KASTAMONU’DAN TOPLANAN DİPLOİD (T. monococcum) VE TETRAPLOİD (T. dicoccum) KAVUZLU BUĞDAY KÖY ÇEŞİTLERİNİN MOLEKÜLER VE MORFOLOJİK TANIMLANMASI

(1)

FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ

TARLA BİTKİLERİ BÖLÜMÜ ANABİLİM DALI

KASTAMONU’DAN TOPLANAN DİPLOİD (T. monococcum) VE

TETRAPLOİD (T. dicoccum) KAVUZLU BUĞDAY KÖY

ÇEŞİTLERİNİN MOLEKÜLER VE MORFOLOJİK

TANIMLANMASI

(Yüksek Lisans Tezi)

Hazırlayan

Fatih DEMİREL

Danışman

Doç. Dr. Taner AKAR

Yrd. Doç. Dr. Kahraman GÜRCAN

Eylül 2013

(2)

FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ

TARLA BİTKİLERİ BÖLÜMÜ ANABİLİM DALI

KASTAMONU’DAN TOPLANAN DİPLOİD (T. monococcum) VE

TETRAPLOİD (T. dicoccum) KAVUZLU BUĞDAY KÖY

ÇEŞİTLERİNİN MOLEKÜLER VE MORFOLOJİK

TANIMLANMASI

(Yüksek Lisans Tezi)

Hazırlayan

Fatih DEMİREL

Danışman

Doç. Dr. Taner AKAR

Yrd. Doç. Dr. Kahraman GÜRCAN

Eylül 2013

(3)

(4)

(5)

(6)

TEŞEKKÜR

Bana geleceğimde de faydası olacağını düşünerek yüksek lisans tez konumun belirlenmesinde yardımcı olan ve her aşamada yardımcı olup kolaylık sağlayan danışman hocam Sayın Doç. Dr. Taner AKAR’a saygı ve teşekkürlerimi sunarım. Çalışmalarım boyunca farklı bakış açıları ve bilimsel katkılarıyla beni aydınlatan, değerli bilgi ve tecrübelerini esirgemeyen ikinci danışman hocam Sayın Yrd. Doç. Dr. Kahraman GÜRCAN’a teşekkürü bir borç bilirim.

Bu tez çalışmasın da bilgi ve kaynaklarını benimle paylaşan hocalarım Sayın Yrd. Doç. Dr. Mahmut KAPLAN ve Arş. Gör. Oğuzhan UZUN’a teşekkür ederim.

Materyal temininde yardımcı olan Kastamonu Üniversitesi öğretim üyesi Sayın Doç. Dr. H. Güran ÜNAL’a teşekkür ederim.

Laboratuvar çalışmalarımda ve bu tez için araştırma yapmamda yardımcı olup istatistiksel program ve moleküler bilgilerini benimle paylaşan sevgili Biyolog Serap COMART’a teşekkürlerimi sunarım.

Bazı deneysel çalışmalarımda benimle geç saatlere kadar çalışan ve her türlü yardımı esirgemeyen dostum Ziraat Mühendisi Ahmet SAY’a teşekkür ederim.

Ayrıca; çalışmalarım süresince sabır göstererek beni daima destekleyen aileme en içten teşekkürlerimi sunarım.

Fatih DEMİREL Kayseri, Eylül 2013

(7)

KASTAMONU’DAN TOPLANAN DİPLOİD (T. monococcum) VE TETRAPLOİD (T. dicoccum) KAVUZLU BUĞDAY KÖY ÇEŞİTLERİNİN MOLEKÜLER VE

MORFOLOJİK TANIMLANMASI

Fatih DEMİREL

Erciyes Üniversitesi, Fen Bilimleri Enstitüsü Yüksek Lisans Tezi, Eylül 2013 Danışmanlar: Doç. Dr. Taner AKAR

Yrd. Doç. Dr. Kahraman GÜRCAN

ÖZET

Bu çalışmada, ülkemizin önemli gen merkezlerinden birisi olan gernik (T. dicoccum) ve siyez (T. monococcum)’in morfolojik ve moleküler özellikleri incelenmiştir. Kastamonu’dan gelen materyallerin tarla gözlemi sonucu 9’unun tetraploid (T. dicoccum), 14’ünün diploid (T. monococcum) olduğu ve bu genotipler ile yapılmış çalışmada morfolojik özellikler bakımından ortalama: Bitki boyu 21.9 cm, başak uzunluğu 1.9 cm, başaktaki dane sayısı 22.1 adet, başak verimi 0.52 g, bitki verimi 0.64 g, biyolojik verim 1.85 g, hasat indeksi % 34.24, başaklanma süresi 73.18 gün, olgunlaşma süresi 107.2 gün, bin dane ağırlığı 38.4 g, protein oranı % 17.54 olarak saptanmış olup kalitatif özelliklerde ise tüylülük oranının T. dicoccum’ larda % 100 iken T. monococcum’larda % 22.2 olarak, mumsuluk oranının T. dicoccum’ larda % 88.8 iken T. monococcum’larda % 44.4 olarak belirlenmiştir. ISSR işaretleyicileri kullanılarak moleküler karekterizasyon analizleri gerçekleştirip uygun istatistiksel programla akrabalık ilişkilerinin incelenmesi sonucu 23 Kastamonu popülasyonu ile 9 tescilli çeşidin genotipleri arasında ortalama Dice benzerlik katsayısı 0.553 olarak bulunmuştur. Kullanılan 14 ISSR primeri ile ortalama polimorfik bant sayısı 10.21 olup ortalama polimorfizm oranı ise % 95.42 olduğu hesaplanmıştır.

Anahtar Kelimeler: Gernik, Siyez, Kavuzlu Buğday, morfolojik ve moleküler tanımlama, polimorfizm, Islah, ISSR

(8)

MORPHOLOGICAL AND MOLECULAR CHARACTERIZATION OF EINKORN (T. monococcum) AND EMMER (T. dicoccum) WHEAT LANDRACES

COLLECTED FROM KASTAMONU PROVINCE Fatih DEMİREL

Erciyes University, Natural and Applied Science Institute Master Thesis, September 2013

Advisor: Associated Professor: Taner AKAR

Co-Advisor: Assistant. Professor: Kahraman GÜRCAN

ABSTRACT

In this research, einkorn (T. monococcum) and emmer wheat (T. dicoccum) collected from Kastamonu province of Turkey, primary gene center for these two species, were characterized at morphological and molecular level. Based on the morphological data, 9 of them were distinguished as emmer wheat (T. dicoccum) while the other 14 population as einkorn (T. monococcum). Mean for plant height, spike height, grain per spike, spike yield, plant yield, biomass, harvest index, heading time, maturity time, 1000 kernel weight and protein ratio was 21.9 cm, 1.9 cm, 22.1, 0.52 g, 0.64 g, 1.85 g, 34.24 %, 73.18 days, 107.2 days, 38.4 g, 17.54, respectively. In addition to these, variation among some qualitative parameters such as hairiness was 100 % in emmer wheat while 22.2 % for einkorn, and waviness on the spike was 88.8 % for emmer wheat while % 44.4 for einkorn. Moreover, molecular characterization based on ISSR markers showed that mean Dice similarity coefficient among 9 bread and durum wheat cultivars and hulled wheat landraces collected from Kastamonu province was calculated as 0.553. Additionally, mean polymorphic loci for 14 ISSR primers and mean polymorphism rate were 10.21 and 95.42 %, respectively.

Key words: Emmer wheat, einkorn, hulled wheat, morphological and molecular characterization, polymorphism, breeding, ISSR

(9)

İÇİNDEKİLER

KASTAMONU’DAN TOPLANAN DİPLOİD (T. monococcum) VE TETRAPLOİD (T. dicoccum) KAVUZLU BUĞDAY KÖY ÇEŞİTLERİNİN MOLEKÜLER VE

MORFOLOJİK TANIMLANMASI

Sayfa

BİLİMSEL ETİĞE UYGUNLUK SAYFASI... i

YÖNERGEYE UYGUNLUK SAYFASI ... ii

KABUL VE ONAY SAYFASI... iii

TEŞEKKÜR ... iv

ÖZET ... v

ABSTRACT ... vi

İÇİNDEKİLER... vii

KISALTMA VE SİMGELER ... x

TABLOLAR LİSTESİ... xii

ŞEKİLLER LİSTESİ ... xiii

GİRİŞ ... 1

1. BÖLÜM GENEL BİLGİLER 1.1. Buğdayın Türkiye’de ve Dünya’daki Tarihi... 4

1.2. Çalışmada Kullanılan Moleküler İşaretleyiciler... 6

1.3. Önceki Çalışmalar... 6

2. BÖLÜM MATERYAL VE YÖNTEM 2.1. Materyal ... 15

(10)

2.1.1. Bitki Materyali... 15

2.1.2. Deneme Yılına Ait İklim ve Toprak Verileri ... 15

2.2. Yöntem ... 18

2.2.1. Bitki Materyalinin Ekimi, Bakımı ve Hasadı ... 18

2.2.2. İncelenen Morfolojik ve Tarımsal Özellikler... 18

2.2.2.1. Morfolojik ve Tarımsal Verilerin Analizi... 20

2.2.3. Genomik DNA İzolasyonu ... 21

2.2.3.1. DNA Yoğunluğunun Belirlenmesi ... 22

2.2.4. ISSR Analizleri ... 22

2.2.5. PZR Ürünlerinin Büyüklüklerine Göre Ayrılması... 25

2.2.6. Moleküler Verilerin Analizi ... 25

3. BÖLÜM BULGULAR 3.1. Morfolojik Özellikler ... 28

3.1.1. Bitki Boyu... 29

3.1.2. Başak Boyu... 29

3.1.3. Başakta Dane Sayısı... 31

3.1.4. Bin Dane Ağırlığı ... 31

3.1.5. Biyolojik Verim... 33 3.1.6. Başak Verimi... 33 3.1.7. Bitki Verimi... 34 3.1.8. Hasat İndeksi ... 35 3.1.9. Protein Oranı ... 35 3.1.10. Başaklanma Süresi... 36 3.1.11. Olgunlaşma Süresi ... 37 3.1.12. Kulakçık Rengi... 38 3.1.13. Tüylülük ... 38 3.1.14. Mumsuluk ... 38 3.1.15. Büyüme Habitusu ... 39 3.1.16. Kavuzluluk ... 39

