134
1Dokuz Eylül Üniversitesi T›p Fakültesi Kan Merkezi ‹zmir, 2Dokuz Eylül Üniversitesi Sa¤l›k Bilimleri Enstitüsü Mikrobiyoloji ve Klinik Mikrobiyoloji Anabilim Dal› ‹zmir, 3Dokuz Eylül Üniversitesi T›p Fakültesi Mikrobiyoloji ve Klinik Mikrobiyoloji Anabilim Dal› ‹zmir
Yavuz Do¤an1, Vahide Bayrakal2, ‹. Hakk› Bahar3, Hüseyin Bask›n3
‹letiflim / Correspondence: Hüseyin Bask›n Adres / Address: Dokuz Eylül Üniversitesi, T›p Fakültesi, Mikrobiyoloji ve Klinik Mikrobiyoloji Anabilim Dal›, ‹nciralt›, 35340, ‹zmir Tel: 0232 412 4511 Gsm: 0 533 334 3166 E-mail: huseyin.baskin@deu.edu.tr
Relation of quorum sensing and biofilm formation in Pseudomonas
aeruginosa strains in presence of gentamisin
ÖZET
Pseudomonas aeruginosa, quorum sensing [(ço¤unlu¤u alg›lama, ( ÇA )] sistemlerinin çözümü için üzerinde en çok çal›fl›lan bak-terilerden biridir. Bu çal›flmada, yara yerinden ayr›flt›r›lm›fl gentamisine orta duyarl› ( GO ) ve duyarl› ( GD ) iki klinik P. aeru-ginosa suflu ile gentamisine orta duyarl› standart ATCC 27853 ( GOS ) suflunun, gentamisinin en düflük bask›lay›c› yo¤unlukla-r›nda biyofilm ve ço¤unlu¤u alg›lama iliflkileri de¤erlendirilmifltir.
‹zole edilen sufllar›n mikrodilusyon yöntemi ile Clinical Laboratory Standards Institute (CLSI) standartlar›na uygun olarak gen-tamisine duyarl›l›klar› incelenmifl; orta duyarl› klinik sufl ve standart ATCC 27853 suflunda antibiyoti¤in en düflük bask›lay›c› yo-¤unlu¤u (M‹K) 4 μg/mL olarak belirlenirken, duyarl› sufl için M‹K de¤eri 0, 25 μg/mL olarak bulunmufltur.
Kuyucuktan yay›l›m ve mikro açillenmifl homoserin lakton (AHL) yöntemleri ile ayr› ayr› de¤erlendirilen ÇA yan›tlar›nda ise Choromobacterium violaceum ile belirlenen k›sa zincirli AHL sal›n›m› (LasI/R) GD suflunda gözlenmezken, GOS ve GO sufllar›n-da saptanm›flt›r. Bununla birlikte Agrobacterium tumefaciens ile tespit edilen uzun zincirli AHL sal›n›m› (RhlI/R) GOS suflunsufllar›n-da gözlenmezken GO ve GD sufllar›nda sal›n›m görülmüfltür. Sufllar aras›ndaki ÇA yan›t farkl›l›klar› sufllar›n farkl› fenotipte olabi-lece¤ini, iki ayr› ÇA sisteminin gentamisine karfl› devreye girebilece¤ini ve bu özelli¤in antibiyotik gelifltirme çal›flmalar›nda göz ard› edilmemesi gerekti¤ini düflündürmüfltür.
Anahtar kelimeler:Pseudomonas aeruginosa, biyofilm, quorum sensing, ço¤unlu¤u alg›lama SUMMARY
Pseudomonas aeruginosa is one of the most studied bacteria in examining quorum sensing (QS) systems. In this study, gentami-cin intermediate standard ATCC 27853 (GOS) strain and two clinical P. aeruginosa strains (one was susceptible and the other was intermediate; GD, GO) were compared according to biofilm and QS responses in minimum inhibitory concentrations (MIC) of gentamicin.
Gentamicin susceptibilities of these strains were studied according to Clinical Laboratory Standards Institute (CLSI) microdilu-tion technique. MICs of gentamicin for intermediate and standard ATCC 27853 strains were found to be 4 μg / mL and for sus-ceptible strain 0.25 μg / mL.
