到 100.0 Hz。 在本實驗之設計操作上，量測血液黏度值乃用 CR model，而量 測之方式乃是利用 Steady state 之方式測定剪切率與黏度的關係。溫 度設定在 37 ℃測剪應率 400 sec-1到 1 sec-1之黏度變化值。
七、紅血球變形測試原理
1978 年 McMillan 等人指出糖尿病病人紅血球會藉由膜上的改變 而影響血液的黏度，尤其是當紅血球要通過微血管時，紅血球的變形 能力扮演著很重要的角色。而紅血球變形對血液的流動有重大的影 響，是決定高剪切率下血液黏度的關鍵因素。血液流經大血管時，紅 血球在流體剪應力下變形，使紅血球的有效體積減少，血液黏度下 降，因而降低了血流的外週阻力，反之，當紅血球的變形能力降低， 則血液黏度升高，因而增加了血液的外週阻力，影響組織和器官的血 液供應。 正常的紅血球具有極大的變形能力，才能順利的通過體內直徑比 紅血球小的多的狹窄管道，使紅血球在整個循環中減少損傷和破壞。 如果紅血球變形能力降低，就通不過微循環，會被脾臟等網狀內皮系 統破壞。臨床上觀察到紅血球變形能力的的降低與許多疾病有關，例 如糖尿病(Attali et al., 1990; Garnier et al., 1990)、高血壓(Puniyani et al.,1991; Vaya et al., 1992)、鐮刀型紅血球貧血(Usami et al., 1975)、心 肌梗塞及其他一些血管疾病等等。紅血球變形能力的測定有好幾種方式，例如：(1)高剪切黏度儀 (High shear viscometer) (Skovborg et al., 1966)：這個技術的原理是建 立在高剪切率與低血容比的假說基礎上。紅血球分散在血液中而且只 有其變形度能影響血液的黏度。因此藉著觀察血液的黏度變化也能得 知紅血球的變形度。(2)紅血球核孔濾膜法(RBC filtration) (Hanss et al., 1983; Koutsouris et al., 1983)：這個方法被廣泛運用來測量紅血球的變 形度。一定量的紅血球數在給予一定壓力下，通過核孔濾膜的時間能 當 作 紅 血 球 變 形 及 凝 集 的 指 標 。 (3) 檢 電 器 (Rheoscope)
(Schmid-Schonbein et al., 1976)。在給予一個剪切力下直接觀察紅血球的形狀。 最近又發展出兩種以雷射繞射(Laser diffraction)為基本原理的測驗方 法(Bessis et al., 1980)，一個是以雷射輔助光學旋轉細胞分析儀(Laser assisted Optical Rotational Cell Analyzer (LORCA, Mechatronics, Amsterdam, Netherlands)) (Hardeman et al., 1994)；另一個方法是剪切 力測定儀(Shear Stress Diffractometer (Rheodyn SSD, Myrenne, Roetgen, Germany)) (Schmid-Schonbein et al., 1996)。這兩個方法都是用來測量 紅血球的變形。這兩個方法不同的地方是使用不同的裝置，LORCA 是以雷射光穿透稀釋的血液懸浮液，紅血球使雷射光產生繞射，獲得 紅血球繞射疊加而成的繞射圖樣，同時以光電轉換原理測定於動態繞 射圖繞射環內側橫軸和縱軸的兩個固定點的光密度(即以橫軸與縱軸 的光強度或者橢圓率來描寫紅血球的變化情況)，再按照變形公式求 得變形指數(DI level) (Schwartz et al., 1991; Riquelme et al., 2000)。 Rheodyn SSD 也是利用雷射的原理，將血液加入高黏度的 Dextran 裡，再將此懸浮液滴在一個可以轉動產生剪應力的盤子上，當盤子轉 動時，產生的剪應力使的紅血球變形，當雷射光射出後通過這些變形 的紅血球時產生不同的繞射圖樣，在兩軸相等距離上有四個等距的光 學 感 應 器， 光的強 度 被 感應 器記錄 以 測 量紅 血球的 長 度 和寬 度 (Martinez et al., 1998)，代入變形度的公式，求得紅血球的形狀。
DI = (IA –IB) / (IA + IB)
DI：Deformation Index, 變形指數
IA、IB：橫軸與縱軸上等距點 A,B 兩點的光強度
(在某剪應力下，若 DI = 0，則表示試樣中的紅血球不能變形，即 A=B； IB = 0 則 DI = 1，表示紅血球變形 100%；IA>IB，則 0<DI<1)
當轉盤不轉動時，紅血球處於靜態，成雙凹圓盤形，產生圓形繞 射圖樣。當轉盤轉動時，紅血球處於動態，在剪應力作用下成橢圓形， 產生橢圓形繞射圖樣，兩者的橢圓度相同，但方向相差 90°，即繞射 圖樣的長軸和短軸依次對應紅血球的長軸與短軸。在相同剪應力下， 紅血球的變形性愈好，繞射橢圓形圖樣愈瘦長(Wang et al., 1999)。用 雷射光繞射法測量紅血球變形性時，我們同樣可見紅血球變形作用是 剪應力的函數，其變形隨剪應力的增加而增加。 雷射光繞射法的優點是可以分析紅血球變形性與剪應力的關 係，也可以分析滲透壓對變形性的影響，同時其所需檢體量少(僅需 40 μl)，再現性較好。 本 實 驗 採 用 北 京 世 帝 科 學 儀 器 公 司 所 生 產 LG-B-190 型 Ektacytometer (圖九、十)。其量測記錄範例如圖十一，Rate 表示切變 率，AR 表示長軸變化量，BR 表示短軸變化量，DI 表示變形指數。 SSS 為透光度曲線下覆蓋面積表示變形能力。