3.2. Moleküler (ISSR) Verileri... 43

(11)

3.2.2. Kastamonu Köy Çeşitleri İle Tescilli Çeşit Buğdayların Tanımlanması ... 45 3.2.3. ISSR Verileri İle Elde Edilen UPGMA Dendogramının Değerlendirilmesi ... 56 3.2.4. Moleküler Verilere Dayalı Temel Bileşenler Analizinin Değerlendirilmesi ... 58

4. BÖLÜM

TARTIŞMA-SONUÇ ve ÖNERİLER

4.1. Tartışma, Sonuç ve Öneriler... 61 KAYNAKLAR ... 64 ÖZGEÇMİŞ ... 72

(12)

KISALTMALAR VE SİMGELER ABD : Amerika Birleşik Devletleri

AFLP : Amplified Fragment Length Polymorphism (Niceliksel özellik lokusu) bç : Baz çifti

o_C _{: Santigrat} cm : Santimetre

CTAB : Setiltri-metil amonyum bromür

da : Dekar

dATP : Deoksiadenozin trifosfat dCTP : Deoksisitidin trifosfat dGTP : Deoksiguanozin trifosfat dH2O : Distile su

dk : Dakika

DNA : Deoksiribonükleik asit trifosfat dNTP : Deoksiribonükleotit

dTTP : Deoksitimidin trifosfat EDTA : Etilen diamintetraasetikasit

g : Gram

HCI : Hidrojen klorür

ISSR : Internal Simple Sequence Repeats (Basit Dizi Tekrarları Arası) kg : Kilogram

m : Metre

MgCI2 : Magnezyum klorür mg : Miligram ml : Mililitre mm : Milimetre mM : Milimolar M.Ö. : Milattan önce N : Azot ng : Nanogram (NH4)2SO4 : Amonyum sülfat

(13)

nm : Nanomol

NTSYS : Numerical taxonomy multivariate analysis system (Değişkenli Sayısal Taksonomi Analiz Sistemi)

P2O5 : Fosfor pentoksit

PZR : Polimeraz Zincir Reaksiyonu

RAPD :Random Amplified Polymorphic DNA (Rastgele Çoğaltılmış Polimorfik DNA)

RFLP :Restriction fragment length polymorphism (sınırlayıcı enzim parça uzunluğu çeşitliliği)

rpm : Revolutions per minute (dakikadaki devir sayısı) sn : Saniye

SRAP : Sequence-Related Amplified Polymorphism (Sekansa Bağlı Çoğaltılmış Polimorfizm)

SSR : Simple Sequence Repeats (Basit Dizi Tekrarları) TBE : Tris-borate-EDTA

TE : Tris-EDTA

Tris : Hidrosimetil Aminometan µl : Mikrolitre

UPGMA : Unweighted pair group method using arithmetic averages (aritmetik ortalamayı kullanan ağırlıksız çift grup metodu)

(14)

TABLOLAR LİSTESİ

Tablo 2.1. Kayseri İli 2012 Yılı ve Uzun Yıllar Ortalamalarına Ait İklim Verileri... 16

Tablo 2.2. Denemenin Kurulduğu Yerin Toprak Özellikleri ... 16

Tablo 2.3. Bu Çalışmada Kullanılan Genotiplerin Kökenine Ait Mevcut Bilgiler. ... 17

Tablo 2.4. Analizlerde Kulanılan ISSR Primerleri... 23

Tablo 2.5. Analizlerde Kullanılan ISSR Primerleri İçin PZR Döngüleri ... 26

Tablo 3.1. Araştırmada Kullanılan Genotiplerin Morfolojik Özellikleri (a)... 39

Tablo 3.2. Araştırmada Kullanılan Genotiplerin Morfolojik Özellikleri (b) ... 40

Tablo 3.3. Araştırmada Kullanılan Genotiplerin Morfolojik Özellikleri (c)... 41

Tablo 3.4. Araştırmada Kullanılan Genetik Materyallerde İncelenen Kalitatif Özellikler... 42

Tablo 3.5. 32 Popülasyon İçin ISSR Primerleri Kullanılarak Elde Edilen Bant Profilleri.. ... 44

Tablo 3.6. ISSR Verilerine Göre 23 Popülasyon ve 9 Çeşitte DICE Benzerlik Katsayı Değerleri. ... 46

(15)

ŞEKİLLER LİSTESİ

Şekil 2.1. Morfolojik Verilerin Analizinde Kullanılan Temel İstatistiksel Formüller . 21

Şekil 2.2. Çalışmanın Yapıldığı Laboratuvardan Genel Görünüm... 27

Şekil 3.1. Denemenin Genel Görünüşü... 28

Şekil 3.2. Diploid (Siyez) ve Tetraploid (Gernik) Türlere Ait Başak Şekilleri... 31

Şekil 3.3. Diploid (Siyez ) ve Tetraploid (Gernik) Türlere Ait Danelerin Görünüşü... 32

Şekil 3.4. ISSR UBC–813 Primeri Jel Görüntüsü ... 49

Şekil 3.14. ISSR UBC–851 Primeri Jel Görüntüleri ... 54

Şekil 3.17. ISSR UBC-840 Primeri Jel Görüntüleri ... 55

Şekil 3.18. 32 Buğday Genotipinde DİCE Benzerlik İndeksinden Yararlanılarak Oluşturulan UPGMA Dendogramı... 57

Şekil 3.19. 32 Buğday Genotipinde ISSR Verileriyle Yapılan Temel Bileşenler Analizi Sonucu Elde Edilen İki Boyutlu Grafik... 59

Şekil 3.20. 32 Buğday Genotipinde ISSR Verileriyle Yapılan Temel Bileşenler Analizi Sonucu Elde Edilen Üç Boyutlu Grafik... 60

(16)

GİRİŞ

Buğday grubu olarak adlandırılan Triticum ve Aegilops, Gramineae familyasının Triticeae oymağına girmektedir. Triticum kromozom sayısına göre diploid (2n=14), tetraploid (2n=28) ve hekzaploid (2n=42) olmak üzere üç gruba ayrılır [1]. Kültürü yapılan buğdaylar diploid; T. monococcum ssp. monococcum (2n=14, AA), iki tetraploid; T.turgidum ssp. dicoccoides (2n=28, AABB) ve T. timopheevii (2n=28, AAGG) ve bir hekzaploid buğday; T. aestivum (2n=42, AABBDD) olarak dört grup altında toplanır. Kullanım alanlarına göre bu türler farklı şekilde sınıflandırılabilmektedirler. Hekzaploid buğdaylar ekmek, baklava, börek ve pasta ile bisküvi yapımında, tetraploid buğdaylar ise makarna ve bulgur yapımında yoğun olarak kullanılmaktadır. Diploid buğdayları ise günümüzde çok az olmakla birlikte bulgur ve makarna yapımında kullanılmaktadır.

Buğday insan beslenmesi için gerekli olan başta kalori ve azda olsa proteinin bir kısmını karşılamakta olup, dünya nüfusunun % 35’ini oluşturan yaklaşık 40 ülkenin temel gıda maddesidir [2]. İnsanların değişen tüketim alışkanlıkları ve gelişen teknolojiye bağlı olarak, buğday ürünleri çeşitlenmiş ve tüketici istekleri de değişmiştir. Buğdayın en yaygın tüketim şekilleri un, ekmek, makarna, irmik, bisküvi, bulgur ve eriştedir. Dünya’da ve Türkiye’de bu ürünlerin dışında geleneksel ürünler, tatlılar, nişasta vb. amaçla da tüketimi yapılmaktadır [2]. Halk arasında kaplıca buğdayı olarak bilinen Triticum monococcum üzerinde son yıllarda yoğun çalışmalar yapılmaktadır. Özellikle diploid özelliğe sahip olması ve elde edilecek bilgilerin rahatlıkla makarnalık ve ekmeklik buğday ıslahına uygulanabilirliği, araştırıcılar gözünde kaplıca buğdayını çok cazip hale getirmiştir. Kaplıca buğdayının ilk defa nerede kültüre alındığı sorusuna cevap vermek için Heun ve ark. [3] tarafından yaklaşık 1400 yabani kaplıca (T. monococcum ssp. boeoticum) buğdayı ile kaplıca (T. monococcum ssp. monococcum)

(17)

buğdayı arasında karşılaştırmalı DNA analizleri yapılmıştır. Yapılan analizler sonucunda kültür formuna en yakın popülasyonun Karacadağ/Diyarbakır bölgesinden toplanan popülasyon olduğu sonucuna varılmıştır. Farklı araştırıcılar tarafından yapılan morfolojik analizlerde kaplıca buğdayının biotik ve abiotik stress koşullarına dayanıklı olduğu ve bunların buğday ıslahında kullanılabileceği ifade edilmiştir [4, 5, 6]. Kaplıca buğdayı hem makarnalık hem de ekmeklik buğdayın yapısında bulunan A genomunu taşımaktadır. Bundan dolayı makarnalık ve ekmeklik buğday ıslahında genetik çeşitliliği arttıracak yeni bir gen kaynağı olarak görülmektedir [7].

Bitki genetik kaynaklarının tanımlanmasında morfolojik işaretleyiciler (markörler), biyokimyasal işaretleyiciler ve DNA işaretleyicileri yoğun olarak kullanılmaktadır. Özellikle, morfolojik işaretleyiciler çevre koşullarının etkisi altında kalabildiklerinden ve sınırlı sayıda olmalarından dolayı tanımlama çalışmalarında kullanımı sınırlıdır. Aynı şekilde biyokimyasal işaretleyicilerin de polimorfizm seviyesinin düşük olması, bunların kullanımını sınırlandırmaktadır.