QS responses were evaluted by well diffusion and micro N- acyl-homoserine lactone (AHL) methods; short chain AHL(LasI/R) release that was signed by Choromobacteriun violaceum was not shown in gentamicin susceptible strain. But it was shown in gen-tamicin susceptible standard strain and intermediate clinical strains. Long chain AHL (RhlI/R) release by Agrobacterium tume-faciens was not demonstrated in GOS but was shown in GO and GD strains. Different QS responses were responsible in all stra-ins isolated from wound and in standard strain isolated from blood culture in all MIC and sub- MIC values of gentamicin. As a result of, we may suggest that QS responses may differ phenotypically, instead of being isolated from similar infection sites. In the future, phenotypic QS properties of Pseudomonas may take an important part in antibiotic development studies. Key words: Pseudomonas aeruginosa, quorum sensing, biofilm
Gentamisin varl›¤›nda Pseudomonas aeruginosa
sufllar›nda biyofilm oluflumu ve quorum sensing iliflkisi (*)
Türk Mikrobiyol Cem Derg (2007) 37 (3) : 134-137
© 1993 Türk Mikrobiyoloji Cemiyeti / Turkish Microbiological Society ISSN 0258-2171
135 G‹R‹fi
Makrofajlar›n ve di¤er ba¤›fl›kl›k sistemi hücrele-rinin bakterilere ulaflmas›n› engelleyen, mukoid bir yap› olan biyofilmin, bakterinin yap›flmas›nda ve antibiyotiklere direncinde önemli rolü oldu¤u bilinmektedir. Biyofilm yap›n›n antibiyotik geçi-fline engel olarak antibiyotik direncine yard›mc› oldu¤u düflünülmektedir Bununla birlikte, antibi-yotik uygulamalar›n›n da biyofilm oluflumunu te-tikledi¤ini gösteren çal›flmalar vard›r. Bu çal›flma-larda, en düflük bask›lay›c› yo¤unluklarda (Mini-mum inhibitör konsantrasyon: M‹K) kullan›lan antibiyotiklerin P. aeruginosa' da aminoglikozid-lere yan›t› düzenleyen gen olan “arr” geninin, biyofilm yap›m›n›n uyar›m›nda gerekli oldu¤u ve ayr›ca biyofilme özgü aminoglikozid direncinde yer ald›¤› gösterilmifltir (1,2).
Bakterilerin biyofilm oluflumunu, hücreden hücre-ye iletiflim sinyalleri ile kontrol etti¤i bilinmek-tedir. Davies ve ark (1) P.aeruginosa’da biyofilm geliflimi için hücreler aras› iletiflimin gerekli oldu¤unu göstermifltir. Bakteriler iletiflim sinyal-leri ile bulunduklar› yerdeki yo¤unluklar›n› belir-leyip de¤iflen yo¤unlu¤a göre davran›fllar›n› de-¤ifltirirler ki, bu ço¤unlu¤u alg›lama (quorum sensing, ÇA) olarak adland›r›lmaktad›r (3). Ço¤unlu¤u alg›lama kavram› ilk kez deniz hay-vanlar›n›n ›fl›k organlar›na yerleflerek simbiyoz yaflayan bir deniz bakterisi olan Vibrio fischeri' de tan›mlanm›flt›r. V. fischeri deniz hayvan›n›n ›fl›k organ›nda yüksek yo¤unluklara kadar üreye-bilir. Belli bir eflik de¤er üzerindeki yo¤unlu¤a kadar ürediklerinde, lux CDABEGH genlerince kodlanan lusiferaz enzimini üretirler ve bunun so-nucunda bir ›fl›ma gerçekleflir. Bu enzimin etkin-li¤i düflük yo¤unluklarda bask›lan›r (4). Gram ne-gatif bakterilerde de ço¤unlu¤u alg›lama, V. fisc-heri'de ilk defa aç›klanan LuxIR dizgesi arac›l›-¤›yla olabilir. LuxIR dizgesi, LuxI proteinini kul-lanarak “kendi kendini uyar›c›” (AI) ve buna ba¤lanarak gen sunumunu düzenleyen LuxR' yi birlefltirir (5). Bakteri taraf›nda üretilen “kendi kendini uyar›c›” türe özgül olmakla birlikte
na-diren di¤er türlerin LuxR tipi düzenleyicileri ile birbirlerini etkiler (6).