八、紅血球聚集測試原理
糖尿病是一種代謝失調的疾病，而且與紅血球的功能有關。葡萄 糖是糖尿病患造成其他各種慢性併發症的主要危險因素，可以藉由改 變血液的流變而造成循環系統的併發症。糖尿病人的紅血球生命週期 降低(Ramana Deviet et al., 1997 )，而且膜上的生化性質也會改變 (Watala et al., 1993)。也有報導指出糖尿病患因為新陳代謝差而降低 紅血球膜上酵素的活性(Gonzalez Flecha et al., 1990)。
整體來講糖尿病人的血漿和血液黏度都會增加，而造成紅血球的 變形度降低、血漿蛋白質改變及紅血球的凝集(Schmid-Schoenbein et al., 1976)，血液中的纖維蛋白原也會提高 20 - 40 %，血球的沈降速率 也會增加。增加紅血球凝集是造成低剪應力、增加血液黏度及提高血 液沈降速度的主要因素。 正常的紅血球於生理狀態下，由於其球膜表面存有糖鏈上的唾液 酸(Sialic acid)、蛋白上的氨基酸之羧基及帶陰電性的磷脂質而呈現一 負電性結構，正常人的紅血球所帶負電荷為 2.45 x 10-6 Zeta 電位，由 於同電性相斥，使得紅血球彼此分散，而形成一均勻之懸浮乳液。若 改變紅血球或其所處血漿溶劑之 pH 值及離子強度等特性，可能會影 響紅血球膜上之電性斥力，進而影響紅血球之聚集。 目前對於紅血球評估，有三個方法： (1) 光學顯微鏡透射法：光學顯微鏡透射法之原理乃是利用紅血球 分散及紅血球聚合時以量測光源透射比之方法，在操作上將血 液置放於 cone and plate 之黏度儀上，利用黏度儀來控制轉動之 剪應力由同轉速，反逆轉使中心紅血球保持靜止狀態，再由光 通過中心測其透射光源之變化，一般而言，光源透射比愈小顯
示紅血球聚集程度愈明顯(Mchedlishvili et al., 1993) (2) 低剪切率下量測血液黏度法 低剪切率時血液黏度上升其主要因素即為紅血球聚集所造成之 影響。因此 Brook 等人遂利用此一方式發展出以比較模式來表 示紅血球聚集與黏度之關係式 ηagg /η0agg R ＝ η /η0 R 為聚集比 ηagg /η為相同 Hct 下紅血球聚集和無聚集分散相之黏度 η0agg /η0為相同 Hct 下紅血球聚集和無聚集連續相之黏度 (3) 動態光學法 懸浮液中紅血球處於分散狀態時透光率較小，當紅血球聚集存在 時，則散射光的量隨紅血球數的下降而降低，使透光率增高。儀 器先在 600 sec-1的剪切率下剪切 15 秒，使紅血球分散，然後在 靜止條件下(剪應力突然停止)透光度先降低(由於分散懸浮液細 胞的失取向所致)，後透光度增高，反應紅血球聚集。此時記錄 之透光率隨時間變化的曲線，可用來評估紅血球的聚集能力。在 本研究中量測紅血球聚集便是使用這個方法。其測量原理為當懸 浮液中颗粒處於分散狀態時透光率較小，當紅血球聚集體存在 時，則散射光的量随粒子數的下降而降低使透光率增高。本儀器 先在 600 s-1的切變率下剪切 15 秒,使血液中的紅血球解聚，然後
在靜止條件下測定紅血球的聚集程度。如圖十二，A 段(0-5s)為 靜止狀態血球聚集，B 段(5-20s)為聚集體定向，C 段(20-35s)表示 高切變率下血球解聚，D 段(35-205s)表示突然停止轉動後血球聚 集過程，以透光度曲線下覆蓋面積表示聚集強度。此時紀錄透光 率隨時間變化的曲線，可用來測定紅血球聚集能力。一份血樣可 在 205 秒內完成測定。
a. b.
c. d.
e.
圖四. 各種山藥塊莖示意圖。a. 台農一號山藥塊莖 b. 台農二號山 藥塊莖 c. 基隆山藥塊莖 d. 名間山藥塊莖 e. 日本山藥塊莖
圖五. 腎素-血管加壓素系統(Renin-angiotensin system) (摘自 Zaman et al., 2002)
圖六. 雌雄 SHR 在 5-40 週齡血壓變化的情況。(摘自 Yamori et al., 1976)
圖十一. 紅血球變形測試範例
Rate 表示切變率，AR 表示長軸變化量，BR 表示短軸變化量，DI 表 示變形指數。SSS 為透光度曲線下覆蓋面積表示變形能力。
圖十二. 紅血球聚集測試範例 A 段(0-5s)為靜止狀態血球聚集 B 段(5-20s)為聚集體定向
C 段(20-35s)表示高切變率下血球解聚
第二章 實驗材料與方法
一、山藥儲藏性蛋白質(Dioscorin)的分離純化
(Hou et al.,2000)
1. 實驗材料
台農一號（Dioscorea alata L. cv. Tainong No.1） 台農二號（Dioscorea alata L. cv. Tainong No.2） 日本山藥（Dioscorea batatas Decne）
基隆山藥（Dioscorea pseudojaponica Tamamoto） 名間山藥（Dioscorea alata L. var. purpurea） 以上均購自中央市場 2. 試藥及儀器 A. 萃取緩衝液 20 mM Tris buffer (pH 8.3) 1% Vitamin C 1% PVPP 10 mM EDTA˙2Na B. 平衡緩衝液 20 mM Tris buffer (pH 8.3) C. 沖提緩衝液
20 mM Tris buffer (pH 8.3)，含 0.15 M NaCl D. 均質機