Bitki gen kaynaklarının karekterizasyonunda DNA işaretleyici sisteminin seçimi; araştırmanın amacına göre, popülasyonun yapısına, çalışılan bitki türün çeşitliliğine, işaretleyici sisteminin çalışılacak laboratuvarda bulunma durumuna, analiz için gerekli zamana ve maliyete bağlı olarak değişir. Her bir sistem üstünlük ve eksikliklere sahiptir. Birçok bitki türünde çeşitler arasındaki genetik varyasyonu ortaya çıkarmakta hangi moleküler DNA tekniğinin en uygun olduğunu belirlemek amacıyla RFLP, AFLP, RAPD, SSR ve ISSR DNA işaretleyici teknikleri karşılaştırılmış ve polimorfizm bakımından SSR ve AFLP teknikleri, maliyet bakımından RAPD ve ISSR teknikleri, tekrarlanabilirlik bakımından RFLP, SSR, ISSR ve AFLP DNA tekniklerinin daha üstün oldukları belirlenmiştir [8]. Bunların yanısıra çalışılacak laboratuvar olanakları göz önünde bulundurulduğunda RAPD, SSR ve ISSR yöntemlerinin radyoaktif madde kullanımının olmadığı ve koşulların sınırlı olduğu laboratuvarlarda rahatlıkla kullanılabileceği bildirilmiştir [8, 9, 10]. Ziedkiewicz ve ark. [11] tarafından geliştirilen ISSR moleküler işaretleyicileri birçok kültür bitkisinde genetik çeşitliliği saptamak için kullanılmıştır [12, 13, 14, 15, 16, 17, 18].

(18)

Güneydoğu Anadolu bölgesi buğday gen kaynakları bakımından oldukça önemli bir bölgedir. Özellikle son yıllarda yapılan çalışmalarla, kaplıca (T. monococcum) ve makarnalık buğdayın (T. durum) Karacadag/Diyarbakır da ilk kültüre alınmış olduğunun gösterilmesi, bu konu ile uğraşan bilim adamlarının ilgisini bu bölgeye çekmiştir [19, 20]. Özellikle Şanlıurfa, Adıyaman, Gaziantep, Diyarbakır ve Mardin illeri çevresinde bulunan yabani buğday gen kaynaklarının toplanması ve bunların tanımlanmalarının yapılması oldukça önemlidir. Özkan ve ark (yayınlanmamış veri) son üç yılda yapmış oldukları bitki toplama gezisinde Triticum ve Aegilops türlerini toplamış ve kayda geçirmişlerdir. Özellikle ileriye dönük buğday ıslahı çalışmalarında abiyotik ve biyotik gen kaynakları olarak kullanılması için toplanan bu materyal üzerinde gerekli çalışmaların yapılması gerekmektedir.

Bu çalışma ile 1960’ lı yıllarda ülkemizin özellikle kırsal ve dağlık alanlarında 1.000.000 dekar alanda yetiştiriciliği yapılırken son yıllarda bu ekiliş oranı % 10 seviyesine gerileyen ülkemizin önemli gen merkezlerinden birisi olan siyez (T. monoccoccum) ve gernik (T. dicoccum)’ in Kastamonu’dan toplanan popülasyonlarının moleküler tekniklerden ISSR yöntemi kullanılarak genotipik tanımlamasına ek olarak agromorfolojik yönden önemli özellikleri de ortaya konmuştur. Bu çalışma aynı zamanda kuraklık dayanıklılığı, yabancı ot rekabeti ve her türlü olumsuz toprak koşularına rahat uyum sağlayan ve yüksek besleyicilik özelliğine sahip ve ihmal edilen buğday türlerinin elde edilecek veriler ışığında ülkemizde ıslah programlarının başlatılmasına katkı sağlaması amaçlanmıştır.

(19)

1. BÖLÜM

GENEL BİLGİLER

1.1. Buğdayın Türkiye’de ve Dünya’daki Tarihi

Günümüzden 12 bin yıl önce göçebe insan toplulukları, eski dünyada uzun süren buzul çağının ardından gelen daha elverişli iklim koşulları sayesinde sayıca çoğalmaya ve doğada hazır bulduklarından daha fazla yiyeceğe gereksinim duymaya başladılar. Bunlar arasında, bugün "Verimli Hilal" dediğimiz bölgede yaşayanlar diğerlerine göre daha şanslıydılar. Çünkü bu bölge başta buğday ve arpa olmak üzere pek çok tahılın yabani atalarının merkezidir ve insanların küçük, ama elde etmesi kolay ve besleyici değeri yüksek buğday ve arpa tanelerini fark edip diyetlerine ve yaşamlarına katmaları kadar doğal bir şey olamazdı. Önceleri bu iki tahılı doğadan toplarken, zaman geçtikçe kendileri ekip biçmeye başladılar. Bu durum, günümüzden bakınca algılanması zor büyüklükte bir sonucu beraberinde getirdi: İnsanlar, var oldukları ilk günden beri, binlerce yıldır sürdürdükleri göçebe avcı-toplayıcı hayat biçiminden yerleşik-üretici yaşama geçtiler, çünkü ekim ve hasat aynı yerde uzun süre kalmayı gerektiriyordu. Büyük olasılıkla, uzunca bir süre her iki yaşama biçimi de beraberce götürüldü, ama sonunda, günümüzden yaklaşık 10 bin yıl önce yeryüzünde tarım yapılan ilk insan köyleri Güneydoğu Anadolu’da ve kuzey Suriye’de görülmeye başladı [21, 22, 23, 24, 25]. Suriye’deki Abu Hüreyra ve Türkiye’deki Cafer Höyük, Çayönü, Nevali Çori gibi arkeolojik ören yerleri bu ilk tarım köyleri arasındadır. Bundan sonraki 1500 yıl içinde de buğday tarımı güneye (Örneğin Ürdün Vadisi’ndeki Beidha), doğuya (İran’daki Jarmo ve Ali Kosh) ve batıya (Orta Anadolu’daki Aşıklı Höyük, Can Hasan III ve Çatalhöyük) yayıldı [22]. Avrupa’da ele geçen en eski kültür buğdayı örnekleri Yunanistan’dan elde edilip M.Ö. 5900 yıllarına tarihlenenlerdir [21, 22]. Neolitik (Yenitaş Çağı) olarak adlandırılan bu döneme ait yerleşmelerden, düzenli olarak ele

(20)

geçen buğday kalıntıları tarımın, artı ürünün, yerleşik yaşamın ve toplumsal değerlerin ortaya çıkmaya başladığı ilk zamanlarda buğdayın insanlar için vazgeçilmez yerine işaret etmektedir. Daha sonraları Anadolu’da görülmeye başlanan siyasi yapılanmalar ve büyük devletler döneminde ise buğdayın ekonomik ve kültürel önemi geride bıraktıkları büyük miktarlardaki buğday stokları ve kayalara oydukları dinsel sahnelerden izlenebilmektedir. Örneğin, Anadolu’daki en eski ve ilk imparatorluğu kuran Hititlerin Çorum yakınlarındaki başkenti Hattuşa’da, M.Ö. 13. yüzyıla tarihlenen 4200–5900 ton kapasiteli buğday siloları bulunmuştur [26]. Yine Hititlere ait Konya yakınlarındaki İvriz Kaya Kabartması ise buğdayın toplumsal ve dinsel önemine işaret ediyor. Van’a bağlı Patnos’ta, M.Ö. 800-700’lere tarihlenen Urartu tapınak ve sarayının yakınlarında da ortaya çıkarılan zahire siloları ve ele geçen buğday kalıntıları [27] benzer geleneklerin Anadolu’da bin yıllar boyu devam ettiğine işaret etmektedir. Buğday, Anadolu’da yer alan tüm uygarlıklarda, günümüze kadar önemini korumuştur.

Buğday, insan yaşamını ekonomik ve kültürel olarak etkilerken, insan da buğdayın evrimini etkilemiştir. İlk tarım köylerinde ekilen iki çeşit buğday vardı: Siyez (Triticum monococcum) ve gernik (Triticum dicoccum). Bunlar, yabani atalarına göre biraz daha iri taneli ama yine yabaniler gibi kavuzlu ve başağı taşıyan sapları yarı kırılgan yapıda türlerdi. Daha sonraki dönemlerde ise iri taneli, uzun boylu ve kavuzsuz, bu nedenle işlemesi çok daha kolay iki tür ortaya çıktı: makarnalık buğday (Triticum durum) ve ekmeklik buğday (Triticum aestivum). Buğdayın geçirdiği bu genetik ve fiziksel değişiklikler, insanların kendi işlerine yarayan özellikteki buğdayları seçerek bir sonraki yıl ekmek üzere ayırmaları ile başlayıp zaman içinde birikerek oluşan yapay ve doğal seçim baskısının sonucudur. Ekmeklik ve makarnalık buğday, bugün tüm dünyada ekimi yaygın olarak yapılan iki türdür. Türkiye’nin bazı yüksek bölgelerinde ise çok kısıtlı miktarda da olsa, çoğunlukla hayvan yemi olarak siyez ve gernik tarımına rastlanmaktadır. Dünyanın başka bölgelerinde de yöresel iklim ve toprak koşullarına uygun, kısıtlı miktarda üretimi yapılan başka buğday türleri ya da alttürleri mevcuttur. Ayrıca, Avrupa’daki kavuzlu spelt buğdayı gibi (Triticum spelta) geçmişte çok yaygın olarak ekilirken sonradan makarnalık ve ekmeklik buğdaylar ile yeri değiştirilen ve kaybolan buğday türleri de vardır.