Gram negatif bakterilerde ÇA sisteminde açillenmifl homoserin lakton (AHL) oluflumu ile hücre-hücre iletiflimi sa¤lan›r. F›rsatç› patojen P. aeruginosa' da LasI/R ve RhlI/R olmak üzere iki ÇA sistemi vard›r. LasI/ R sistemi N-(3-oxo-dodecanoly)-L-homoserine lactone (3OC12-HSL) sinyal molekülü ile RhlI/R sistemi ise N-butryl-L-homoserine lactone (C4-HSL) sinyal molekülü ile çal›fl›r. 3OC12-HSL (k›sa zincirli) AHL mo-lekülü varl›¤›, Chromobacterium violaceum (CV026)’da gösterilirken, C4-HSL (uzun zincirli) AHL molekülü varl›¤› da Agrobacterium tumefa-ciens (A136)’da gösterilebilir (reporter strain: ta-n›mlay›c› sufl) (7).
Ço¤unlu¤u alg›lama sisteminde, baz› genler an-cak belli bir iflaretin yo¤unlu¤u eflik de¤eri geç-ti¤inde etkinleflmeye (ekspresyon) bafllar. Buradan yola ç›karak P. aeruginosa' da ço¤unlu¤u alg›la-ma sinyalleri yeni antibakteriyel alg›la-maddelerin he-defi niteli¤inde olabilirler (8).
Bu çal›flmada, yara yerinden ayr›flt›r›lm›fl GO ve GD iki klinik sufllar› ile GOS suflunun biyofilm ve ço¤unlu¤u alg›lama yan›tlar› gentamisinin en düflük bask›lay›c› yo¤unluklar›nda birlikte de¤er-lendirilmifltir.
GEREÇ VE YÖNTEM
Yara yerinden ayr›flt›r›lm›fl P. aeruginosa GD ve GO klinik sufllar› ile P. aeruginosa ATCC 27853 GOS suflu çal›flmada kullan›lm›flt›r. Her sufl için gentamisinin M‹K de¤erleri, katyon ilaveli MHB' da mikrodilusyon yöntemi ile gösterilmifltir. (9, 10).
AHL yöntemi için farkl› kaynaklardan elde edi-len bilgiler yo¤rularak, bir yöntem gelifltirilmifl-tir: ELISA mikroplaklar›n›n her kuyucu¤una eflit miktarlarda Luria Bertani agar (LBA) da¤›t›l›p oda s›cakl›¤›nda 2 saat kurumaya b›rak›lm›flt›r. Luria Bertani Broth (LBB) 'da 30°C' de 18 saat inkube edilip McFarland 0.5’e eflit bulan›kta ayar-lanan Chromobacterium violaceum ve Agrobacteri-Yavuz Do¤an, Vahide Bayrakal, ‹. Hakk› Bahar, Hüseyin Bask›n
136 um tumefaciens kültürlerinden her kuyucu¤a eflit
miktarlarda da¤›t›lm›flt›r. Oda s›cakl›¤›nda 30 daki-ka bekletildikten sonra antibiyotiklerin belirlenen 1/2, 1/4, 1/8, 1/16, 1/32, 1/64 x M‹K de¤erleri ile karfl›laflm›fl GOS, GD ve GO sufllar›ndan eflit mik-tarlarda da¤›t›larak 37°C' de 48 saat bekletilmifltir. Kuyucuklarda makroskobik olarak “yeflil-mavi” renk görüldü¤ünde sonuç pozitif olarak de¤erlendi-rilmifltir (11).
Kuyucuktan yay›l›m (diffusion) yönteminde, ön-ceden ›s›t›lm›fl Luria Bertani Agar (LBA) içeren iki bölümlü Petri kutular›n›n bir taraf›na LBB' da 30°C' de 18 saat bekletilip, McFarland 0.5' e eflit bulan›kta ayarlanan C. violaceum, di¤er taraf›na da ayn› flekilde üretilip haz›rlanan A. tumefaciens bakterilerinin süspansiyonlar›ndan al›narak yayma ekim yap›lm›flt›r. Her iki bölüme de 5 mm ça-p›nda çukurlar aç›lm›flt›r. Her bir çukura antibi-yotiklerin belirlenen 1/2, 1/4, 1/8, 1/16, 1/32, 1/64 x M‹K de¤erleri ile karfl›laflm›fl ve kontrol olarak da antibiyotik ile karfl›laflmam›fl GOS, GD ve GO sufllar›ndan da¤›t›larak 37°C' de 48 saat bekletilmifltir. AHL varl›¤›, mikro AHL' de ya-p›ld›¤› gibi, makroskobik olarak de¤erlendirilmifl-tir (12).
Daha sonra da kristal viyole boyama yöntemi ile biyofilm oluflumlar› yine ayn› ELISA plaklar›n-da, iki kat› absorbanslar pozitif kabul edilerek, 540 nm' de spektrofotometrik olarak de¤erlendi-rilmifltir (13).