(21)

Ülkemiz yabani buğday türlerinin (Aegilops sp.) genetik çeşitlilik merkezidir. Orta Doğu ve ona komşu Akdeniz çevresi ile Batı Asya, 22 yabani buğday türünün yayılım gösterdiği alandır. Ancak 14 tür ile bunların en yoğun biçimde bir arada bulunduğu coğrafya ülkemizdir [25]. Ülkemizin her köşesinde rastlayabileceğimiz yabani buğday türleri, hem buğdayın ıslahı, yayılışı ve evrimi ile ilgili çalışmalarda hem de günümüzdeki makarnalık ve ekmeklik buğdayların kalitelerinin artırılması amacıyla yapılan genetik iyileştirme çabalarında büyük önem taşımaktadır. Günümüze ait yabanıl ve ilkel (siyez) buğday örnekleri üzerinde yapılan çalışmalar, Diyarbakır’daki Karacadağ bölgesinin siyez çeşidi buğdayın tarımının başladığı yer olduğunu göstermiştir [23]. Bu önemli çalışma, ülkemizdeki buğday varlığı ve çeşitliliği üzerine kapsamlı araştırmalar yapılması gereğini göstermektedir. Böylece, ülkemizin buğday tarihi, gelişimi ve iyileştirilmesi konularındaki henüz keşfedilme aşamasında olan büyük potansiyelini kullanma olanağı doğacaktır.

1.2. Çalışmada Kullanılan Moleküler İşaretleyiciler

Moleküler işaretleyiciler, genomda bir gen bölgesine ait DNA parçası veya biyokimyasal madde olarak tanımlanmaktadır [28]. Moleküler işaretleyiciler kaynağını bitkinin kendi hücrelerinde bulunan DNA’dan alır. Bitki popülasyonlarındaki çeşitlilik ve bu bireyler arasındaki ilişkileri belirlemede % 100’e yakın sonuç verir [29]. Moleküler işaretleyiciler gen kaynaklarındaki bireylerin tanımlanması ve tekrarların (duplikasyonların) önlenmesi, akrabalık ilişkilerin belirlenmesi, haritalama ve seçim (seleksiyon) amacıyla kullanılmaktadır [28]. Moleküler işaretleyiciler; çevre faktörlerinden etkilenmemesi, çekirdek ve farklı kalıtım şekline sahip kloroplast ve mitokondri gibi organel genomları ayrı ayrı çalışılabilmesi, genetik değişiklikleri daha fazla yansıttıkları için daha az pleiotrofik (bir genin birden fazla karakteri kontrol etmesi) olması, her bir anaçtan gelen farklı karakterler tespit edilebilmesi nedeniyle bitkilerin genetik kökenini tespit edilebilmesi ve sonsuz sayıda moleküler işaretleyici elde edilebilmesi gibi üstünlüklere sahiptirler [29].

(22)

Empilli ve ark. (1995), T. monococcum ssp. monococcum, T. monococcum ssp. boeoticum, T. monococcum ssp. sinskajae alt türlerinin 1344 genotipinde morfolojik varyasyonu inceledikleri çalışmada, toplam 17 morfolojik ve kalite özelliği incelediklerini, başaklanma süresi, bitki boyu, 1000 dane ağırlığı ve SDS sedimastasyon değerinin 1344 genotip içinde büyük varyasyon gösterdiğini saptayarak, bu genetik materyal içinde iyi agronomik özelliklere sahip T. monococcum ssp. monococcum genotiplerinin belirlendiğini bildirmişlerdir [30].

Bernard ve ark. (1997), RAPD işaretleyicisini kullanarak Türkiye, İran ve İsrail kökenli toplam 20 yabani arpa (Hordeum spontaneum) popülasyonunu temsil eden 88 genotipde genetik çeşitliliği araştırdıkları çalışmada, 33 RAPD primeri kullandıklarını, bunlardan 22’sinin skorlanabilir bant üretebildiğini, primer başına 1 ile 11 arasında polimorfik bant düştüğünü ve incelenen 88 genotipten sadece 4 adedinin DNA parmak izi bakımından birbirine benzediğini bildirerek, toplam genetik çeşitliliğin popülasyon içinde % 75, popülasyonlar arasında ise % 25 olarak bulunduğunu saptamışlardır [31].

Cao ve ark. (1998), RAPD işaretleyicisini kullanarak 69 T. spelta ve 32 T. macha buğday türlerinde türler arası ve tür içi genetik çeşitliliği belirlemek için yaptıkları araştırma, 10 RAPD primeri kullandıklarını, bu veriler ile Jaccard genetik benzerlik katsayısını hesapladıklarını ve kümeleme analizi yaptıklarını, bu analizi sonucunda her iki türün coğrafik kökenleri ile uyumlu olarak bulunduğunu, T. macha’nın T. spelta’dan daha fazla genetik çeşitliliğe sahip olduğunu bildirerek, RAPD işaretleyicisinin buğday gen kaynaklarının tanımlanmasında ve gen bankalarında tekrarlanmış örneklerin belirlenmesinde rahatlıkla kullanılabileceğini bildirmişlerdir [32].

Chabane ve ark. (1999), AFLP işaretleyicisini kullanarak Suriye’nin kuzey (Aleppo) ve güney (Sweida) bölgesinden toplanmş 6 T. urartu genotipi ile diğer bölgelerden toplanmş 12 T. urartu genotipi arasındaki genetik varyasyonu inceledikleri çalışmada, AFLP primerlerinin toplam 176 bant ürettiğini, bant uzunluklarının 50 ile 300 baz çifti (bç) arasında değiştiğini, AFLP verilerine göre yapılan kümeleme analizinde kuzey ve güney bölgelerinden toplanan 6 genotipin diğer genotiplerden ayrı bir grup oluşturduğunu bildirerek, T. urartu’daki genetik çeşitliliğin bölgelere göre farklılık gösterdiğini saptamışlardır [33].

(23)

Cao ve ark. (1999), RAPD tekniğinin yanlış sınıflandırılmş buğday örneklerini yeniden sınıflandırılmasında kullanılabilirliğini araştırdıkları çalşmada; morfolojik olarak T. macha veya T. vavilovii ismiyle sınıflandırılmş olan ve yanlış sınıflandırıldığı şüphelenilen 12 genotip ile kontrol genotiplerini RAPD işaretleyicileri ile analiz ettiklerini, incelenen 12 genotip içinden 5 adedinin T. turgidum ssp dicoccum, 1 adedinin T. timophevii ssp. timophevii ve 6 adedinin T. monococcum ssp. monococcum olduğunu tespit ettiklerini, bu sonuçların yapılan sitolojik analizler ile de desteklendiğini bildirerek, RAPD işaretleyicilerinin buğday materyalinin sınıflandırılması ve bazı türlerin belirlenmesinde rahatlıkla kullanılabileceğini bildirmişlerdir [34].

Doğrar ve ark. (2000), 7 SSR primeri kullanarak 5 kışlık makarnalık çeşit ile 7 ileri hat arasındaki genetik çeşitliliği belirlemek için yaptıkları bir çalışmada, 7 SSR lokusunun tüm çeşitlerde homozigot bulunduğunu, WMS6 primerinin tüm çeşitlerde iki bant ürettiğini, tüm genotiplerin 7 SSR primeri kullanılarak ayrılabildiğini, allel sayısının 5 ile 13 arasında değiştiğini, polimorfizim bilgi içerme değerinin 0.609 ile 0.872 arasında değiştiğini bildirerek, sadece 3 SSR primeri kullanılarak (WMS6, WMS30 ve WMS120) tüm genotiplerin birbirlerinden ayırtedilebildiğini saptamışlardır [35].

Büyükünal-Bal (2001), Türkiye’de yaygın olarak yetiştirilen ekmeklik buğday çeşidi Gerek-79’un DNA’sında 29 arpa mikrosatellitinin uygulanabilirliğini araştırdığı çalşmada, 29 arpa mikrosatelliti kullanılarak yapılan PZR ile farklı uzunlukta PZR ürünleri elde edildiğini, özellikle HVM 15, HVM 20, HVM 23, HVM 26, HVM 31, HVM 36, HVM 40, HVM 44, HVM 54 ve HVM 62 isimli mikrosatellitlerin dikkati çektiğini saptayarak, arpa mikrosatellitlerinin buğday çeşitleri arasında genetik çeşitliliği belirlemede rahatlıkla kullanılabileceğini bildirmiştir [36].

Liu ve Wendel (2001), ISSR işaretleyicilerinin pamuk bitkisinde uygulanabilirliğini araştırdıkları çalışmada, ISSR ’ların pamukta kalıtım düzeyinin yüksek olduğunu ve pamuk bitkisinde ISSR işaretleyicilerinin hem tür içi hem de türler arası genetik ilişkileri araştırmada rahatlıkla kullanılabileceğini saptamışlardır [37].

(24)

İncirli ve Akkaya (2001), Türkiye orjinli 9 kışlık ve 6 yazlık makarnalık buğday çeşidinde genetik çeşitliliği AFLP işaretleyicileri ile inceledikleri bu araştırmada, 18 AFLP primerlerinin 189 adet polimorfik bant ürettiğini, primer çifti başına polimorfik bant sayısının 4 ile 24 arasında değiştiğini, AFLP verileri kullanılarak Nei’e göre hesaplanan genetik uzaklık değerlerine göre Berkmen–469 ile Diyarbakır–81 çeşitlerinin en uzak, Selçuklu–97 ile Sofu çeşitlerinin de en yakın çeşitler olduğunu bildirerek, elde edilen sonuçların çeşitlerin pedigri bilgileriyle uyum içersinde olduğunu bildirmişlerdir [38].

Stojalowski ve Goral (2002), Triticum timopheevi sitoplazmasına sahip sitoplazmik erkek kısır 5 triticale genotipi ile 3 triticale çeşidinde RAPD ve ISSR işaretleyicileri kullanarak genetik çeşitliliği inceledikleri çalışmada, 34 RAPD ve 10 ISSR primeri kullandıklarını, her iki DNA işaretleyicisinin de düşük seviyede polimorfizim gösterdiğini bildirerek, incelenen genotipler için genetik çeşitliliğin düşük olduğunu saptamışlardır [39].

Fernandez ve ark. (2002), RAPD ve ISSR işaretleyicilerini kullanarak farklı ülkelerden gelen 16 arpa çeşidinin filogenetik akrabalık ilişkilerini inceledikleri çalışmada, 10 RAPD primerinin 125, 10 ISSR primerinin ise 228 bant ürettiğini, S10 isimli RAPD primeri ile 811, 820, 835 ve 881 nolu ISSR primerlerinin incelenen tüm çeşitleri rahatlıkla ayırabildiğini, RAPD ve ISSR verileri kullanılarak yapılan kümeleme analizi sonucunda çeşitlerin yazlık/kışlık ve altı sıralı/iki sıralı olarak gruplandığını belirterek, RAPD ve ISSR işaretleyicilerinin DNA parmak izi analizlerinde kullanılabilecek DNA işaretleyiciler olduğunu bildirmişlerdir [40].

Pujar ve ark. (2002), 63 tetraploid buğday genotipini ISSR işaretleyicisi ile tanımlamak için yaptıkları çalışmada; 100 ISSR primerini seçilen 7 genotipte ön taramaya tabi tuttuklarını, ön analiz sonucunda 15 ISSR primerinin seçildiğini, 15 ISSR primerinin toplam 134 bant ürettiğini, üretilen bu 134 bantın 129’unun polimorfik bulunduğunu, primer başına elde edilen toplam bant sayısı ile polimorfik bant sayısının sırasıyla 8.93 ve 8.60 olduğunu, ISSR verileri ile yapılan kümeleme analizi sonucunda 4 farklı grubun oluştuğunu bildirerek, ISSR‘ların makarnalık genotipler/çeşitler içindeki genetik varyasyonu belirlemede başarı ile kullanılabileceğini saptamışlardır [41].

(25)

Akar (2002), RAPD işaretleyicileri kullanarak Türkiye’nin farklı bölgelerinden toplanmş 10 tane makarnalık yerel çeşidi ile 3 tane tescilli makarnalık buğday çeşidi arasında genetik benzerliği araştırdığı çalışmada, 10 baz dizilimine sahip 15 RAPD primeri kullandıklarını, bunların toplam olarak 92 adet DNA bantı ürettiğini, bunlardan sadece 12 tanesinin monomorfik, 80 tanesinin ise polimorfik bant olduğunu, yerel çeşitler içinde genetik çeşitliliğin tescilli çeşitlere göre yüksek bulunduğunu, genetik benzerlik katsayısının 0.74 ile 0.99 arasında değiştiğini, morfolojik karakterler bakımından da yerel çeşitlerde yüksek derecede varyasyon olduğunu bildirerek, incelenen yerel çeşitlerden bazılarının makarnalık buğday ıslahında kullanılabileceğini bildirmiştir [42].

Galvan ve ark. (2003), ISSR işaretleyicileri kullanarak Fransa orjinli 3 ve Arjantin orjinli 10 kültür fasulyesi arasındaki genetik ilişkileri araştırdığı çalışmada, 23 ISSR primeri kullanmş ve bu primerlerin 9 adedinin polimorfik olduğunu, bu polimorfik ISSR primerlerin 75 adet polimorfik bant oluşturduğunu, oluşan bantların büyüklüklerinin 300–2400 bç (baz çifti) arasında değiştiğini, ISSR verilerine göre yapılan kümeleme analizinde 13 fasulye çeşidinin iki ana gruba ayrıldığını, bu iki ana grubun da Andean ve Mesoamerican gen kaynaklarını temsil ettiğini bildirerek, ISSR’ların fasulye çeşitlerinin DNA parmak izlerinin çıkarılmasında başarı ile kullanılabileceğini ortay koymuşlardır [43].

Tanyolaç (2003), ISSR ve RAPD markörlerini kullanarak, Türkiye'nin batısından toplanmş 15 yabani arpa (Hordeum spontaneım) popülasyonu arasındaki genetik ilişkileri araştırdığı çalışmada, 55 RAPD ve 10 ISSR primeri kullandığını, her iki yöntemin kullanılmasıyla 55 polimorfik bant elde edildiğini, ISSR ve RAPD verilerine göre yapılan kümeleme analizi sonucuna göre iki farklı grubun saptandığını, en yakın genetik ilişkinin (GU=0.192) ile Pınarbaşı ve Bornova popülasyonları arasında, en uzak genetik ilişkinin ise (GU=0.926) ile İçmeler ve Aydın popülasyonları arasında bulunduğunu bildirerek, her iki dominant DNA işaretleyicinin arpa’da genetik varyasyonu saptamada etkili bir şekilde kullanılabileceğini bildirmiştir [44].

El-Maati ve ark. (2004), 28 ekmeklik buğday çeşidinde ISSR’ları kullanarak genetik çeşitliliği araştırdıkları çalışmada; 6 adet di-nukleotit tekrara sahip ISSR primeri

(26)

kullandıklarını, bu primerler içinden SN39-F2 primerinin en yüksek polimorfik bant ürettiğini, ISSR verileri kullanılarak yapılan kümeleme analizi sonucunda ekmeklik buğday çeşitlerinin coğrafik bölgelere göre gruplandıklarını bildirerek, ISSR markörünün buğdayda genetik çeşitlilik belirleme çalışmalarında başarı ile kullanılabileceğini saptamışlardır [45].

Rodriguez-Quijano ve ark. (2004), 39 kaplıca (T. monococcum ssp. monococcum) buğdayında waxy proteinlerini inceledikleri çalışmada, incelenen tüm kaplıca genotiplerinin bir ekmeklik buğday çeşidi olan “Chinese Spring” in sahip olmuş olduğu Wx-A1a alleline sahip olduklarını bildirerek, kaplıca genotiplerinde amilaz içeriğinin % 22 ile % 35 arasında değiştiğini bildirmişlerdir [46].

Budak ve ark. (2004), SSR, ISSR, SRAP ve RAPD DNA markörlerini kullanarak Buchloe dactyloides (manda otu) biyotiplerinde genetik çeşitliliği araştırdıkları çalışmada; ortalama genetik benzerliğin SSR’da 0.52, ISSR’da 0.51, SRAP’da 0.62 ve RAPD’te 0.57 olarak bulunduğunu, kullanılan 4 farklı DNA sisteminin birbiri ile karşılaştırılması sonucunda RAPD ile SRAP markörleri arasında en yüksek korelasyon değerinin r=0.73 olarak saptandığını bildirerek, amaca uygun DNA markör seçmede kullanılacak kriterin araştırmanın yapılacağı alt yapıya göre değişeceğini saptamışlardır [47].

Maric ve ark. (2004), RAPD işaretleyicileri, morfolojik özellikler ve çeşitlerin pedigri kayıtlarını kullanarak 14 Hırvatistan ekmeklik buğday hattı arasındaki genetik farklılığı ortaya çıkartmak için yaptıkları araştırmada, 36 RAPD primerini test ettiklerini ve bunlardan 14 RAPD primerinin polimorfik olarak bulunduğunu, 14 RAPD primerinin 341 polimorfik bant ürettiğini, morfolojik analiz için 12 özelliğin kullanıldığını, pedigri verisi olarak geriye dönük anaçların karşılaştırıldığını bildirerek, RAPD işaretleyicisinin ekmeklik buğday çeşit ve hatları arasında yüksek polimorfizm gösterdiğini ve test edilen yöntemler arasında istatistiki olarak önemli bir farkın olmadığını bildirmişlerdir [48].

Roy ve ark. (2004), AFLP işaretleyicileri ile morfolojik özellikleri kullanarak 55 ekmeklik buğday çeşidinde genetik çeşitliliği araştırdıkları çalışmada, elde edilen 615 AFLP bantının 287’sinin polimorfik (% 46.6) olduğunu, fizyo-morfolojik özellikler ile

(27)

verim ve verim unsurlarını içeren morfolojik özelliklerin çeşitler bazında varyasyon gösterdiğini saptayarak AFLP işaretleyicilerinin morfolojik özelliklere göre genetik çeşitliliği belirlemede daha üstün olduğunu saptamışlardır [49].

Hang ve ark. (2005), ISSR işaretleyicileri kullanarak 17 Aegilops ve Hordeum türleri içindeki genetik çeşitliliği araştırdıkları çalışmada, 8 ISSR primerinin kullanılmasıyla Aegilops içerisinde 102 polimorfik bant elde edildiğini, 24 ISSR primerinin kullanılmasıyla ise Hordeum’da 247 polimorfik bant gözlendiğini, ISSR verileri kullanılarak yapılan kümeleme analizinde iki türün birbirinden rahatlıkla ayrıldığını bildirerek, ISSR’ların yabani buğday ve arpa türlerinin filogenetik analizlerinde kullanılma potansiyelinin yüksek olduğunu bildirmişlerdir [50].

Carvalho ve ark. (2005), ISSR‘lar ile üç farklı türlerarası melezlemelerin (Makarnalık buğday x Tritordeum; Ekmeklik buğday x Tritordeum; Triticale x Tritordeum) parmak izini belirlemek için yaptıkları araştırmada, 30 ISSR primeri kullandıklarını, kullanılan 15–20 ISSR primerinin farklı türlerarası melezleri DNA seviyesinde birbirlerinden ayırabildiğini saptayarak, ISSR DNA markör tekniğinin F1 kombinasyonlarının saflığını belirlemede rahatlıkla kullanılabileceğini saptamışlardır [51].