Her deney üç kez ve her örnek de üçer kez ol-mak üzere yinelenmifltir.
BULGULAR
‹ncelenen sufllarda gentamisinin en düflük bask›-lay›c› yo¤unluklar›; GO ve GOS sufllar›nda 4 μg / mL, GD suflunda ise 0,25 μg / mL ola-rak belirlenmifltir.
Biyofilm oluflumunun her üç suflta da M‹K de-¤erinden itibaren sub-M‹K de¤erlerinde bafllad›¤› saptanm›flt›r. C. violaceum içeren mikro AHL plaklar›nda GD suflunda AHL sal›n›m› gözlen-mezken GOS ve GO sufllar›nda AHL sal›n›m›
belirlenmifltir. A. tumefaciens içeren mikro AHL plaklar›nda ise, GOS suflunda AHL sal›n›m› sap-tanmazken, GO ve GD sufllar›nda AHL sal›n›m› görülmüfltür (Tablo 1).
Tablo 1. Biyofilm- ço¤unlu¤u alg›lama iliflkilerinin de¤erlendirilmesi M‹K %50 X M‹K % 25 M‹K %12.5 M‹K % 6.2 M‹K % 3.1 M‹K Kontrol CV026 A136 M D M D B‹YOF‹LM
AHL de¤erlendirmelerinde, yay›l›m yöntemi ile mikro AHL yöntemlerinin sonuçlar› paralel bu-lunmufltur. Mikro AHL daha az malzeme harcan-mas› nedeni ile tercih edilebilir.
TARTIfiMA
P. aeruginosa f›rsatç› patojen bir bakteri olarak hastane infeksiyonlar›n›n önemli etkenlerindendir. P. aeruginosa virulans faktörlerinin sunumunu ço-¤unlu¤u alg›lama (ÇA) olarak adland›r›lan hücre yo¤unlu¤unu düzenleyen sinyal sistemleri ile de kontrol edebilir. Virulans özelliklerinden olan bi-yofilm, bakteri yüzeyinde glikokaliks özellikte, mukoid bir yap›d›r ve bakteriyi antibakteriyel ajanlar ile konak ba¤›fl›kl›k sisteminden korur. Böylelikle kronik infeksiyonlara zemin haz›rlaya-bilir. Shin ve ark (14) biyofilm-ÇA iliflkisini tan›mlad›klar› çal›flmalar›nda, P. aeruginosa do¤al sufl (PA01) ile “ço¤unlu¤u alg›lamaktan yoksun” mutantlar›n biyofilm oluflturma yönünden karfl›laflt›r›ld›klar›nda hemen bafllang›çta biyofilm yo¤unlu¤u yönünden aralar›nda farkl›l›k yokken, ÇA özelli¤ini tafl›yan do¤al suflla biyofilm oluflumunun mantarlardan daha h›zl› ilerledi¤ini göstermifltir.
Çal›flmam›zda yay›l›m ve mikro AHL yöntemi ile de¤erlendirilen AHL oluflumu sonuçlar›na
bak›l-1: GOS; 2: GO; 3: GD; CV026: k›sa zincirli AHL; A136: uzun zincirli AHL; M: Mikro AHL; D: AHL Yay›l›m; Kontrol: Antibiyotik uygulanmayan bakterilerden al›nan sonuçlar Gentamisin varl›¤›nda Pseudomonas aeruginosa sufllar›nda biyofilm oluflumu ve quorum sensing iliflkisi
1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + - + + - + + - + + - + + - + + - + + + - + + - + + - + + - + + - + + - + + + + + - + + - + + - + + - + + - + + - + + + + +
137
d›¤›nda: 1. Kandan izole edildi¤i bilinen GOS suflunda (gentamisin orta duyarl›) LasI/ R siste-minin, 2. Yara yerinden izole GD suflunda (gen-tamisin duyarl›) RhlI/ R sisteminin, 3. Yara ye-rinden izole GO suflunda (gentamisin orta duyar-l›) RhlI/ R ve LasI/ R sistemlerinin, M‹K de¤er-lerinden bafllamak üzere, antibiyoti¤in ileri sulan-d›r›mlar›nda (sub- M‹K) da etkin oldu¤u saptan-m›flt›r. Bu sonuçlar, ayn› infeksiyon bölgesinden izole edilse de, gentamisine karfl› duyarl›l›k du-rumlar›na bak›lmadan, P. aeruginosa sufllar›nda gentamisinle sa¤alt›m›n doz aral›klar›nda (M‹K ve sub- M‹K yo¤unluklar) farkl› ÇA sistemleri-nin, M‹K de¤erlerinden itibaren etkin hale gele-bilece¤ini ve son suland›r›ma - bir sonraki anti-biyotik dozuna - kadar da bu etkinliklerini sür-dürebileceklerini göstermektedir. Çal›flmada kul-land›¤›m›z sufllar farkl› ÇA sistemlerini kullansa-lar da, biyofilm oluflumu M‹K de¤erlerinden iti-baren ÇA yan›tlar› ile paralel bafllam›flt›r. Bu so-nuç da biyofilm oluflumunun, P. aeruginosa' da iki ÇA sisteminden biri ve/ veya ikisi ile düzen-lendi¤ini göstermektedir.