Salimi ve ark. (2005), Buğdaya A genomu vericisi olan T. urartu’nun İran’daki dağılım alanını tesbit etmek için yaptıkları arazi çalışmasında, ilk defa İran’ın farklı bölgelerinde T. urartu’nun bulunduğunu, bu gezide toplanan A genomuna sahip diğer diploid buğdayın içinde de farklı alt varyetelerinin de tanımlandığını bildirmişlerdir [52].

Sica ve ark. (2005), ISSR’ları kullanarak İtalyan orjinli Asparagus acutifolius çeşitleri arasında genetik varyasyonu araştırdıkları çalışmada, 23 ISSR primeri kullandıklarını, 23 ISSR primerinin 228 polimorfik bant ürettiğini, ISSR verileri kullanılarak yapılan kümeleme analizinde çeşitlerin coğrafik orjinlerine göre ayrıldığını bildirerek, ISSR‘ların Asparagus türünde amaca yönelik kullanılabileceğini saptamışlardır [53].

Bilgin ve Korkut (2005), Bazı ekmeklik buğday (Triticum aestivum) çeşit ve hatlarının genetik uzaklıklarının belirlenmesi amacı ile yaptıkları çalışmada; kullanılan 10 baz uzunluğundaki 10 RAPD primerinden iyi sonuç veren 5’inin değerlendirmeye alındığını, primerler genelinde, genotiplerin çoğaltılan bant sayılarının 2–11 adet

(28)

arasında değiştiğini, en fazla polimorfik bant sayısının T5 primerinden elde edildiğini, ekmeklik buğday genotiplerinde en düşük benzerlik oranının 0.365 ile Mv–17 ve ME–2 arasında, en yüksek genetik benzerliği de IBWSN–69 ve MV–17 çeşitleri arasında 0.946 ile bulunduğunu bildirmişlerdir [54].

Pirseyedi ve ark. (2006), İran’da “Sardari ” çeşidinden elde edilmiş 35 genotipte SSR işaretleyicileri ile morfolojik özellikler arasındaki ilişkiyi araştırdıkları çalışmada, moleküler analiz için 60 SSR primeri, morfolojik analizler içinde 7 morfolojik özellik kullandıklarını, primer başına allel sayısının 2 ile 6 arasında değiştiğini, primer başına polimorfik bilgi içeriğinin 0.11 ile 0.83 arasında saptandığını, SSR ve morfolojik verilere göre yapılan kümeleme analizinın 35 buğday hattını 5 gruba ayrıldığını belirleyerek, SSR verileri ile yapılan kümeleme analizindeki grupların morfolojik veriler ile yapılan kümeleme analizdeki gruplara göre daha tekdüze (homojen) olduğunu saptamışlardır [55].

Alvarez ve ark. (2006), SDS-PAGE ve A-PAGE metodlarını kullanarak İspanya orjinli T. monococcum ssp. monococcum genotiplerinde tohum depo proteinlerinin farklı allellerini araştırdıkları çalışmada, Glu-A1m için 3 farklı allelin, Glu-A3m için ise 6 allel saptadıklarını, Gli-A1m ve Gli-A2m lokusları için de sırasıyla 7 ve 14 allelin saptandığını, genotipler içinde bu alleler için varyasyonun olduğunu bildirerek, bu allellerin buğday ıslahında kaliteyi geliştirmede kullanılabileceğini bildirmişlerdir [56].

Karagöz ve ark. (2006), Türkiye’nin değişik bölgelerinden toplanan kimi yabani buğday türlerinin (Aegilops L. ve Triticum L.) agro-morfolojik karekterizasyonunu inceledikleri araştırmada; farklı türe ait popülasyonları bitki boyu, başaklanma gün sayısı, gelişme formu, bitki başına sap sayısı ve başak uzunlukları bakımından karakterize etmişler ve en yüksek değişim katsayısının sap sayısında, en düşük değişim katsayısının ise gelişme formunda bulduklarını, kümeleme analizi ile türlerin kendi özel gruplarında yer aldığını, birbirine çok yakın alanlardan toplanan örnekler arasında bile farklılıklar olduğunu bildirerek, gen bankası (ex-situ) koruma programlarında mümkün olan en geniş varyasyonu yakalamak için mutlaka sık aralıklarla örnekleme yapılmasının gerekli olduğunu saptamışlardır [57].

(29)

Martins-Lopes ve ark. (2007), ISSR ve RAPD’lar ile 30 Portekiz ve 8 yabancı orjinli zeytin (Olea europaea L.) çeşitlerinde genetik çeşitliliği belirlemek için yaptıkları çalışmada, 20 RAPD primerinin toplam 301 bant ürettiğini ve bunun da 262’sinin polimorfik olduğunu, 17 ISSR primerinin ise toplam 204 bant ürettiğini ve bunun da 180’inin polimorfik olduğunu, her iki DNA markörü tekniğinde de polimorfizm oranının benzer bulunduğunu (RAPD için % 88; ISSR için % 87), primer başına polimorfik bant sayısının RAPD’de 13.1 adet, ISSR’da ise 10.6 olduğunu bildirerek, hem RAPD hem de ISSR markör tekniğinin zeytin çeşitlerini birbirinden ayırmada rahatlıkla kullanılabileceğini bildirmişlerdir [58].

Motawei ve ark. (2007), ISSR ve RAPD işaretleyicilerini kullarak 12 ekmeklik buğday hattı ile 2 ekmeklik buğday çeşidinde (Yecora Rojo ve West Bread) genetik çeşitliliği araştırdıkları çalışmada, RAPD analizi sonucunda 42 bant elde edildiğini ve bunun 31’inin polimorfik bulunduğunu (% 71), ISSR analizinde ise toplam 28 bant elde edildiğini ve bunun da 19’unun polimorfik olarak saptandığını (% 67.8), RAPD ve ISSR verilerini kullanarak yapmş oldukları kümeleme analizinde ise ekmeklik buğday hat ve çeşitlerinin pedigrilerine göre kümelendiğini bildirerek bu iki DNA markörünün amaca uygun buğday ıslahında kullanılabileceği sonucuna varmşlardır [59].

Gülbitti ve ark. (2007), Türkiye’nin farklı bölgelerinden toplanmş Triticum aestivum, T. dicoccoides, T. urartu ve T. monococcum ssp. boeoticum türlerinde AFLP işaretleyicilerinin kullanarak genotipik tanımlama, polimorfizmi ve filogenetik ilişkileri inceledikleri çalşmada, 33 AFLP primer kombinasyonunun 875 polimorfik bant oluşturduğunu, polimorfik bantlardan 133’ünün T. monococcum ssp. boeoticum’a, 66’sının T. urartu’ya ve 141’inin T. dicoccoides’e özel bant olduğunu, T. monococcum ssp. boeoticum, T. urartu ve T. dicoccoides’ te polimorfizm oranlarının sırasıyla; % 42.63, % 32.34 ve % 27.71 olarak bulunduğunu bildirerek, T. urartu’nun T. dicoccoides ve T. aestivum’un progenitörü olduğunu bildirmişlerdir [60].

(30)

2. BÖLÜM

MATERYAL VE YÖNTEM

2.1. Materyal

2.1.1. Bitki Materyali

Bu tez çalışmasında kullanılan materyaller; Erciyes Üniversitesi Ziraat Fakültesi Tarla Bitkileri Bölümü tarafından Kastamonu’dan toplanmış 23 adet kavuzlu tetraploid (T. dicoccum ) ve diploid (T. monococcum) buğday popülasyonu ile 4 makarnalık ve 5 ekmeklik buğday çeşidinden oluşmaktadır. Kullanılan bitki materyali hakkında mevcut bilgi Tablo 2.3’de verilmiştir.

2.1.2. Deneme Yılına Ait İklim ve Toprak Verileri

Araştırmanın yapıldığı Kayseri ilinde, yazları kurak ve sıcak, kışları yağışlı ve soğuk tipik bir karasal iklim hakimdir. Araştırmanın yürütüldüğü Nisan 2012-Ağustos 2012 dönemi ve bu döneme ait uzun yıllar ortalama iklim değerleri Tablo 2.1.’de verilmiştir. 2012 yılı sıcaklık verileri ile materyalin ekili olduğu dönemleri değerlendirildiğinde aylık sıcaklık ortalamaları yönünden uzun yıllara göre Ağustos ayı hariç diğer dönemler daha sıcak geçmiştir. Özellikle Nisan ayı ortalama sıcaklığı yaklaşık 3 oC daha sıcak geçerken uzun yıllar ortalamasına göre 9 kat daha az yağış alınmıştır. İklimdeki olumsuz duruma ek olarak, deneme yerinin topraklarının da kumlu tınlı bir bünyeye sahip olması ve organik maddenin düşüklüğü göz önüne alındığında (Tablo 2.2.); iklim ve toprak özelliklerindeki olumsuzluklar destek sulamalara rağmen özellikle bitki büyümesini oldukça geriletmiş ve bitki boyunun kısalmasına neden olmuştur.

(31)

Tablo 2.1. Kayseri İli 2012 Yılı ve Uzun Yıllar Ortalamalarına Ait İklim Verileri SICAKLIK

(°C)

YAĞIŞ (mm)

Aylar 2012 Yılı Ort. Uzun Yıllar Ort. 2012 Yılı Ort. Uzun Yıllar Ort.

NİSAN 13.0 10.6 5.6 55.0

MAYIS 15.4 15.0 50.6 52.4

HAZİRAN 20.3 19.1 34.2 39.6

TEMMUZ 23.4 22.6 0.2 10.4

AĞUSTOS 21.9 22 0.0 5.4

Yapılan analizler sonucunda toprağın tekstürü “kumlu tınlı” olup, hafif alkali reaksiyonda ve tuzsuz sınıfına girmektedir. Toprağın elverişli fosfor miktarı ile toplam azot miktarı “az” ve organik madde miktarı ise “çok az” ve kireçli sınıfındadır [61, 62, 63].

Tablo 2.2. Denemenin Kurulduğu Yerin Toprak Özellikleri İncelenen Özellikler Değerleri

Kum (%) 62.63

Kil (%) 10.23

pH (1:2,5) 7.54

Organik Madde (%) 0.62

Kireç (%) 1.09

Elverişli Fosfor (kg P2O5/da) 6.42

Toplam N (%) 0.053

Yarayışlı Su (%) 6.87

Bu çalışmadaki materyallerin ekimi yapılan, Kayseri ili 2012 yılı ve uzun yıllar ortalamalarına ait iklim verileri ile denemenin kurulduğu yerin toprak analizleri tablolarına göre Kastamonu populasyanları ve tescilli çeşitlerin ekili olduğu Nisan 2012-Ağustos 2012 dönemleri için hem iklim şartları olumsuz yönde gitmiş olup hem de toprak yapısı yönünden olumsuzluklar olduğu görülmüştür.

(32)

Tablo 2.3. Bu Çalışmada Kullanılan Genotiplerin Kökenine Ait Mevcut Bilgiler Kayıt

Numarası Geldiği Yerin Adı Materyal Adı Tür Adı

1 -- Kastamonu Triticum dicoccum

2 -- Kastamonu Triticum

monococcum

5 Sipahiler köyü Kastamonu Triticum

monococcum

11 -- Kastamonu Triticum monococcum 12 -- Kastamonu Triticum monococcum 13 -- Kastamonu Triticum monococcum

15 Avşir köyü Kastamonu Triticum

monococcum

19 Sipahiler köyü Kastamonu Triticum

monococcum

24 Erciyes Üniversitesi Ziraat Fakültesi Tarla

Bitkileri Bölümü

Bezostaja 1 Triticum aestivum

Bitkileri Bölümü

Bayraktar–2000 Triticum aestivum

Bitkileri Bölümü

İkizce–96 Triticum aestivum

Bitkileri Bölümü

Kıraç 66 Triticum aestivum

Bitkileri Bölümü

Doğan kent Triticum aestivum

Bitkileri Bölümü

Kızıltan 91 Triticum durum

Bitkileri Bölümü

Y. popülasyon (MPPLSY)

Triticum durum

Bitkileri Bölümü

Çeşit 1252 Triticum durum

Bitkileri Bölümü

(33)

2.2. Yöntem

2.2.1. Bitki Materyalinin Ekimi, Bakımı ve Hasadı

Tarla gözlemleri için denemede kullanılacak olan popülasyonlar Erciyes Üniversitesi Seyrani Ziraat Fakültesi’nin Develi kampüsünün arazisine 02 Nisan 2012 tarihinde elle ekilmiştir. Her bir popülasyon 1 metre uzunluğundaki sıralara ikişerli sıralar halinde olacak şekilde sıra üzeri yaklaşık 15 cm’lik mesafeler ile 2 tekerrürlü olarak ekilmiştir. Her blokta tescilli çeşitler en az bir kez tekrarlanmıştır. Toplam 6 kg/da saf azotun yarısı ve fosforun tamamı ekimle birlikte verilmiş ve ekimden sonra çıkış ve çimlenmenin garanti altına alınması için genetik materyaller sulanmaya başlanmıştır. Azotun kalan yarısı ise elle başaklanma öncesi uygulanmış ve geniş yapraklı yabancı otların kontrolü için 2,4 D içerikli yabancı ot ilaçması sapa kalkma dönemi öncesi uygulanmıştır. 2012 yılı ilkbaharının oldukça kurak gitmesi ve toprağın kumlu tınlı ve organik madde düşüklüğü de göz önüne alınarak deneme materyali süt olum dönemine kadar haftada bir kez sulanmaya devam edilmiştir. Kuş ve fare zararına karşı genetik materyali korumak için önlemler alınmış ve genetik materyalin hasadı gözlem ve ölçümler yapıldıktan sonra 15–20 Temmuz 2012 tarihleri arasında elle hasat edilmiştir.

2.2.2. İncelenen Morfolojik ve Tarımsal Özellikler

Denemede her popülasyon içinden bitki boyu, başak uzunluğu, başaklanma süresi, olgunlaşma süresi, kulakçık rengi, tüylülük, mumsuluk, büyüme habitusu, kavuzluluk özellikleri popülasyonların genel görünümüne bakılarak incelenmiştir. Başaktaki dane sayısı, başak verimi, bitki verimi, 1000 dane ağırlığı, biyolojik verim ve hasat indeksi her popülasyondan tesadüfen seçilen 3 bitkinin ölçümleri yapıldıktan sonra bunların ortalaması alınarak hesaplanmıştır. Kalite özelliklerinden protein oranının belirlenmesi içinde her popülasyondan elde edilen danelerin toptan öğütüldükten sonra elde edilen örnekten iki tekerrürlü analiz yapıldıktan sonra elde edilen verilerin ortalaması olarak hesaplanmıştır.

(34)

Yapılan ölçüm, gözlem ve analizlerle ilişkin detaylı bilgiler aşağıda verilmiştir:

1. Bitki Boyu (cm): Her çeşitten hasat öncesi 10 adet bitki belirlenerek, ana sapın toprak yüzeyinden başağın ucuna kadar olan mesafe (kılçıklar hariç) cm cinsinden ölçülüp, ortalaması alınarak bulunmuştur.

2. Başak Uzunluğu (cm): Her çeşitten tesadüfi olarak alınan 10 adet ana sap başağının, başak alt boğumundan, en üstteki başakçık ucuna kadar olan (kılçıklar hariç) uzunluk ölçülerek cm olarak bulunmuştur.

3. Başaktaki Dane Sayısı (adet): Başak boyu ve uzunluğu alınan başaklar alınıp, elle harman edilerek ve daneler sayılarak bir başaktaki dane sayısı bulunmuştur.

4. Başak Verimi (g): Bir başaktan çıkan daneler, hassas terazide tartılarak başak verimi bulunmuştur.

5. Bitki Verimi (g): Bir bitkiden elde edilen tüm daneler hassas terazide tartılarak bitki verimi bulunmuştur.

6. Biyolojik Verim (g): Bir bitkinin toprak üstü tüm kısımları terazide tartılarak, biyolojik verim bulunmuştur.

7. Hasat İndeksi (%): Bir bitkiden elde edilen, dane veriminin biyolojik verime bölünüp 100 ile çarpılmasıyla hasat indeksi hesaplanmıştır.

8. Başaklanma Süresi (gün): Çimlenme ve çıkıştan sonra parseldeki bitkilerin yaklaşık % 75’inin başağını yaprak kınından çıkardığı tarih arasındaki gün sayılarak hesaplanmıştır.

9. Olgunlaşma Süresi (gün): Çimlenme ve çıkıştan sonra parseldeki bitkilerin yaklaşık % 90’ının hasat olgunluğuna geldiği tarih arasındaki gün sayılarak hesaplanmıştır.

(35)

10. Bin Dane Ağırlığı (g) : Harman edilmiş daneler 100’er adet olmak üzere 4 defa sayılarak tartılmış ve ortalamaları alındıktan sonra 10 ile çarpılarak 1000 dane ağırlığı g olarak belirlenmiştir.

11. Protein Oranı (%): Her popülasyon için 20 g kavuzu soyulmuş örnek NIR (Near-infrared) cihazında okunarak protein oranı saptanmıştır.

12. Kulakçık Rengi: Tüm genotiplerin vejetatif büyüme dönemi sırasında kulakçık renklerine bakılarak mor ve beyaz olarak belirlenmiştir.

13. Tüylülük: Tüm genotiplerin gövdesi incelenerek gövde tüylülüğüne bakılıp, gövdesinde tüy olanlar “tüylü” olarak, tüy olamayanlar “tüysüz” olarak belirlenmiştir.

14. Mumsuluk: Tüm genotiplerin gövdesi incelenerek gövdedeki mumsuluğuna bakılıp, gövdesinde mumsuluk olanlar “mumsu” olarak, mumsuluk olmayanlar “mumsuz” olarak belirlenmiştir.

15. Büyüme Habitusu: Bitkilerin gelişim durumlarına göre yatık, yarı yatık ve dik olarak belirlenmiştir.

16. Kavuzluluk: Hasattan sonra kavuzlu olan genotipler “kavuzlu”, olmayanlar ise “kavuzsuz” olarak belirlenmiştir.

2.2.2.1. Morfolojik ve Tarımsal Verilerin Analizi

Kavuzluluk, büyüme habitusu, mumsuluk, tüyülük ve kulakçık rengi gibi kalitatif özelliklerin kesikli veri olması göz önüne alınarak elde edilen veriler sadece % olarak sınıflandırılımıştır. Bunların dışında kalan tüm kantitatif veriler süreklilik içerdiğinden popülasyonlar arasındaki varyasyonu ortaya çıkarmak amacıyla her bir özellik için temel istatiksel unsurlardan olan ortalama, standart sapma ve varyasyon katsayısı (Şekil 2.1.) popülasyonlar ve çeşitler için ayrı ayrı hesaplanmıştır [64].