P. aeruginosa sufllar›nda karfl›laflt›¤›m›z farkl› ÇA sistemlerinin, sufllar›n fenotipik farkl›l›klar›ndan kaynakland›¤›n›, gelecekte yürütülecek antibakte-riyel çal›flmalar›nda da bu özelliklerin göz önün-de bulundurulmas› gerekti¤ini düflünmekteyiz. KAYNAKLAR
1. Davies DG, Parsek MR, Pearson JP, Iglewski BH, Cos-terton JW, Greenberg EP. The involvement of the cell-to cell signals in the development of a biofilm. Science 1998;280 (5361):295- 298.
2. Hoffman LR, D'Argenio DA, MacCoss MJ, Zhang Z, Jo-nes RA, Miller SI. Aminoglycoside antibiotics induce bacte-rial biofilm formation. Nature 2005;436:1171-1175.
3. Dong YH, Zhang LH. Quorum sensing and quorum qu-enching enzymes. J Microbiol 2005; 43: 101.
4. Kaper JB, Sperandio V. Bacterial cell- to- cell signalling in the gastrointestinal tract. Infect Immun 2005; 73: 3197. 5. Fugua C, Parsek RM, Greenberg PE. Regulation of gene expression by cell- to-cell communication: acyl - homoserine lactone quorum sensing. Annu Rev Genet 2001; 35: 439. 6. Lynch MJ, Swift S, Kirke DF, Keevil CW, Dodd CE, Williams P. The regulation of biofilm development by
quo-rum sensing in Aeromonas hydrophila. Environ Microbiol 2002;4:18 -28.
7. Pesci EC, Milbanc JBJ, Pearson JP, Mcnight S, Kende AS, Greenberg EP, Iglewski BH. Quiolone signaling in the cell-to cell communication system of Pseudomonas aerugino-sa. Biochem 1999;96: 11229 -11234.
8. Bask›n H. Mikroorganizmalarda kimyasal temelli sosyomik-robiyoloji: Quorum sensing (Ço¤unlu¤u alg›lama). Türk Mik-robiyol Cem Derg 2006;36:111- 115.
9. Bask›n H, Do¤an Y, Bahar ‹H, Yulu¤ N. Effect of sub-minimal inhibitory concentrations of threee fluroquinolones on adherence of uropathogenic Escherichia coli strains. Int J An-timicrob Agents 2002; 19: 79 -82.
10. National Committee for Clinical Laboratory Standards (Çeviri editörü Gür: D): Aerop üreyen bakteriler için dilüs-yon yöntemi ile antimikrobik duyarl›l›k testleri; Onaylanm›fl standart-alt›nc› bask›, M7-A6, Cilt 23, Say› 2, Ocak 2003. 11. Vivas J, Razquin BE, Lopez-Fierro P, Naharro G, Vil-lena A. Correlation between production of acyl homoserine lactones and proteases in an Aeromonas hydrophila aro A li-ve vaccine. Vet Microbiol 2004; 101:167 -76.
12. Zhu H, Thuruthyil SJ, Willcox MD. Production of N-acyl homoserine lactones by Gram-negative bacteria isolated from contact lens wearers. Clin Experiment Ophthalmol 2001;29:150- 152.
13. Kanamaru S, Kurazono H, Terai A, Monden K, Kumon H, mizunoe Y, Ogava O, Yamamoto S. Increased biofilm formation in Escherichia coli isolated from acute prostatitis. Int J Antimicrob Agents 2006; 28: 21- 25.
14. Shih PC, Huang CT. Effect of quorum-sensing deficiency on Pseudomonas aeruginosa biyofilm formation and antibiotic resistance. J Antimicrob Chemother 2002; 49: 309-314. Yavuz Do¤an, Vahide Bayrakal, ‹. Hakk› Bahar, Hüseyin Bask›n