(36)

Şekil 2.1. Morfolojik Verilerin Analizinde Kullanılan Temel İstatistiksel Formüller

2.2.3. Genomik DNA İzolasyonu

Genetik materyalin DNA izolasyonunda Gülşen ve ark. [65], tarafından modifiye edilmiş Doyle ve Doyle [66] CTAB toplam DNA extraksiyon protokolü kullanılmıştır. DNA izolasyonu için materyaller iklim odasında toprakta çimlendirilip 30 mg genç bitki dokusu kullanılmıştır. Havan içerisinde 1 ml CTAB DNA izolasyon çözeltisi eklenerek bitki dokuları ezilmiş sonra 1.5 ml’lik eppendorf tüplere alınmıştır. Daha sonra tüpler 65 0_{C’de 60 dakika su banyosunda bekletilmiştir. Tüpler su banyosunda iken her 15} dakikada bir hafifçe çalkalanmştır. Su banyosundan çıkarılan tüpler, oda sıcaklığında soğumaya bırakılmş (yaklaşık 10-15 dk) ve daha sonra bu tüplere 0.4 ml kloroform:izoamil alkol karışımı (24:1) eklenmiş ve yine elde nazikçe 10 dk çalkalanmştır. Daha sonra tüpler 7 dk süre ile 14000 rpm’de oda sıcaklığında santrifüj yapılmştır. Santrifüj yapılan tüplerin üst fazları alınarak 1.5 ml’lik yeni eppendorf tüplere aktarılmştır. Bu tüplerin üzerine 500 µl soğuk isopropanol eklenmiş ve tek faz haline getirilecek şekilde karıştırılmıştır. Daha sonra 3 dk süre ile 14000 rpm’de santrifüj yapılmştır. DNA’nin çökeltilmesi sağlanmştır. DNA dipte kalacak şekilde tüm sıvı dökülmüş ve DNA örneği önce içerisinde 10 mM amonyum asetat bulunan % 76’lik etil alkol ile yıkanmş ve +4’de örnekler bir gece boyunca bekletilmiştir. Daha sonra 3 dk süre ile 14000 rpm’de santrifüj yapılmştır. Son yıkamanın ardından sıvı kısım uzaklaştırılarak DNA nın kuruması beklenmiştir. Elde edilen DNA çökeltisi 300 µl TE (10 mM Tris, 0.1 mM EDTA, pH 7.4) ilave edilmiş, çökelti tamamen çözünene kadar oda sıcaklığında gece boyunca bekletilmiştir.

(37)

2.2.3.1. DNA Yoğunluğunun Belirlenmesi

Herhangi bir DNA moleküler markör tekniği ile çalışırken bitki örneklerinden elde edilen DNA’nın kalitesi ve yoğunluğunun bilinmesi çok önemlidir. Bundan dolayı DNA yoğunluğunun çok iyi ayarlanması ve kalitesinin iyi olması gerekmektedir. DNA yoğunluğunun saptanması için BioSpec-nono Shimadzu Biotech spectrofotometre cihazında her bir DNA örneğinin DNA kalitesi ve saflığı hakkında bilgi veren 230 ve 280 nm dalga boylarındaki absorbans oranı yaklaşık olarak 1.8 nm olması beklenir [67]. A230 ve A280 değerleri ölçüldükten sonra örneklerin DNA yoğunluğuna bağlı olarak her bir örnek için 20 ng/µl olacak şekilde örnekler sulandırılarak çalışma solüsyonu hazırlanmıştır. Stok DNA örnekleri çalışma esnasında kullanılıncaya kadar -20 0C de saklanmıştır.

2.2.4. ISSR Analizleri

ISSR Polimeraz Zincir Reaksiyonu (PZR) bileşenleri 7.8 µl dH2O, 1 µl primer (0.6 mM), 1.5 µl 10X PZR buffer (750 mM Tris-HCI pH 8.8, 200 mM (NH4)2SO4 , % 0.1

(v/v) Tween–20), 1.5 µl MgCl2 (25 mM), 1.5 µl dNTP (2 mM her bir dNTP (dATP,

dGTP, dCTP ve dTTP)), 0.2 µl Taq DNA polymerase (5 U/µl) ve 1.5 µl DNA (20 ng/µl) olmak üzere toplam hacim 15 µl olacak şekilde hazırlanmıştır.

Hazırlanan bu bileşenler ile 23 Kastamonu populasyonları ile 9 tescilli çeşitler üzerinde DNA’ları çoğalmak için ısı döngüsü sağlayan cihazda (thermal cycler), Tablo 2.5’de ki döngüler izlenerek PZR ürünleri elde edilmiştir.

Çalışmada ilk önce 54 adet ISSR primeri (Tablo 2.4.) seçilen 8 farklı buğday genotipinde tekrarlanarak denenmiş ve bu primerler arasından en iyi amplifikasyonu ve polimorfizmi veren primerler belirlenerek 32 buğday genotipinde tanımlama yapmak için seçilmiştir.

(38)

Tablo 2.4. Analizlerde Kullanılan ISSR Primerleri Çalışmada

Kullanılan Numara

Primer Adı Primer

Sekansları 5’--3’

Amplifikasyon Polimorfizm

1 UBC-807 (AG)8T Var Var

2 UBC-810 (GA)8T Var Var

3 UBC-811 (GA)8C Var Var

4 UBC-812 (GA)8A Var Var

5 UBC-813 (CT)8T Var Var

6 UBC-814 (CT)8A Var Var

7 UBC–815 (CT)8G Var Var

8 UBC–818 (CA)8G Var Var

9 UBC-819 (GT)8A Var Var

10 UBC-820 (GT)8T Var Var

11 UBC-821 (GT)8T Var Var

12 UBC-822 (TC)8A Var Var

13 UBC-823 (TC)8C Var Var

14 UBC-824 (TC)8G Var Var

15 UBC-825 (AC)8T Var Var

16 UBC-826 (AC)8C Var Var

17 UBC-828 (TG)8A Var Var

18 UBC-830 (TG)8G Var Var

19 UBC-834 (AG)8YT Var Var

20 UBC-835 (AG)8YC Var Var

(39)

22 UBC-840 (GA)8YT Var Var

23 UBC-841 (GA)8YC Var Yok

24 UBC-842 (GA)8YG Var Yok

25 UBC-843 (CT)8RA Var Var

26 UBC-844 (CT)8RC Var Var

27 UBC-845 (CT)8RG Var Var

28 UBC-846 (CA)8RT Var Var

29 UBC-847 (CA)8RC Yok Yok

30 UBC-848 (CA)8RG Var Var

31 UBC-850 (GT)8YC Var Var

32 UBC-851 (GT)8YG Var Var

33 UBC-852 (CT)8RA Var Var

34 UBC-853 (CT)8RT Var Var

35 UBC-855 (AC)8YT Var Var

36 UBC-856 (AC)8YA Var Var

37 UBC-857 (AC)8YG Var Var

38 UBC-858 (TG)8RT Var Yok

39 UBC-859 (TG)8RC Var Var

40 UBC-860 (TG)8RA Var Var

41 UBC-866 (CT)8C Var Yok

42 UBC-887 DVD(TC)8 Var Var

43 UBC-888 BDB(CA)8 Var Yok

44 UBC-889 DBD(AC)8 Var Yok

(40)

46 UBC-891 HVH(TG)7 Var Yok

47 UBC-835 (AG)8YC Var Var

48 UBC-844 (CT)8RC Var Var

49 ISSR16 (TCC)5RY Var Var

50 UBC-834 (AG)8YT Var Var

51 ISSR22 HVH(CA)7T Var Var

52 ISSR28 A(GAAA)4G Var Var

53 UBC-849 (GT)8YA Var Var

54 ISSR47 (AG)8Y Var Var

2.2.5. PZR Ürünlerinin Büyüklüklerine Göre Ayrılması

Etidium bromid içeren 1X TBE Tampon içerisinde % 2’lik agaroz jel üzerinde PZR ürünleri 120 volt elektrik akımında 3 saat süreyle büyüklüklerine göre ayrılmış, ardından UV ışın altında jel görüntüleme sistemi ile fotoğrafları çekilmiştir. PZR ürünlerinin büyüklüklerini tahmin etmek için ise Genoks 100–1000 bç DNA Markır (M) kullanılmıştır. Bantlardan sadece güvenilir olanları değerlendirmeye alınmıştır.

2.2.6. Moleküler Verilerin Analizi

Çalışmada kullanılan ISSR primerlerinin polimorfizm oranları, primerlerden elde edilen toplam polimorfik bant sayısının, toplam bant sayısına bölünerek 100 ile çarpılması sonucu aşağıda belirtilen formül ile bulunmuştur:

Polimorfizm Oranı (%) = (Polimorfik bant sayısı / Toplam bant sayısı) x 100

Çalışmada kullanılan PZR döngüsü (Tablo 2.5.) 54 ISSR primeri için aynı şekilde kullanılmış olup 14 ISSR primerinde silik olmayan bantlar vermiştir.

(41)

Tablo 2.5. Analizlerde Kulanılan ISSR Primerleri İçin PZR Döngüleri PZR Aşamaları Sıcaklık (oC) Süre (sn) PZR Döngü Sayısı Ön Bozulma (Denatürasyon) 95 240 1 Bozulma (Denatürasyon) 94 40 6 Yapışma (Annealing) 37 60 6 Uzama (Extension) 72 120 6 Bozulma (Denatürasyon) 94 45 40 Yapışma (Annealing) 53 60 40 Uzama (Extension) 72 420 40 Son Uzama 72 300 1

DNA bantlarının var olması durumunda “1” ve yokluğu durumunda ise “0” olarak kaydedilerek bir veri dosyası hazırlanmıştır. PZR başarısızlığı veya herhangi bir deneme hatası nedeniyle olmadığı düşünülen bantlar ise kayıp veri “9” olarak değerlendirilmiştir. Elde edilen DNA verileri NTSYS (Numerical Taxonomy Multivariate Analysis System, NTSYS-pc version 2.1, Exeter Software, Setauket, N.Y., USA) paket programı kullanılarak analiz edilmiştir [68]. Bu program kullanılarak, öncelikle popülasyonlar arasındaki benzerlik indeksleri hesaplanmış [69] ve benzerlik indeksinden yararlanılarak UPGMA metodu ile dendrogram oluşturulmuştur.

DİCE benzerlik matriksine dayalı UPGMA dendrogramı ve varyans-kovaryans matriksine dayalı Temel Bileşenler Analizi (PCA) yapılmıştır. DİCE benzerlik katsayısına dayalı matriks UPGMA metoduna göre bireyler arasındaki genetik ilişkiyi belirlemek için SIMQUAL modülünde 2a / (2a + b + c) formülüne göre (a: her çift arasındaki karşılaştırılan bant varlığının toplamı; b: toplam bant sayısının ilk birey için